HMGA1對(duì)肝細(xì)胞癌的增殖、遷移和細(xì)胞周期的作用影響

應(yīng)函妤, 邢家恒, 孫江川, 錢穎, 胡林峰, 田男

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310053)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，死亡率在惡性腫瘤中排名第三[1],其惡性程度高，發(fā)病隱匿，大部分患者確診時(shí)已處于中晚期[2]。目前HCC的治療以手術(shù)切除輔助肝動(dòng)脈化療栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)為主[3]，而患者極易產(chǎn)生化療耐藥性。另外，在肝癌晚期形成的腫瘤微環(huán)境中，免疫抑制細(xì)胞因子系統(tǒng)地?cái)U(kuò)增使得T細(xì)胞的抗腫瘤活性降低，發(fā)生免疫逃逸，免疫治療不能完全解決腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等問(wèn)題，臨床效果欠佳[4]。因此，挖掘新的HCC預(yù)后分子標(biāo)志物、挖掘新型防治靶點(diǎn)有利于肝癌治療新方法的建立。

高遷移率族蛋白組A1(high mobility group AT-hook 1，HMGA1)是hook(HMGA)蛋白家族高遷移率組的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)結(jié)合雙鏈DNA(double-stranded，dsDNA)中富含AT區(qū)域的小凹槽在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[5]。HMGA1與雙鏈DNA的結(jié)合常改變DNA結(jié)構(gòu)以促進(jìn)其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，并協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組裝以增強(qiáng)或抑制轉(zhuǎn)錄[6-7]從而參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、衰老和轉(zhuǎn)移[8-9]。有研究報(bào)道，HMGA1的過(guò)度表達(dá)增加了乳腺癌細(xì)胞S期的占比[10]，在宮頸癌中加速G1/S的轉(zhuǎn)變[11]。上述研究均提示，在部分腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中HMGA1發(fā)揮了一定的作用。

目前，關(guān)于HCC和HMGA1之間的研究尚未清楚。本研究在肝癌細(xì)胞中敲低HMGA1表達(dá)后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR，蛋白質(zhì)印跡、MTT、克隆形成，transwell以及流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)，研究小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)敲低HMGA1表達(dá)量對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲能力的影響，為研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人肝癌細(xì)胞系HepG2、Hep3B和SNU-182和人肝細(xì)胞系HL-7702購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)，使用達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%新生牛血清、質(zhì)量濃度分別為100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。siHMGA1、siRNA對(duì)照、miRNA模擬物、抑制劑、sh-HMGA1及其陰性對(duì)照由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，待其匯合度至30%～50%時(shí)按照說(shuō)明書(shū)的指導(dǎo)采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.1.2 數(shù)據(jù)收集及基因表達(dá)分析

70例肝細(xì)胞癌(HCC)、13例膽管癌(cholangiocarcinoma, CC)和7例混合型HCC和CC的基因表達(dá)譜來(lái)自GSE15765數(shù)據(jù)集(GEO，RRID:SCR_005012，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。肝癌組織和鄰近肝組織樣本中獲得的基因表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA-LIHC(RRID: SCR_003193, http://cancergenome.nih.gov/)。根據(jù)TCGA-LIHC數(shù)據(jù)比較HCC和鄰近組織樣本中HMGA1的相對(duì)表達(dá)水平。癌癥非編碼RNAs地圖集(The Atlas of Noncoding RNAs in Cancer，TANRIC)(http://ibl.mdanderson.org/tanric/_design/basic/index.html)用于評(píng)估TCGA數(shù)據(jù)集中不同級(jí)別肝癌組織中HMGA1mRNA水平[12]。R2: Genomics Analysis and Visualization Platform (http://r2.amc.nl)用于評(píng)估TCGA-LIHC中HCC患者的總體生存率。

1.1.3 基因富集與功能注釋評(píng)價(jià)

注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)用于進(jìn)行相關(guān)路徑分析[13]與GO分析對(duì)預(yù)測(cè)基因進(jìn)行功能注釋[14]；還通過(guò)KEGG法對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行功能注釋。選擇在TCGA-LIHC和GSE15765數(shù)據(jù)庫(kù)都與HMGA1具有統(tǒng)計(jì)顯著正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因進(jìn)行GO和通路分析。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR

使用TRIzol試劑分離提取總RNA，并依據(jù)使用HiFi MMLV cDNA試劑盒合成cDNA，加入U(xiǎn)ltraSYBR混合物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。引物：HMGA1正向：5′-TCCAAGAGAGCATCCGCATT-3′，反向：5′-AGAGAGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGA-3′；β-actin正向：5′-GGCACCACCTTCTACAT-3′，反向：5′-GTGGTGGAAGCTGCTAGCC-3′。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡

使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液沸水浴5 min變性。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)室溫封閉2 h后置于4 ℃一抗孵育過(guò)夜。次日取出，經(jīng)TBST洗滌3次后室溫?fù)u床孵育二抗2 h，再用TBST洗滌3次。最后，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測(cè)試劑盒通過(guò)顯影儀檢測(cè)信號(hào)。

1.2.3 MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)

以每孔5.00×103細(xì)胞接種到96孔板中后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液(質(zhì)量濃度為5 g/L)。37 ℃避光培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩使紫色結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm下檢測(cè)吸光度。以每孔500細(xì)胞接種于6孔板中，14 d后終止培養(yǎng)，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定30 min，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%結(jié)晶紫染色30 min，洗去多余的染液后置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)

以每孔1.00×104細(xì)胞接種在無(wú)血清DMEM的上室，下室加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%血清的DMEM。培養(yǎng)36 h后取出經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定30 min，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%結(jié)晶紫染色30 min，洗去多余的染液，用棉棒擦去位于上室的細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

收集各組細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，于體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇中固定過(guò)夜。次日取出離心后棄上清，用PBS洗滌兩次，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)即用型染液300 μL及7.5 μL 核糖核酸酶A(ribonuclease A，RNaseA)，放于37 ℃避光孵育30 min。過(guò)200目篩網(wǎng)后用Guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀分析樣品。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，取細(xì)胞懸液100 μL于4 ℃、1 000 r/min條件下離心5 min，用PBS洗滌，棄去上清液，加300 μL結(jié)合液至每管中，冰上避光，再加入3 μL AnnexinV-FITC和3 μL PI液于細(xì)胞懸液中混勻，過(guò)200目篩網(wǎng)后用Guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 裸鼠異體移植實(shí)驗(yàn)

將1.00×107HepG2、HepG2/shHMGA1細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠(每組n=5)的背側(cè)。從接種后第7天開(kāi)始，每隔3 d測(cè)量腫瘤異種移植物的長(zhǎng)度和寬度,使用公式V=W2×L×0.5計(jì)算腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中HMGA1的表達(dá)情況

HMGA1在正常肝組織、肝細(xì)胞、不同等級(jí)的肝癌組織、肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)量及其表達(dá)量與患者生存期的關(guān)系(圖1A～圖1E)。通過(guò)對(duì)TCGA-LIHC數(shù)據(jù)庫(kù)包含369個(gè)肝癌組織(n=369)和160個(gè)正常肝組織(n=160)的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比HCC組織中HMGA1基因的表達(dá)顯著升高，HMGA1在Edmondson Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)腫瘤中的表達(dá)水平高于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)腫瘤，在有血管浸潤(rùn)的肝癌組織中的表達(dá)水平高于無(wú)血管浸潤(rùn)的肝癌組織(圖1A)。進(jìn)一步提取HMGA1基因的表達(dá)水平與HCC預(yù)后的相關(guān)性數(shù)據(jù)，Kaplan-Meier Plotter分析后發(fā)現(xiàn)HMGA1表達(dá)高的患者生存率較低(圖1B)。The human protein ATLAS網(wǎng)站分析結(jié)果表明HMGA1蛋白在HCC組織細(xì)胞核中的表達(dá)顯著高于正常肝組織(圖1C)。實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HMGA1的mRNA在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于正常肝細(xì)胞(圖1D)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示HMGA1蛋白在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)量更高(圖1E)。以上結(jié)果表明，HMGA1可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展。

1)與正常組比較,P<0.05。

圖1B HMGA1的表達(dá)量高低與患者生存期的關(guān)系

1)與HL-7702組比較,P<0.01; 2)與HL-7702組比較,P<0.05。

2.2 KEGG和GO分析HMGA1及其相關(guān)基因的功能

通過(guò)京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)和基因本體論(gene ontology，GO)分析，癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)-肝細(xì)胞肝癌(Liver hepatocellular carcinoma，LIHC)數(shù)據(jù)集中4 474個(gè)基因與HMGA1表達(dá)顯著相關(guān)，其中2 672個(gè)正相關(guān)，1 802個(gè)負(fù)相關(guān)；GSE15765數(shù)據(jù)集中的1 173個(gè)基因，其中654個(gè)正相關(guān)和519個(gè)負(fù)相關(guān)。滿足在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)都具有統(tǒng)計(jì)意義的共有451個(gè)正相關(guān)基因和398個(gè)負(fù)相關(guān)基因。GO分析結(jié)果表明：HMGA1及其正相關(guān)基因主要富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和增殖，參與細(xì)胞組分的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，以及參與細(xì)胞-細(xì)胞黏附的蛋白結(jié)合、鈣粘蛋白結(jié)合，與分子功能的相同蛋白質(zhì)結(jié)合(圖2A～圖2C)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)HMGA1及其正相關(guān)基因參與的前3個(gè)途徑分別是細(xì)胞周期、致病性大腸桿菌感染和志賀氏菌病(圖2D)，而HMGA1及其負(fù)相關(guān)基因參與氧化還原過(guò)程、代謝過(guò)程和蛋白質(zhì)水解等主要生物過(guò)程；組成細(xì)胞外泌體、胞質(zhì)和線粒體等細(xì)胞成分；發(fā)揮受體結(jié)合、氧化還原酶活性和蛋白均聚作用等分子功能(圖2E～圖2G)。KEGG分析證實(shí)這些基因主要參與代謝途徑、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)以及脂肪酸降解(圖2H)。

2.3 下調(diào)HMGA1抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移并促進(jìn)凋亡

轉(zhuǎn)染HMGA1siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞活力、增殖、遷移和凋亡的影響結(jié)果(圖3A～圖3E)。為檢測(cè)HMGA1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，通過(guò)siRNA下調(diào)了3種肝癌細(xì)胞系中HMGA1的表達(dá)水平。qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染HMGA1 siRNA成功降低了HepG2、Hep3B和SNU-182細(xì)胞中HMGA1的表達(dá)(圖3A)。MTT結(jié)果表明與陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著降低(圖3B)。此外，克隆形成試驗(yàn)提示下調(diào)HMGA1的表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖能力(圖3C)。Transwell結(jié)果顯示HMGA1沉默導(dǎo)致HepG2、Hep3B和SNU-182細(xì)胞遷移能力下降(圖3D)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示HMGA1沉默增加了3株膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率(圖3E)。

1)與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系0 h組相比,P<0.01;2)與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系0 h組相比,P<0.05。

1)與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系0 h組相比,P<0.05;2)與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系0 h組相比,P<0.01。

1)與陰性對(duì)照組比較，P<0.05; 2)與陰性對(duì)照組比較，P<0.01。

圖3E 轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率

2.4 HMGA1低表達(dá)阻滯了肝癌細(xì)胞G0/G1期

細(xì)胞周期失調(diào)與腫瘤生長(zhǎng)抑制有關(guān)[15]，同時(shí)KEGG分析發(fā)現(xiàn)HMGA1及其正相關(guān)基因參與細(xì)胞周期調(diào)控(圖2D)。檢測(cè)si-HMGA1轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布(圖4A、表1)。結(jié)果表明，降低HMGA1表達(dá)引起肝癌細(xì)胞的G0/G1期阻滯，而3株細(xì)胞的G2/M期分布無(wú)明顯變化。為了進(jìn)一步證明HMGA1表達(dá)下調(diào)對(duì)G0/G1期的阻滯作用，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中周期蛋白依賴性蛋白激酶6(Cyclin-dependent kinases 6，CDK6)和細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1，CCND1)蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示si-HMGA1轉(zhuǎn)染組CDK6和CCND1的表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組(圖4B)。

A:正相關(guān)基因參與的生物學(xué)過(guò)程；B:正相關(guān)基因參與的細(xì)胞組分；C:正相關(guān)基因發(fā)揮的分子功能；D:顯著正相關(guān)通路的分析；E:負(fù)相關(guān)基因參與的生物學(xué)過(guò)程；F:負(fù)相關(guān)基因參與的細(xì)胞組分；G:負(fù)相關(guān)基因發(fā)揮的分子功能；H:顯著負(fù)相關(guān)通路的分析。

表1 轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組細(xì)胞周期分布的變化

A: 下調(diào)HMGA1后3種肝癌細(xì)胞周期不同時(shí)相的細(xì)胞占比;1)與陰性對(duì)照組比較,P<0.05;2)與陰性對(duì)照組比較,P<0.01;B:敲低HMGA1后3種肝癌細(xì)胞系中CCND1和CDK6的表達(dá)。

2.5 敲低 HMGA1對(duì)其表達(dá)量和裸鼠異位移植瘤生長(zhǎng)的影響

為了研究shHMGA1的抑制效率，我們通過(guò)qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因敲除結(jié)果。qRT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染組HMGA1 mRNA的表達(dá)被顯著抑制(圖5A)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果也證實(shí)，低表達(dá)HMGA1使其蛋白表達(dá)量明顯減少(圖5B)。采用裸鼠體內(nèi)腫瘤模型進(jìn)一步研究HMGA1在肝癌進(jìn)展中的作用。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，HepG2/shHMGA1組的腫瘤體積和腫瘤重量顯著減少(圖5C～圖5D)。此外，對(duì)腫瘤切片進(jìn)行Ki-67表達(dá)染色，HepG2/shHMGA1細(xì)胞顯示出較低的Ki-67增殖指數(shù)(圖5E)。

A:轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組HMGA1 mRNA的表達(dá)量;1)與0 h轉(zhuǎn)染組相比,P<0.01;B:轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組中HMGA1的相對(duì)表達(dá);2)與48 h陰性對(duì)照組相比,P<0.01;C:各組裸鼠腫瘤大小的生長(zhǎng)曲線;1)與對(duì)照組相比,P<0.01;D:各組異體移植瘤的平均重量;3)與對(duì)照組相比,P<0.01;E:Ki67和HMGA1在異種移植腫瘤中的表達(dá)的免疫組化結(jié)果。

3 討論

近年來(lái)，對(duì)于腫瘤基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究備受關(guān)注，已發(fā)現(xiàn)大量原癌及抑癌基因的產(chǎn)物可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[16-18]。HMGA1是hook(HMGA)蛋白家族高遷移率組的轉(zhuǎn)錄因子，被報(bào)道在甲狀腺癌的生長(zhǎng)和侵襲發(fā)揮著重要作用[19]。Fu等[11]發(fā)現(xiàn)HMGA1在宮頸癌中高表達(dá)，抑制HMGA1的表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。Takaha等[20]研究報(bào)道，HMGA1在腎癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲低HMGA1可抑制腎癌細(xì)胞的克隆形成能力、侵襲遷移能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除此之外，HMGA1還能夠通過(guò)參與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程調(diào)控細(xì)胞自噬水平，使腫瘤免疫逃逸發(fā)生。并且HMGA1高表達(dá)有助于促進(jìn)腫瘤微血管形成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移[6-7]。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)肝癌患者組織中HMGA1基因及蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組織。在不同級(jí)別肝癌組織中，高級(jí)別組HMGA1表達(dá)量高于低級(jí)別組，說(shuō)明HMGA1表達(dá)水平越高，肝癌患者病情越重。本研究結(jié)果顯示HMGA1在有血管浸潤(rùn)的瘤體組織中表達(dá)較高，說(shuō)明HMGA1表達(dá)越高，腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的可能性越大。另外，生存分析結(jié)果顯示HMGA1表達(dá)高的患者生存期較短，提示HMGA1可能是HCC診斷與預(yù)后的潛在標(biāo)志物。為了進(jìn)一步研究HMGA1對(duì)HCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，敲低肝癌細(xì)胞中HMGA1的表達(dá)量，分析發(fā)現(xiàn)下調(diào)HMGA1能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移能力而增加細(xì)胞凋亡率，能夠明顯抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。本研究初步表明，HMGA1可能作為原癌基因參與HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

GO功能注釋和KEGG通路富集分析結(jié)果表明，在HCC中，HMGA1與苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白激酶1(budding uninhibited by benzimidazoles 1，BUB1)、細(xì)胞分裂周期蛋白(cell division cycle 20，CDC20)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase 1，CHK1)、E2F transcription factor 3(E2F3)、微小染色體維持蛋白6(minichromosome maintenance 6，MCM 6)等周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)顯著正相關(guān)，暗示HMGA1可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期參與HCC的發(fā)生發(fā)展。Schuldenfrei等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HMGA1通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白A1、A2、B1和E的表達(dá)量來(lái)維持淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。因此，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HMGA1對(duì)HCC細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果顯示HMGA1低表達(dá)誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞在G0/G1期發(fā)生阻滯。隨后，免疫印跡檢測(cè)G0/G1期阻滯相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HMGA1抑制了HCC細(xì)胞中CDK6和CCND1的表達(dá)。以上結(jié)果表明，HMGA1參與HCC細(xì)胞的周期調(diào)控。

綜上，本研究利用生物信息學(xué)研究HMGA1在肝癌中的表達(dá)模式，分析其參與肝癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行初步驗(yàn)證，為深入探討HMGA1促癌作用機(jī)制提供了參考依據(jù)，在HMGA1及其相關(guān)基因?qū)Ω伟┘?xì)胞周期的調(diào)控方式及參與的信號(hào)通路等方向值得深入探索。

作者貢獻(xiàn)聲明

應(yīng)函妤：研究設(shè)計(jì)，撰寫并修改論文，數(shù)據(jù)整理；邢家恒：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，修改論文；孫江川：實(shí)驗(yàn)操作，統(tǒng)計(jì)分析；錢穎：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；胡林峰：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；田男：論文指導(dǎo)。

利益沖突聲明

本研究未收到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。