在APAP、TAA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞藥物性損傷中C/EBPβ對FXR的調(diào)控機(jī)制

洪煒龍, 彭旭云, 楊帆, 李攀龍, 梁偉鋮, 葉志強(qiáng)*

(中山大學(xué) 附屬第三醫(yī)院 1.急診科； 2.生物治療中心, 廣東 廣州 510630)

急性肝損傷(acute liver injury，ALI)是指在各類致病因素作用下，患者在短時(shí)間內(nèi)肝功能急劇惡化，致使肝功能嚴(yán)重紊亂[1]。目前藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)在ALI中所占比例最大，DILI發(fā)病區(qū)域、患病率及死亡率正逐年上升，且以對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)引起的DILI最為常見[2-4]，DILI是急需解決的醫(yī)學(xué)難題之一[5]。已有研究表明法尼醇X受體(Farnesol X receptor，F(xiàn)XR)可能作為DILI過程中的關(guān)鍵基因發(fā)揮抗炎作用，減輕肝臟損傷。但FXR在DILI過程中的細(xì)胞分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬通過硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)及APAP誘導(dǎo)小鼠正常肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12致藥物性損傷，并探究該過程中的分子調(diào)控機(jī)制。

FXR/NR1H4是一種膽汁酸(BA)受體，在膽汁酸代謝以及甘油三酯等脂質(zhì)代謝調(diào)控中起著重要作用。它屬于核受體(NR)超家族中的一員，是依賴于配體激活并且在肝臟中高表達(dá)的一類核轉(zhuǎn)錄因子[6-8]。FXRα(NR1H4)和FXRβ(NR1H5)是存在于哺乳動物中的2個(gè)FXR基因，其中FXRα在肝臟中的表達(dá)量最高并且能同時(shí)編碼FXRα1-4四種同工型亞基與DNA區(qū)域相結(jié)合發(fā)揮作用[9-10]。FXR可以參與BA的合成以及腸肝循環(huán)，調(diào)節(jié)血糖以及脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，受其激動劑奧貝膽酸(OCA)激活后還可治療原發(fā)性膽汁性膽管炎。有研究發(fā)現(xiàn)，使用OCA激活FXR可以有效減少四氯化碳(CCl4)引起的肝細(xì)胞凋亡，減輕CCl4所致DILI[11]。FXR-/-小鼠肝原代細(xì)胞對于TNF-α以及LPS引起的炎癥反應(yīng)更為敏感,早期補(bǔ)充FXR激動劑GW4064能夠顯著提高IL-18的水平，同時(shí)也能增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的生成，減少小鼠炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生[12]。上述研究表明FXR可能是治療DILI的一個(gè)潛在有效治療靶點(diǎn)。

CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT enhancer binding protein beta，C/EBPβ)是一類增強(qiáng)子結(jié)合蛋白，根據(jù)其轉(zhuǎn)錄起始部位的不同，可以翻譯為3種亞型：LAP1、LAP2、LIP。C/EBPβ主要對胞外多種信號分子進(jìn)行應(yīng)答并作用于相應(yīng)的靶基因；通過對信號通路的調(diào)節(jié)，C/EBPβ能在轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，如：甲基化、乙酰化、磷酸化等[13]。此外，C/EBPβ能在肝損傷后被激活，進(jìn)而促進(jìn)肝臟的再生，它在肝臟抗炎、抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮著重要的作用[14]。

基于APAP為常見誘導(dǎo)肝損傷的藥物，本研究以此作為研究對象，尋找DILI過程中可能存在的細(xì)胞分子機(jī)制。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在APAP介導(dǎo)的人和小鼠肝細(xì)胞損傷中，F(xiàn)XR的表達(dá)均明顯減少；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)C/EBPβ在FXR 啟動子水平上有顯著富集，但目前未有明確報(bào)道，所以本課題組進(jìn)行了深入研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小鼠正常肝細(xì)胞AML12購自浙江美森(MeisenCTCC)。DMEM/F12(DF12)培養(yǎng)液、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑(ITS)購自Gibco；胎牛血清購自PAN；Lipo-3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；TAA購自Sigma；APAP購自美侖生物；RIPA裂解液購自碧云天；RNA提取試劑盒購自新賽美；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑購自諾維贊；抗FXR抗體(D-3)(sc-25309)、抗C/EBPβ抗體(C-19)(sc-150)購自Santa Cruz; beta-Actin抗體(T0022-50 μL)購自Affinity Biosciences；Anti-mouse IgG馬抗小鼠二抗(7076S)和Anti-rabbit IgG 山羊抗兔二抗(7074S)購自Cell Signaling Technology;OCA購自Selleck，目錄號S7660;pLKO載體，購自吉瑪公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自凱基公司Cat number：KGA105-KGA108。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

每50 mL DF12培養(yǎng)基中添加500 μL ITS(100×)及5%胎牛血清。在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)AML12細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞貼壁率約75%～80%時(shí)傳代、接種和凍存。

1.2.2 Western blot分析

將狀態(tài)良好的AML12細(xì)胞以每孔1×106接種至6孔板，共分為6組：TAA(0、13、33 mmol/L)、APAP(0、2、5 μmol/L)。過夜培養(yǎng)后，在處理組中加入TAA/APAP刺激24h后收樣檢測。棄去上清，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上，用PBS沿壁輕輕清洗,棄去PBS，每孔加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解10 min，并將裂解完全的細(xì)胞收集起來。13 000 r/min、4 ℃離心細(xì)胞裂解液10 min，棄去含細(xì)胞碎片的沉淀，收集上清至1.5 mL EP管中。使用BCA蛋白定量法對細(xì)胞裂解液進(jìn)行定量，每管加入50 μL 5× loading buffer，金屬浴加熱10 min后樣品制備完成。根據(jù)定量結(jié)果，將樣品與Marker逐個(gè)加入至8% SDS-PAGE凝膠樣品槽內(nèi)；開始用80 V壓膠待樣品濃縮至水平后再改用120 V，電泳至藍(lán)色液條帶到凝膠底部為止；電泳結(jié)束后，將樣品從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。在轉(zhuǎn)膜緩沖液中操作，電壓保持在120 V，時(shí)間120 min，冰水浴完成轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后取出NC膜放進(jìn)5%脫脂牛奶中封閉30 min，在室溫?fù)u床上孵育。棄去牛奶，用1×TBST緩沖液洗去多余的牛奶，加入一抗，4 ℃孵育過夜?；厥找豢谷芤海?×TBST緩沖液洗3次膜，每次為7 min。加入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h。1×TBST緩沖液洗3次膜，每次7 min；將ECL底物A與B以體積比1∶1混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，盡量避光，用吸水紙吸干NC膜上的殘余液，膜上滴滿配好的顯影液，并用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 RT-qPCR檢測

分組同Western blot。使用試劑盒法提取細(xì)胞樣本總RNA，微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。按照說明書完成逆轉(zhuǎn)錄，獲得模板cDNA。根據(jù)RT-PCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，求平均值，通過分析 ΔΔCt值，進(jìn)行定量計(jì)算，以 2-ΔΔCt法測定相關(guān)分子的 mRNA 相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù) 3 次。mRNA引物由生工Sangon Biotech公司合成，F(xiàn)XR的上游引物序列為5′-GCTTGATGTGCTACAAAAGCTG-3′；下游引物序列為5′-CGTGGTGATGGTTGAATGTCC-3′，C/EBPβ的上游引物序列為5′-ATCGACTTCAGCCCCTACCT-3′；C/EBPβ的下游引物序列為5′- TAGTCGTCGGCGAAGAGG-3′。

1.2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建

采用病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株。shRNA引物由生工Sangon Biotech公司合成，共分為3組：sh-NC組, sh-C/EBPβ#1(TGGAAGTGGCCAACTTCTA)組和sh-C/EBPβ#2(CTGACGCAACACACGTGTAAC)組。將shRNA序列構(gòu)入pLKO載體中。配置轉(zhuǎn)染混合液，A液：用25 μL不含血清的培養(yǎng)基稀釋0.25 μg pMD2.G質(zhì)粒，0.75 μg psPAX2質(zhì)粒，1 μg目的質(zhì)粒；B液：用25 μL不含血清的培養(yǎng)基稀釋1 μL lipo3000。分別將A液與B液輕彈混勻，靜置5 min后將A、B液混合搖勻并靜置15 min。將狀態(tài)良好的293T細(xì)胞以每孔1×106接種至6孔板，在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入轉(zhuǎn)染混合液。48 h后收集培養(yǎng)基上清即病毒液，5 000 r/min、15 min離心病毒液。AML12細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天接種到6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取離心后病毒液上清與正常培養(yǎng)基1.5∶1混合，每1 mL混合病毒液加入1 μL polybreen (100 g/L)轉(zhuǎn)染試劑。棄去AML12原有培養(yǎng)基，加入混合病毒液，轉(zhuǎn)染48 h后加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選。篩選兩代后，收集細(xì)胞蛋白及RNA以Western blot及RT-qPCR進(jìn)行效率檢測。

1.2.5 流式細(xì)胞學(xué)檢測

分組同Western blot。AML12鋪板5% CO2、37 ℃培養(yǎng)至密度約70%后，在處理組中加入相應(yīng)濃度TAA/APAP刺激24 h，棄去上清，加入500 μL胰酶消化2 min后，加入500 μL含5%胎牛血清DF12終止消化，2 000 r/min、5 min離心收集。用PBS洗滌細(xì)胞2次并離心收集，加入500 μL Binding Buffer 將細(xì)胞懸浮，加入 5 μL Annexin V-FITC 混勻后，再加入 5 μL Propidium Iodide并混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min后上機(jī)檢測凋亡率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用 Graph Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以柱狀圖顯示，采用t檢驗(yàn)或 Mann-Whitney 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫和啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子ChIP-seq分析

對GSE74000數(shù)據(jù)集進(jìn)行生物信息學(xué)分析，該數(shù)據(jù)集收集了APAP誘導(dǎo)肝損傷患者的肝臟組織、APAP處理后的HepG2和HepaRG細(xì)胞的測序結(jié)果，通過比較發(fā)現(xiàn)顯著差異(含上調(diào)或下調(diào))基因，使用韋恩圖對分析結(jié)果取交集，發(fā)現(xiàn)只有FXR這個(gè)基因在3個(gè)獨(dú)立的測序結(jié)果中發(fā)生變化(見圖1A)。通過ENCODE數(shù)據(jù)庫的ChIP-seq數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ可能結(jié)合FXR的啟動子區(qū)域。Cistrome Data Browser是哈佛大學(xué)Shirley Liu教授開發(fā)的一款收集眾多轉(zhuǎn)錄因子已有測序結(jié)果的網(wǎng)站。利用Cistrome Data Browser 對GSM427088及GSM2540286 數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，在FXR的啟動子區(qū)域C/EBPβ均有較高強(qiáng)度的結(jié)合峰(圖1B)。此外，在The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)C/EBPβ在人肝細(xì)胞中含量豐富，由此可見肝臟中FXR的調(diào)控與C/EBPβ有著密切的聯(lián)系(圖1C)。

A: GEO數(shù)據(jù)庫從HepG2、HepaRG細(xì)胞和人肝組織3個(gè)方面分析APAP處理下的差異表達(dá)基因；B: ENCODE數(shù)據(jù)庫的ChIP-seq顯示轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與FXR啟動子結(jié)合區(qū)域；C：The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫顯示C/EBPβ在肝臟各類細(xì)胞中的表達(dá)量

2.2 TAA、APAP對小鼠正常肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12的FXR表達(dá)影響

采用Western blot檢測AML12中FXR的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，TAA(0、13、33 mmol/L)和APAP(0、2、5 μmol/L)給藥干預(yù)24 h后AML12中FXR的蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴型減少(圖2A、2B)。RT-qPCR檢測小鼠正常肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12在TAA(0、13、33 mmol/L)和APAP(0、2、5 μmol/L)的表達(dá)情況，可見FXR在處理組均有不同程度的下調(diào)，其中APAP 5 μmol/L組表達(dá)較對照組顯著下調(diào)(P<0.01,圖2C、D)。

與對照組相比， 1)P<0.05； 2)P<0.01。

2.3 TAA、APAP對小鼠正常肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12的C/EBPβ蛋白表達(dá)影響

經(jīng)Western blot檢測可見，AML12在TAA(0、13、33 mmol/L)和APAP(0、2、5 μmol/L)處理24 h后，與抑制肝臟增殖相關(guān)的LAP1和LAP2均無明顯變化。而在APAP組中，隨著藥物濃度的增加，與促進(jìn)肝細(xì)胞增殖相關(guān)的LIP蛋白表達(dá)量逐漸降低(圖3A)。

2.4 敲低C/EBPβ表達(dá)對小鼠正常肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12的FXR表達(dá)影響

Western blot檢測顯示，穩(wěn)定敲低C/EBPβ的AML12細(xì)胞中C/EBPβ的蛋白表達(dá)水平相較于對照組有顯著的降低(圖3A)。此外，RT-qPCR檢測可見，敲低C/EBPβ后其相關(guān)mRNA的表達(dá)水平有明顯的下調(diào)，F(xiàn)XR的表達(dá)水平也出現(xiàn)相應(yīng)的下調(diào)(圖3B)。

與對照組相比, 1)P<0.01。

2.5 TAA、APAP對小鼠正常肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞凋亡的影響

基于藥物的量效關(guān)系，選擇不同濃度的TAA(0、13、33 mmol/L)及 APAP(0、 2、5 μmol/L)對AML12細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察其對細(xì)胞凋亡的影響。處理24 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測可見，TAA及APAP可呈劑量依賴性誘導(dǎo)AML12凋亡(圖4)。

A：TAA、APAP干預(yù)AML12細(xì)胞24 h后，Annexin V-FITC/PI染色并通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；B：TAA、APAP干預(yù)AML12 24 h后細(xì)胞狀態(tài)變化(×40)

2.6 OCA可經(jīng)FXR抑制PARP表達(dá)

不同濃度的OCA(0、1、2.5 μmol/L)與固定濃度的TAA(33 mmol/L)及APAP(5 μmol/L)同時(shí)對AML12處理24 h后，經(jīng)Western blot檢測可見，在FXR的激動劑OCA處理之后，F(xiàn)XR的蛋白表達(dá)水平有些許上調(diào)。同時(shí)，在兩組中均可見，F(xiàn)XR的上調(diào)可以一定程度上抑制凋亡相關(guān)基因聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)的表達(dá)(圖5A)。在藥物引起肝損傷過程中，細(xì)胞凋亡信號機(jī)制可能為：轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的生成減少，與FXR啟動子結(jié)合的數(shù)量也相應(yīng)降低，肝細(xì)胞內(nèi)PARP相關(guān)凋亡系統(tǒng)被激活，肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，最終引起肝損傷(圖5B)。

A. OCA分別與TAA、APAP同時(shí)干預(yù)AML12細(xì)胞情況下的蛋白表達(dá)；B：DILI細(xì)胞凋亡過程可能的信號機(jī)制

3 討論

由于DILI沒有相應(yīng)特效藥物進(jìn)行治療，在此基礎(chǔ)上容易進(jìn)展為ALI或急性肝衰竭[15]，且DILI相應(yīng)的分子細(xì)胞機(jī)制仍不明確，對于DILI過程中的分子調(diào)控機(jī)制的研究顯得尤為重要。本研究通過生物信息學(xué)分析，以APAP誘導(dǎo)損傷為基礎(chǔ)，將患者肝臟組織及具有大多數(shù)肝酶的HepG2、HepaRG細(xì)胞的測序結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)[16]，F(xiàn)XR是DILI過程中的重要基因。在TAA及APAP干預(yù)的AML12細(xì)胞中，本課題組發(fā)現(xiàn)FXR在DILI中蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。前人研究雖發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR經(jīng)OCA激活后可以減輕CCl4引起的細(xì)胞凋亡[11]，但具體的調(diào)控機(jī)制并未闡明，為此本團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了研究。

課題組通過生物信息分析后發(fā)現(xiàn)，C/EBPβ與FXR的調(diào)控有著密切的聯(lián)系，肝臟中富含的C/EBPβ可能與FXR的轉(zhuǎn)錄及后續(xù)的表達(dá)有密切關(guān)系。為了驗(yàn)證這一關(guān)系，通過pLKO載體構(gòu)建C/EBPβ穩(wěn)定敲低的AML12細(xì)胞株，Western blot及qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，C/EBPβ能夠調(diào)控FXR的mRNA表達(dá)水平，這與前人的研究不同，有研究認(rèn)為在小鼠肝癌模型中FXR的減少會引起HDAC1-C/EBPβ復(fù)合物表達(dá)減少[17]，也有研究認(rèn)為在CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷中C/EBPβ-LIP可以反過來抑制FXR的肝臟再生作用[18]。對此我們認(rèn)為，研究結(jié)果的不同與相應(yīng)的動物細(xì)胞模型的差異有較大關(guān)系，也與C/EBPβ和FXR之間可能存在相互調(diào)控有關(guān)，但具體機(jī)制仍有待研究。此外本研究也發(fā)現(xiàn)，TAA及APAP使AML12藥物依賴性地發(fā)生凋亡，在使用OCA對該過程進(jìn)行干預(yù)后，PARP凋亡相關(guān)基因能夠在一定程度下調(diào)。

有研究表明，TAA可以引起小鼠肝臟中的FXR表達(dá)顯著下調(diào)[19]，而這與TAA經(jīng)過數(shù)個(gè)代謝階段后最終生成的肝毒性物質(zhì)TASO2有關(guān)[20]，OCA可以減少TAA干預(yù)過程中小鼠PARP的相關(guān)表達(dá)[21]，與本研究結(jié)果一致。另一方面，APAP在經(jīng)肝臟代謝后生成NAPQI，該產(chǎn)物在肝臟谷胱甘肽的作用下進(jìn)行解毒，當(dāng)谷胱甘肽耗盡后，NAPQI與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)一步對肝臟造成損傷[22]，近期也有研究表明APAP在損傷肝臟的過程中亦激活了PARP相關(guān)系統(tǒng)[23]。因此，TAA及APAP引起的肝損傷機(jī)制雖不相同，但卻可能存在相同的凋亡調(diào)控機(jī)制。

本研究中可能的信號機(jī)制為TAA及APAP對肝細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，抑制了C/EBPβ的表達(dá)，進(jìn)而減少了C/EBPβ對核內(nèi)FXR的調(diào)控，使得肝細(xì)胞內(nèi)的凋亡系統(tǒng)被激活，胞內(nèi)促凋亡基因表達(dá)增加，肝細(xì)胞出現(xiàn)病理性損傷以及功能障礙，最終導(dǎo)致了肝損傷的發(fā)生[24-25]。在這個(gè)過程中，被激活的也包括了PARP相關(guān)凋亡體系，PARP具有穩(wěn)定基因組、修復(fù)DNA損傷、調(diào)控細(xì)胞凋亡等作用[26]，它的激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的增多。本研究雖闡明了部分機(jī)制，但仍有問題未得到解決，如C/EBPβ對核內(nèi)FXR的具體調(diào)控機(jī)制及FXR如何對PARP造成影響等。綜上，DILI治療過程中C/EBPβ可能是FXR調(diào)控凋亡的關(guān)鍵基因，這為未來的相關(guān)治療提供了新的研究思路。

作者貢獻(xiàn)聲明

葉志強(qiáng)：提出研究思路和框架，修改論文；洪煒龍：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；彭旭云：協(xié)助實(shí)驗(yàn)進(jìn)展；楊帆：訂購所需材料；李攀龍：指導(dǎo)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)；梁偉鋮：生信分析。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。