春尺蠖海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白基因AcinTret1和AcinTret1-like的克隆、分子特性與表達分析

陳龍 娜仁格日樂 戴桂香 李紅 閆國欣

摘要：海藻糖作為昆蟲的血糖，不僅對增強其在抵御外界不利環(huán)境中的能力起著重要作用，還可為昆蟲的生長發(fā)育和繁殖提供能量。海藻糖轉(zhuǎn)運體（Tret）在從脂肪體等海藻糖產(chǎn)生組織向消耗組織轉(zhuǎn)運過程中起著重要作用。為深入探究Tret基因在春尺蠖（Apocheima cinerarius）低溫脅迫中的作用，研究基于已有春尺蠖幼蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（不同低溫脅迫條件），克隆獲取Tret1和Tret1-like基因，分別命名為AcinTret1和AcinTret1-like（GenBank登錄號：MZ689788、MZ689789），對基因的分子特征進行分析，同時構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，最后對其在不同低溫脅迫下的表達譜進行分析。結(jié)果顯示，春尺蠖AcinTret1、AcinTret1-like基因編碼蛋白序列（CDS）全長分別為1 926、1 533 bp，分別編碼641、510個氨基酸，二者均具有主要協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白超家族（major facilitator superfamily，簡稱MFS）的保守結(jié)構(gòu)域，在N端均不含信號肽，但均具有12個跨膜區(qū)。系統(tǒng)進化結(jié)果表明，春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因分別與其他昆蟲的Tret1和Tret1-like基因聚為一類，且AcinTret1與同為鱗翅目尺蛾科的冬尺蠖（Operophtera brumata）的親緣關(guān)系最近，Tret1-like則與同為鱗翅目的粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）的親緣關(guān)系最近?；虮磉_分析結(jié)果顯示，AcinTret1和AcinTret1-like基因的表達量均在-10 ℃達到最大值，其次為25 ℃，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。由研究結(jié)果可以看出，2個Tret1基因在春尺蠖抵御低溫脅迫調(diào)控中扮演重要角色，該研究結(jié)果有助于探索春尺蠖低溫脅迫中調(diào)控海藻糖代謝的機制，為進一步揭示春尺蠖低溫脅迫的分子機制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：春尺蠖;海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白;低溫脅迫;表達分析;AcinTret1;AcinTret1-like

中圖分類號：S433.4 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）10-0023-07

海藻糖作為昆蟲的血糖，在昆蟲生長發(fā)育和抵抗外界不利環(huán)境等過程中扮演著重要角色[1-5]。昆蟲體內(nèi)的海藻糖主要依靠TPS-TPP途徑合成，在此途徑中需要海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的催化，而海藻糖的分解只有在海藻糖酶的作用下才能實現(xiàn)。海藻糖酶作為昆蟲體內(nèi)唯一可以分解海藻糖的酶，可分為可溶型海藻糖酶（TRE1）和膜結(jié)合型海藻糖酶（TRE2）[6]。目前，關(guān)于海藻糖代謝的研究大多集中于海藻糖的合成或分解[7]，缺乏血糖-海藻糖轉(zhuǎn)運過程的系統(tǒng)、深入的研究。在昆蟲體內(nèi)，不是所有物質(zhì)都像水或者脂肪一樣可以不依賴任何載體直接穿過細胞膜，作為昆蟲的能源物質(zhì)，海藻糖和葡萄糖需要一種載體——糖轉(zhuǎn)運蛋白（sugar transporter，ST）才能在細胞膜內(nèi)外順利進出，進而發(fā)揮作用。糖轉(zhuǎn)運蛋白隸屬于主要協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白超家族（major facilitator superfamily，簡稱MFS），葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白就是其中的2種。海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白在動植物中均被證明具有重要作用，如糖轉(zhuǎn)運蛋白與植物果實的成熟有關(guān)聯(lián)，在昆蟲體內(nèi)，海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白1（trehalose transporter1，Tret1）可以根據(jù)細胞內(nèi)外的濃度梯度來運輸海藻糖[8-9]。海藻糖不僅可以在昆蟲生長發(fā)育過程中提供能量，而且發(fā)揮著抵抗外界寒冷的作用。越冬期昆蟲體內(nèi)的海藻糖含量顯著高于非越冬期，說明可以通過調(diào)節(jié)昆蟲體內(nèi)的海藻糖含量來提高昆蟲的抗寒能力，而海藻糖的含量與海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白密切相關(guān)。

春尺蠖（Apocheima cinerarius）是內(nèi)蒙古地區(qū)近些年來暴發(fā)成災的新害蟲，為鱗翅目尺蛾科雜食性昆蟲，在內(nèi)蒙古地區(qū)以危害檸條為主，是我國多個?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）重點監(jiān)測的牧草、林木和經(jīng)濟樹種害蟲[10-11]。近年來，春尺蠖危害對象呈現(xiàn)擴大趨勢，已經(jīng)從危害楊、桑、柳、檸條、果樹等林木發(fā)展到開始危害玉米、小麥等農(nóng)作物，危害區(qū)域開始由北方的內(nèi)蒙古、新疆等地區(qū)逐漸向南方的四川、云南等地區(qū)遷移危害。幼蟲最早于4月上旬開始發(fā)生危害，此時當?shù)貢円箿夭钶^大，最低溫度可達-10 ℃，幼蟲能在如此環(huán)境中生存下來且發(fā)生危害，與其極強的抗寒性密切相關(guān)。為了深入了解海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白與春尺蠖生長發(fā)育的關(guān)系及其在低溫脅迫中的作用，本研究利用筆者所在實驗室已測春尺蠖3齡幼蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆獲取2個海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，對其進行生物信息學分析，構(gòu)建Tret1的系統(tǒng)進化樹，同時分析其在不同溫度處理下的表達譜，以期明確海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白在春尺蠖低溫脅迫中的作用，為進一步揭示春尺蠖響應(yīng)低溫脅迫的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

春尺蠖雌雄成蟲在2020年春季采集于內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗檸條草場（108°45′23.63″E，40°46′4.19″N），帶回實驗室后在室溫下用檸條錦雞兒雌雄成對飼喂，將其所產(chǎn)卵置于恒溫（22±1） ℃、光—暗周期18 h—6 h、相對濕度55%～59%的 PRX-350C 智能型人工氣候箱（產(chǎn)自寧波海曙塞福實驗儀器廠）中卵育，將孵化出的幼蟲用檸條錦雞兒連續(xù)飼養(yǎng)，待幼蟲發(fā)育至3齡時，取供試幼蟲（蛻皮后2 d），分別在-10、-5、0、5、25 ℃各處理1 h，用液氮速凍后存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 主要試劑

TaKaRa RNA提取試劑盒、TaKaRa RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa DNA純化試劑盒、pMD19-T載體、2×PCR Master Mix及TaKaRa Taq酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司;DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

將春尺蠖在-10、-5、0、5、25 ℃處理下的昆蟲供試樣本置于滅菌后的研缽中用液氮研磨，具體提取步驟參照TaKaRa RNA提取試劑盒說明書，而后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Nano PhotometerTMP-Class超微量分光光度計分別對提取得到的RNA質(zhì)量和濃度進行檢測，質(zhì)檢合格后反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。

1.4 春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因的克隆

基于筆者所在實驗室前期已測春尺蠖幼蟲在不同溫度脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)差異分析結(jié)果及基因功能注釋信息，同時結(jié)合美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上的BlastP進行驗證，從中篩選出具有完整編碼序列（CDS）的Tret1、Tret1-like基因。以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲取的基因序列為依據(jù)，用Primer Premier 5.0軟件在春尺蠖Tret1和Tret1-like基因外圍設(shè)計PCR擴增引物，以在上述不同溫度處理下進行PCR擴增所得產(chǎn)物條帶中最亮的樣品cDNA為模板，擴增2個基因的完整編碼蛋白區(qū)。

春尺蠖Tret1擴增引物：Tret1-F，5′-TTTTGACGTTCCCTGACAAACTATT-3′;Tret1-R，5′-AGAGAATCAATACATTACATGCCTACA-3′。

春尺蠖Tret1-like擴增引物：Tret1-like-F，5′-ATGCGCCCACCTCGGTAGC-3′;Tret1-like-R，5′-ATTTTCCTATCACTTTTCTAAAAGCGA-3′。

PCR反應(yīng)體系共25 μL（包括1 μL cDNA模板、各1 μL上下游引物、12.5 μL Master Mix，用RNase-free Water補至25 μL）。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃（Tret1）/62 ℃（Tret1-like）30 s，72 ℃ 1 min，共30次循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測春尺蠖Tret1與Tret1-like基因的PCR擴增產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)回收、亞克隆后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因的生物信息學分析

在NCBI ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線網(wǎng)站預測春尺蠖2條海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白對應(yīng)基因的編碼區(qū)序列。用DNAMAN軟件對春尺蠖2條海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列與其他昆蟲Tret1基因編碼氨基酸序列的一致性進行分析;N端信號肽通過在線預測工具SignalIP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）來預測;用TMHMM在線網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域進行預測;利用MEGA 6.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）、p距離（P-distance）法，重復運行 1 000 次來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因的表達

為了解春尺蠖3齡幼蟲在低溫脅迫下的基因表達情況，對5個溫度處理下的春尺蠖基因表達情況進行測定（每個溫度處理設(shè)3個生物學重復，每個重復設(shè)20頭試蟲）?；虮磉_評估方法采用每1百萬個map上的reads中map到外顯子的每1 k個堿基上的reads個數(shù)（fragment per kilobase of transcript per million mapped reads，F(xiàn)KPM），這是轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析中常用的基因水平評估方法，能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響。本研究以AcinTret1和AcinTret1-like基因的FKPM值為基礎(chǔ)，分析2個海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達情況。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析中的Duncans多重比較分析對海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白的基因差異表達情況進行統(tǒng)計分析，用GraphPad Prism 7.0軟件進行作圖。數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標準誤”的形式表示，顯著性分析水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中已有的春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like序列信息，分別在基因編碼蛋白區(qū)設(shè)計引物以擴增目的基因序列，以AcinTret1的 F/R 和AcinTret1-like的F/R為引物在目的基因外圍分別擴增2 126、1 767 bp長的片段，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別發(fā)現(xiàn)1條長度約為2 000、1 500 bp 的特異性單一亮帶，經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)這2條條帶分別包含轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中長度為1 926、1 533 bp的海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白基因序列，序列信息比對一致。將上述基因分別命名為AcinTret1和AcinTret1-like（GenBank登錄號：MZ689788和MZ689789）。

2.2 AcinTret1和AcinTret1-like基因編碼蛋白的生物信息學分析

春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因序列CDS全長分別為1 926、1 533 bp，分別編碼641、510個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量分別為70.65、55.35 ku，等電點分別為9.33、8.86;AcinTret1、AcinTret1-like基因編碼蛋白在N端均不含信號肽且均有12個跨膜區(qū)（圖1-A、圖1-B），表明二者均為跨膜蛋白。此外，2條海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白均具有MFS超家族的典型結(jié)構(gòu)域（圖2-A、圖2-B），其中AcinTret1位于第168～615位氨基酸，AcinTret1-like則位于第108～501位氨基酸（圖3-A、圖3-B）。

2.3 春尺蠖海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的同源性比對及系統(tǒng)進化關(guān)系分析

將春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與NCBI中搜索到的其他鱗翅目昆蟲的相應(yīng)氨基酸序列進行比對，結(jié)果表明，Tret1與Tret1-like之間的一致性均≤25.59%，其中春尺蠖AcinTret1與AcinTret1-like基因?qū)?yīng)的氨基酸序列之間的一致性最高，為25.59%。AcinTret1基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與同為尺蛾科的冬尺蠖（Operophtera brumata）的一致性最高，為80.43%，其次為與野桑蠶（Bombyx mandarina）、家蠶（Bombyx mori）的一致性，分別為75.58%和58.79%。AcinTret1-like基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與同為鱗翅目的粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）的一致性最高，為82.94%，其次為與棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）和斜紋夜蛾（Spodoptera litura）的一致性，分別達到8157%和80.78%（圖4）。

通過NCBI搜索其他昆蟲已上傳的Tret1基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因?qū)?yīng)的氨基酸序列，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，進化樹中Tret1、Tret1-like基因?qū)?yīng)的氨基酸序列分別聚在不同分支上;在Tret1-like基因?qū)?yīng)

氨基酸序列的分支上，AcinTret1-like基因?qū)?yīng)氨基酸序列與同為鱗翅目的粉紋夜蛾Tret1-like基因?qū)?yīng)的氨基酸序列聚為一類，表明二者的親緣關(guān)系最近，其次為棉鈴蟲和斜紋夜蛾，與鱗翅目螟蛾科大蠟螟（Galleria mellonella）間的親緣關(guān)系最遠;在AcinTret1分支上，AcinTret1與同為尺蛾科的冬尺蠖聚為一類，表明二者的親緣關(guān)系最近，其次為蠶蛾科的野桑蠶和家蠶，與同翅目蚜科的豌豆芽（Acyrthosiphon pisum）和雙翅目蚊科的埃及伊蚊（Aedes aegypti）的親緣關(guān)系較遠（圖5）。

2.4 春尺蠖AcinTret1和AcinTret1-like基因在不同溫度脅迫下的表達分析

從圖6可以看出，AcinTret1和AcinTret1-like基因的表達量均在-10 ℃達到最大值， 其次為25 ℃，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，但AcinTret1基因在-5、0、5 ℃溫度處理下的表達量差異不顯著，而AcinTret1-like基因在所有溫度處理下的表達量差異均顯著（P<0.05）。

3 討論

本研究從筆者所在實驗室前期已測春尺蠖3齡幼蟲在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出2個海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因（Tret1和Tret1-like），結(jié)合NCBI BlastP與RT-PCR技術(shù)，克隆獲取了基因的完整編碼蛋白區(qū)。經(jīng)序列信息分析發(fā)現(xiàn)，2個海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白基因均包含MFS超家族的典型結(jié)構(gòu)域，均未發(fā)現(xiàn)信號肽且均具有12個跨膜區(qū)。Saier研究結(jié)果表明，MFS超家族大多具有12個跨膜區(qū)，少數(shù)具有14個或24個跨膜區(qū)[12]。在褐飛虱中，NlTret1-like X1也存在12個跨膜區(qū)域，而NlTret1-2 X1卻只有10個跨膜區(qū)，可能是由于該基因為非全長序列[13]。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，春尺蠖Tret1、Tret1-like基因?qū)?yīng)氨基酸序列與其他鱗翅目昆蟲Tret1、Tret1-like對應(yīng)氨基酸序列的一致性均在80%以上。系統(tǒng)進化結(jié)果顯示，春尺蠖Tret1對應(yīng)氨基酸序列與同為尺蛾科的冬尺蠖聚為一支，而Tret1-like對應(yīng)氨基酸序列與同為鱗翅目昆蟲的粉紋夜蛾聚為一支。通過生物信息學分析、同源序列比對和系統(tǒng)進化分析，進一步確認了這2個基因為春尺蠖海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因，并分別命名為AcinTret1和AcinTret1-like。

在昆蟲千百年來的進化過程中，不同昆蟲之間的Tret編碼蛋白具有相似的保守結(jié)構(gòu)域，這些保守結(jié)構(gòu)域與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白超家族有很多相似之處，在對嗜眠搖蚊（Polypedilum vanderplanki）的研究中發(fā)現(xiàn)，Tret1編碼蛋白具有轉(zhuǎn)運多種物質(zhì)的能力，對海藻糖和葡萄糖類似物均有轉(zhuǎn)運作用[9]，因此有研究推測Tret1編碼蛋白可能是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白超家族的新成員[14]。基因的序列相似性出現(xiàn)在包括Tret1在內(nèi)的所有葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporter，Glut）超家族成員，但它們在底物選擇性和動力學等生化特性方面卻存在很大差異，如Glut1和Glut5的底物就完全不同[15]，說明除了保守區(qū)域中的氨基酸殘基外，其他氨基酸殘基也可能對每個轉(zhuǎn)運蛋白的特異性產(chǎn)生影響。在大猿葉蟲（Colaphellus bowringi）中發(fā)現(xiàn)2個Tret1，其表達有組織特異性，同時發(fā)現(xiàn)其在不同組織間可能發(fā)揮著不同功能。此外，於衛(wèi)東等推測，在褐飛虱體內(nèi)的2個Tret1在不同組織間也可能發(fā)揮著不同功能[13，16]。本研究中，AcinTret1與AcinTret1-like對應(yīng)的氨基酸序列在保守結(jié)構(gòu)域5′端上相差100個左右的氨基酸序列，可能是導致二者抵御低溫脅迫時存在一定差異的原因，其表達可能也存在組織特異性，有待進一步研究。

從春尺蠖與其他鱗翅目昆蟲的系統(tǒng)進化結(jié)果可以看出，春尺蠖Tret1、Tret1-like基因?qū)?yīng)氨基酸序列分別與其他昆蟲的AcinTret1-like和Tret1-like基因?qū)?yīng)氨基酸序列聚為一類，同時與親緣關(guān)系更近的同科昆蟲聚在同一分支上，表明春尺蠖這2個海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白與其他鱗翅目昆蟲有較高的同源性，在褐飛虱上也得出了相同的結(jié)論[13]，系統(tǒng)進化結(jié)果與序列分析結(jié)果一致。

海藻糖是昆蟲中主要的血糖，而海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白則負責海藻糖的運輸并調(diào)節(jié)海藻糖在不同組織中的分布，在昆蟲的營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)和脅迫耐受性中起著重要作用[1-5，17]。在褐飛虱中，通過干擾褐飛虱NlTret1-like X1，可使體內(nèi)TPS和TRE均呈現(xiàn)低表達[13]。由以上結(jié)果可以看出，Tret的表達量與TPS和TRE的表達量呈現(xiàn)相同趨勢。沙蔥螢葉甲（Galeruca daurica）GdTPS易受低溫誘導，隨著溫度的降低，其表達量逐漸升高[18]。在本研究中，AcinTret1、AcinTret1-like在-10、25 ℃溫度高表達，而在其他溫度（-5、0、5 ℃）下低表達，可能是由于春尺蠖海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白在未進行低溫處理前處于（22±1） ℃環(huán)境下，此時昆蟲體內(nèi)的海藻糖用來維持正常的生理功能，當溫度降低至5、0、-5 ℃時，體內(nèi)海藻糖足夠用來抵御外界低溫，所以不需要再運輸更多海藻糖;當溫度降低到-10 ℃時，海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白才再度生成用來運輸更多的海藻糖以抵御低溫。

4 結(jié)論

本研究從春尺蠖幼蟲不同溫度脅迫下的轉(zhuǎn)錄組中克隆獲取AcinTret1和AcinTret1-like，基因序列cDNA全長分別為1 926、1 533 bp，分別編碼641、510個氨基酸，均不含信號肽，同時均具有12個跨膜區(qū)。從系統(tǒng)進化結(jié)果可以看出，春尺蠖AcinTret1與同為鱗翅目尺蛾科的冬尺蠖親緣關(guān)系最近，Tret1-like則與同為鱗翅目的粉紋夜蛾親緣關(guān)系最近，以上結(jié)果進一步確定了AcinTret1和AcinTret1-like編碼海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白?；虮磉_分析結(jié)果顯示，AcinTret1和AcinTret1-like基因的表達量均在 -10 ℃ 達到最大值，其次為25 ℃，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，說明春尺蠖Tret1可受低溫誘導，可能在低溫脅迫中起作用。研究結(jié)果有助于揭示春尺蠖低溫脅迫下海藻糖代謝機制，可為其在低溫脅迫下的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

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