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    二氧化硅納米花固定化酶及其有機(jī)磷農(nóng)藥降解性能

    2022-06-12 20:21:12李霆李強(qiáng)強(qiáng)姜艷軍馬麗
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:有機(jī)磷農(nóng)藥降解

    李霆 李強(qiáng)強(qiáng) 姜艷軍 馬麗

    摘要:有機(jī)磷農(nóng)藥在蔬菜、水果及土壤中的殘留嚴(yán)重影響了環(huán)境和人類的身體健康。有機(jī)磷水解酶(organophosphate pesticides,OPH)能高效降解有機(jī)磷類化合物殘留,利用具有開(kāi)放孔道的二氧化硅納米花固定有機(jī)磷水解酶,可以優(yōu)化固定化條件,固定化OPH的最適溫度為45 ℃,最適pH值為8,與游離OPH相比,在溫度為35~55 ℃、pH值為7.5~9.0的范圍內(nèi)均能保持較高的催化活性。與游離有機(jī)磷水解酶相比,固定化有機(jī)磷水解酶具有更好的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。研究結(jié)果表明,固定化酶在保證降解效率的同時(shí),可有效降低有機(jī)磷水解酶的使用成本,是一種具有發(fā)展前景的固定化酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥技術(shù)。

    關(guān)鍵詞:有機(jī)磷降解酶;有機(jī)磷農(nóng)藥;二氧化硅納米花;固定化酶;降解

    中圖分類號(hào): S482.3+3;S188+.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2022)10-0104-06

    有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphate pesticides,OPs)是我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)使用最廣泛的一類用于農(nóng)作物和蔬果的殺蟲(chóng)劑,由于其與生物體內(nèi)的乙酰膽堿具有相似的結(jié)構(gòu),從而會(huì)影響生物體內(nèi)正常的神經(jīng)系統(tǒng)傳遞過(guò)程,達(dá)到消滅害蟲(chóng)的目的[1-3]。但在自然界中,有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)持續(xù)存在很長(zhǎng)時(shí)間,給環(huán)境和人類健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅[3-7]。因此,開(kāi)發(fā)可以在水體、農(nóng)作物、土壤中應(yīng)用的高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥技術(shù)十分必要。

    目前,針對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解方法主要分為熱降解法、化學(xué)降解法和生物酶降解法,由于生物酶法具有反應(yīng)專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保的優(yōu)勢(shì)而受到廣泛關(guān)注[8-13]。有機(jī)磷水解酶(organophosphate pesticides,OPH)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的酯酶,能夠高效催化有機(jī)磷農(nóng)藥的降解。2020年,白俊巖等利用OPH降解甲基對(duì)硫磷,在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,OPH對(duì)有機(jī)磷類化合物的降解率達(dá)到98%以上[14]。用OPH降解有機(jī)磷類毒劑時(shí),通常需要將OPH固定在載體上,與直接使用游離酶相比,在保證酶催化性能的同時(shí),解決了游離酶難分離、重復(fù)使用的缺陷。固定化酶的方法和載體的選擇是影響固定化酶效果的關(guān)鍵因素。因此,開(kāi)發(fā)適合OPH固定的良好載體,并通過(guò)合適的固定化方法維持酶的活性與穩(wěn)定性是目前亟待解決的問(wèn)題。

    本研究制備了具有開(kāi)放孔道結(jié)構(gòu)的二氧化硅納米花作為載體固定化OPH。二氧化硅納米花具有獨(dú)特的孔道結(jié)構(gòu),可以提高OPH的負(fù)載量,同時(shí)可為OPH提供適宜的微環(huán)境,有利于保持酶分子的活性構(gòu)象,使固定化酶表現(xiàn)出良好的催化活性。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)固定化酶的條件進(jìn)行優(yōu)化,考察固定化酶的酶學(xué)性能,并對(duì)固定化OPH在真實(shí)樣品中的降解能力和重復(fù)使用性進(jìn)行了測(cè)定。褶皺二氧化硅納米花不僅為固定化酶提供了一種良好載體,同時(shí)該技術(shù)也為在蔬果中實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解提供了新方法。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)試劑

    OPH,購(gòu)于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)、正丁醇、環(huán)己烷、乙醇、尿素、碳酸鈉(Na2CO3)和正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate,TEOS),購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠;甲基對(duì)硫磷、對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S),購(gòu)自河南予華儀器有限公司;管式爐(KRG-9-12),購(gòu)自洛陽(yáng)科熱爐業(yè)有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1100),購(gòu)自上海儀電分析儀器有限公司;掃描電子顯微鏡(NanoSEM450)和透射電子顯微鏡(TalosF200s),購(gòu)自美國(guó)FEI公司;漩渦振蕩器(XW-80A),購(gòu)自上海青浦瀘西儀器廠。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 褶皺二氧化硅納米花的制備方法 將CTAB(1.0 g)、正丁醇(1.0 g)和尿素(30 g,0.4 mol/L)置于單口燒瓶中,攪拌至完全溶解,向上述溶液中加入12 g環(huán)己烷,待完全溶解后緩慢滴加2 g 正硅酸乙酯,攪拌30 min,于70 ℃、恒溫條件下磁力攪拌反應(yīng)20 h,用蒸餾水、95%乙醇洗滌,在煅燒爐中于550 ℃空氣煅燒5 h,除去未反應(yīng)的CTAB,得到褶皺二氧化硅納米花顆粒(SiO2NF)。

    1.3.2 固定化酶的制備方法 取一定量褶皺二氧化硅,在水浴振蕩下使其均勻分散在1 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH值為8.0)中,加入OPH,在一定溫度下孵育一定時(shí)間,離心分離后收集沉淀,用去離子水清洗3次,真空干燥后得到固定化酶(OPH@SiO2NF)。

    1.3.3 載體及固定化酶的表征方法 通過(guò)掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM) 和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)對(duì)OPH@SiO2NF的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

    1.3.4 游離OPH和OPH@SiO2NF活性的測(cè)定 通過(guò)比色法測(cè)定游離OPH和OPH@SiO2NF的活性。OPH可將甲基對(duì)硫磷降解為對(duì)硝基苯酚(PNP),與Na2CO3會(huì)發(fā)生顏色變化,反應(yīng)方程見(jiàn)圖1。根據(jù)顏色變化來(lái)衡量游離OPH和OPH@SiO2NF的活性。

    具體測(cè)定條件:取適量游離OPH或固定化OPH@SiO2NF,加入至含有甲基對(duì)硫磷(5 μL 10 mg/mL)的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH值為8.0)中,于37 ℃反應(yīng)5 min,立即加入1 mL終止劑三氯乙酸(10%)終止反應(yīng),再加入1 mL碳酸鈉(10%)顯色,測(cè)定其在410 nm處的吸光度。根據(jù)PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線得到PNP產(chǎn)量并計(jì)算酶活性。1個(gè)酶活性單位(U)定義:37 ℃反應(yīng)1 min產(chǎn)生1 μmol PNP所需的酶量。54C17866-9329-4820-953F-6EF8ACE3D55B

    1.3.5 OPH@SiO2NF和OPH的酶學(xué)性質(zhì)分析

    1.3.5.1 固定化酶的最適溫度 取一定量OPH@SiO2NF和OPH,在不同溫度的Tris-HCl緩沖液中孵育10 min后,測(cè)定其活性。

    1.3.5.2 固定化酶的最適pH值 取一定量OPH@SiO2NF和OPH,在不同pH值的緩沖液中孵育 10 min 后,在37 ℃測(cè)定其活性。

    1.3.5.3 有機(jī)溶劑耐受性的分析 取一定量OPH@SiO2NF和OPH,在不同濃度的甲醇和DMSO溶液中孵育10 min后,在37 ℃、最適pH值下測(cè)定其活性。

    1.3.5.4 熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性的分析 分別將一定量的OPH和OPH@SiO2NF置于Tris-HCl緩沖液(pH值為8.0)中,于50、60 ℃水浴條件下孵化,每隔一定時(shí)間測(cè)其剩余活性。分別將一定量的OPH和OPH@SiO2NF置于不同pH值的緩沖液(pH值為8.0)中,在50、60 ℃水浴條件下孵化,每隔一定時(shí)間測(cè)其剩余活性。

    1.3.5.5 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性分析 分別將一定量的OPH和OPH@SiO2NF置于Tris-HCl緩沖液(pH值為8.0)中,在37 ℃水浴條件下孵化,每隔一定時(shí)間測(cè)其剩余活性。

    1.3.6 OPH@SiO2NF和OPH在實(shí)際蔬果中對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解能力測(cè)定 在天津市本地蔬菜市場(chǎng)購(gòu)買蘋(píng)果和卷心菜,摘除腐敗葉片后,用清水清洗泥污后晾干。取2 g蘋(píng)果與卷心菜,噴灑上2 mL 1×10-5 mol/L甲基對(duì)硫磷,靜置1 h后,將蘋(píng)果與卷心菜置于5 mL含有5%丙酮的緩沖溶液中,于 25 ℃ 反應(yīng)1 h,再于8 000 r/min離心5 min,取上清于410 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算酶降解活性。

    1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化固定化條件

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以蛋白負(fù)載量和降解活性為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),利用正交試驗(yàn)對(duì)固定化過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SiO2NF的表征

    利用SEM考察SiO2NF的外部形貌 由圖2-a可以看出,SiO2NF為高度分散、尺寸均一(粒徑為 80~120 nm)的花狀納米顆粒,表面分布著開(kāi)放的孔道。SiO2NF的TEM(圖2-b)與SEM表征的納米顆粒尺寸一致。由TEM結(jié)果可以看出,SiO2NF表面的枝狀孔道深嵌入納米顆粒的中心位置。因此可見(jiàn),SiO2NF的放射狀孔道結(jié)構(gòu)可為后面固定化酶修飾提供較大的比表面積,并且在反應(yīng)體系中有利于傳質(zhì)。

    2.2 SiO2NF固定化OPH條件的篩選

    為篩選出最佳固定化OPH條件,通過(guò)單因素試驗(yàn)研究不同初始酶濃度和吸附時(shí)間2個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)固定化OPH酶活性的影響。由圖3可見(jiàn),隨著初始酶濃度的增大,蛋白負(fù)載量也呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì),但當(dāng)初始酶濃度超過(guò)55 mg/mL時(shí),蛋白負(fù)載量增大不明顯,而且在吸附16 h時(shí),所有酶濃度固定化OPH均可達(dá)到吸附平衡。

    由圖4可見(jiàn),當(dāng)初始酶濃度達(dá)到55 mg/mL后,降解活性不再上升,反而表現(xiàn)出降低趨勢(shì)。這是由于當(dāng)初始酶活性過(guò)高時(shí),酶分子在載體內(nèi)部的聚集程度增大,造成酶分子之間活性位點(diǎn)相互遮蓋,減少了底物、產(chǎn)物與活性位點(diǎn)接觸的機(jī)會(huì),導(dǎo)致降解活性降低[15-17]。

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取不同初始酶濃度、吸附時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速和固定化溫度4個(gè)因素,通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)固定化條件進(jìn)行優(yōu)化,取4因素4水平,設(shè)計(jì)L16正交試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。根據(jù)正交試驗(yàn)法對(duì)固定化條件的優(yōu)化結(jié)果及極差分析可知,上述4個(gè)因素對(duì)固定化酶蛋白負(fù)載量的影響順序依次為初始酶濃度>吸附時(shí)間>固定化溫度>搖床轉(zhuǎn)速,獲得蛋白負(fù)載量最優(yōu)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案是A4B3C2D2,上述4個(gè)因素對(duì)降解活性的影響順序依次為初始酶濃度>吸附時(shí)間>固定化溫度>搖床轉(zhuǎn)速,獲得降解活性最優(yōu)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案是A3B4C2D4,綜合考慮蛋白負(fù)載量和降解活性,后續(xù)固定化酶試驗(yàn)選擇初始酶濃度為55 mg/mL,吸附時(shí)間為16 h,搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min,固定化酶的溫度為35 ℃,此時(shí)的降解活性為 320 U/g,蛋白負(fù)載量為51 mg/g。

    2.3 游離OPH和OPH@SiO2NF酶學(xué)性能的分析

    2.3.1 游離OPH和OPH@SiO2NF的最適溫度 分別對(duì)游離OPH和OPH@SiO2NF的最適溫度進(jìn)行研究,由圖5可見(jiàn),游離OPH在40 ℃時(shí)表現(xiàn)出最高的相對(duì)活性,而固定化后的OPH@SiO2NF在45 ℃時(shí)的酶活性最高。OPH@SiO2NF的最適溫度要高于游離OPH,因?yàn)镺PH被固定于SiO2NF上后,限域作用的影響使其展現(xiàn)活性所需的活化能比游離OPH高。而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),游離的OPH和固定化OPH的相對(duì)活性都有不同程度的降低,這是由于酶分子在過(guò)高的溫度下會(huì)產(chǎn)生不可逆的構(gòu)象變化[18-20],使酶喪失活性。

    2.3.2 游離OPH和OPH@SiO2NF的最適pH值 對(duì)游離OPH和OPH@SiO2NF的最適pH值進(jìn)行研究,由圖6可見(jiàn),游離酶在pH值為8.5時(shí)的相對(duì)活性最高,達(dá)到95%,相比較而言,OPH@SiO2NF在pH值為7.5~9.0之間均表現(xiàn)出較高的相對(duì)活性,OPH@SiO2NF的最適pH值為8。從圖6還可以看出,通過(guò)固定化后的OPH在較寬的pH值范圍內(nèi)均能保持較高的酶活性,這是由于將OPH固定于SiO2NF的孔道中,為酶分子提供了良好的微環(huán)境,其酶活性中心得到保護(hù)[21],從而表現(xiàn)出穩(wěn)定的酶活性。

    2.4 游離OPH和OPH@SiO2NF穩(wěn)定性能的分析

    2.4.1 有機(jī)溶劑耐受性 OPH降解的有機(jī)磷農(nóng)藥及神經(jīng)毒劑等,通常需要丙酮、乙腈等有機(jī)溶劑對(duì)其進(jìn)行溶解,但此類極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑會(huì)引起OPH失活,因此選擇乙腈和丙酮溶劑對(duì)游離OPH和OPH@SiO2NF的有機(jī)溶劑耐受性進(jìn)行研究。由圖7可以看出,在25%乙腈溶液中,OPH@SiO2NF仍然可以保留80%的剩余活性,而游離OPH僅有50%的剩余活性。同樣的,在不同濃度的丙酮溶液中 OPH@SiO2NF的穩(wěn)定性也優(yōu)于游離OPH 這是因?yàn)楫?dāng)游離OPH直接接觸有機(jī)溶劑時(shí),其內(nèi)部蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)中的非極性基團(tuán)與極性溶劑作用,導(dǎo)致酶高級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生變化,使酶失活,而固定化的OPH、SiO2NF有效保護(hù)了酶分子,可以防止其構(gòu)象發(fā)生變化,從而有效保持酶活性[22]。54C17866-9329-4820-953F-6EF8ACE3D55B

    2.4.2 熱穩(wěn)定性 為了研究游離OPH和OPH@SiO2NF的熱穩(wěn)定性,將游離和固定化酶分別在50、60 ℃下孵育一段時(shí)間,再研究其剩余酶活性。由圖8可見(jiàn),在50、60 ℃下孵育4 h后,OPH@SiO2NF分別可以保持60.08%、52.91%的初始酶活性,而游離OPH在相同條件下分別僅能保持初始酶活性的32.83%、21.65%。試驗(yàn)結(jié)果表明,在高溫操作條件下,固定化酶的穩(wěn)定性比游離酶強(qiáng),OPH@SiO2NF可以抵抗高溫引發(fā)的酶分子構(gòu)象變化,這可能是由于OPH酶分子與二氧化硅納米花載體之間的靜電作用[22],使酶分子長(zhǎng)時(shí)間在高溫條件下仍能保持其原有構(gòu)象,從而維持較高的酶活性。

    2.4.3 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 對(duì)游離OPH和OPH@SiO2NF的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性進(jìn)行研究,由圖9可見(jiàn),游離酶儲(chǔ)藏至12 d時(shí),僅剩余初始酶活性的50%左右;而OPH@SiO2NF儲(chǔ)藏至20 d時(shí),仍可保持80%以上的初始酶活性。說(shuō)明固定化后的OPH穩(wěn)定性得到了明顯提升,這可能是由于固定在合適的載體上后,為OPH酶分子提供了適宜的微環(huán)境,并且可以抵御外界環(huán)境引發(fā)的酶構(gòu)象變化,從而使OPH在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍能維持較高的催化活性。

    2.5 OPH@SiO2NF用于蔬果有機(jī)磷農(nóng)藥的降解性能

    由于固定化酶方便回收分離再重復(fù)使用,可以有效降低酶的使用成本,因而受到廣泛關(guān)注,筆者對(duì)OPH@SiO2NF在實(shí)際蔬果中的應(yīng)用及重復(fù)使用性進(jìn)行了研究。由圖10、圖11可見(jiàn),OPH@SiO2NF用于蘋(píng)果、卷心菜中有機(jī)磷農(nóng)藥的降解,在重復(fù)使用10次后,剩余酶活性都保持在65%以上,降解率保持在60%以上。說(shuō)明OPH@SiO2NF具有良好的降解能力,而且重復(fù)使用性良好,多次重復(fù)使用后酶活性下降,可能由于在多次使用過(guò)程中對(duì)固定化酶回收的損失造成的。

    3 結(jié)論

    本研究成功制備了粒徑均一、高度分散的二氧化硅納米花,其表面分布著明顯的孔道結(jié)構(gòu)。利用吸附法固定化OPH,對(duì)固定化條件及固定化酶的酶學(xué)性能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),初始酶濃度為55 mg/mL,吸附時(shí)間為16 h,酶活性為320 U/g,蛋白負(fù)載量為 51 mg/g。固定化OPH的最適溫度為45 ℃,最適pH值為8,與游離OPH相比,在溫度為35~55 ℃、pH值為7.5~9.0的范圍內(nèi)均能保持較高的催化活性,同時(shí)表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性,在真實(shí)樣品中重復(fù)使用10次后,仍能保持初始活性的65%以上。由此可見(jiàn),OPH@SiO2NF具有在有機(jī)磷農(nóng)藥降解方面的應(yīng)用潛力,同時(shí)這種表面分布開(kāi)放的孔道結(jié)構(gòu)的二氧化硅納米花是一種良好的固定化酶載體,為保護(hù)酶分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)提供了良好的保護(hù),是一種十分具有發(fā)展?jié)摿Φ墓潭ɑd體,可以應(yīng)用于工業(yè)催化、藥物遞送、氣體吸附等更多的領(lǐng)域。

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