少見諾卡菌MALDI-TOF MS鑒定結果及臨床感染特點分析*

范 寧，謝立民，段雪紅△，魚麗萍，朱 琳

陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.神經(jīng)內科；3.藥學室，陜西咸陽 712000

諾卡菌是一類需氧放線菌，革蘭染色為細長絲狀、分枝明顯的陽性桿菌，抗酸染色弱陽性，易引起免疫功能低下人群感染。諾卡菌培養(yǎng)和鑒定比較困難，臨床分離率低。隨著分子生物學技術和質譜技術的應用，其臨床分離率逐漸升高，國內諾卡菌感染病例報道數(shù)量呈上升趨勢[1-4]，但由于諾卡菌感染患者的臨床表現(xiàn)無特異性，易被誤診為其他疾病，如結核病、真菌感染、腫瘤等，從而延誤了疾病治療的最佳時機，甚至導致死亡[1]。現(xiàn)對本院2019年6月至2021年6月分離的諾卡菌的鑒定結果及臨床感染特點進行分析。

1 材料與方法

1.1菌株來源 將本院2019年6月至2021年6月來源于11例患者的12株諾卡菌作為回顧性研究樣本，剔除同一患者相同部位重復菌株。校準菌株大腸埃希菌ATCC 8739，質控菌株皮疽諾卡菌ATCC 3308。

1.2儀器與試劑 VITEK MS全自動快速微生物質譜檢測系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)、16S rRNA基因測序儀[賽音生物技術(上海)有限公司]、哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖公司)。

1.3方法 將從11例患者分離到的可疑菌株利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)進行鑒定，同時與16S rRNA基因測序結果對照；對其中7株菌進行肉湯稀釋法藥敏試驗；收集確診患者的臨床資料及實驗室檢查結果。(1)質譜鑒定。選擇24～72 h疑似菌落利用VITEK MS質譜檢測系統(tǒng)進行鑒定，未嵌入培養(yǎng)基生長的菌落按一般細菌鑒定流程操作，嵌入培養(yǎng)基生長的菌落按“分枝桿菌、諾卡菌流程”鑒定。所有菌株均涂兩個點位。(2)基因測序。將菌株送賽音生物技術(上海)有限公司進行16S rRNA基因測序。

2 結 果

2.1臨床資料 11例患者中男5例、女6例，年齡48～80歲、平均(64.9±11.1)歲。64%(7/11)的患者有1種及以上基礎疾病，以高血壓、冠心病、支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和糖尿病為主。2例患者放棄治療，其中患者1有肝炎、糖尿病和COPD等基礎疾病，患者9合并支氣管擴張癥和肺癌。2例無基礎疾病者未使用抗菌藥物，病情好轉。共送檢標本12份，其中呼吸道標本9份(75%，9/12)，包括痰和肺泡灌洗液各4份及1份鼻腔分泌物。見表1。

表1 11例諾卡菌感染病例臨床特點

2.2實驗室檢查數(shù)據(jù) 64%的患者白細胞計數(shù)升高，36%的患者中性粒細胞比例升高，70%的患者C反應蛋白、超敏C反應蛋白水平升高，75%的患者降鈣素原水平升高。見表2。

表2 11例諾卡菌感染病例實驗室檢查結果

2.3病原菌培養(yǎng)及鑒定

2.3.1顯微鏡檢查 諾卡菌革蘭染色鏡下典型形態(tài)為成簇的細長絲狀、分枝明顯的陽性桿菌，見圖1；弱抗酸染色可見紅色細長絲狀菌體，見圖2。

圖1 革蘭染色形態(tài)(×1 000)

圖2 弱抗酸染色形態(tài)(×1 000)

2.3.2菌落形態(tài) 哥倫比亞血瓊脂平板置于5%CO2培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)2～7 d或者更長時間，可見微黃色或白色、干燥菌落(圖3)或表面褶皺/堆積卷曲、嵌入平板生長的菌落(圖4)。由于菌種不同，菌落形態(tài)之間存在差異。

圖3 哥倫比亞血平板干燥菌落(3 d)

圖4 哥倫比亞血平板嵌入生長菌落(5 d)

2.3.3菌種鑒定 經(jīng)基因測序，12株諾卡菌全部鑒定到種，VITEK MS質譜檢測系統(tǒng)鑒定到種為10株(83.3%)，未鑒定到種的包括1株天美諾卡菌(錯誤鑒定為亞洲諾卡菌)和1株豚鼠耳炎諾卡菌(無鑒定值)。見表3。

表3 VITEK MS質譜鑒定與16S rRNA基因測序結果

2.4藥敏試驗 對其中7株諾卡菌進行肉湯稀釋法藥敏試驗，結果顯示，7株諾卡菌對利奈唑胺、妥布霉素和阿米卡星全部敏感，對復方磺胺甲噁唑的敏感率為71.43%(5/7)，對阿莫西林/克拉維酸和喹諾酮類藥物全部耐藥。對頭孢曲松和亞胺培南敏感率均為57.14%(4/7)。7株諾卡菌肉湯稀釋法藥敏試驗最低抑菌濃度(MIC)結果見表4。

表4 7株諾卡菌肉湯稀釋法藥敏試驗MIC結果(μg/mL)

2.5治療與轉歸 11例患者中2例放棄治療；5例應用了復方磺胺甲噁唑，好轉出院；1例使用甲硝唑/頭孢西丁，好轉出院；1例使用美羅培南/米諾環(huán)素，癥狀緩解；2例未使用抗菌藥物。

3 討 論

諾卡菌生長緩慢，生化反應不活潑，菌種鑒定效果不佳[5]，對其鑒定到種水平通常難度較大。傳統(tǒng)的生化鑒定方法不僅費時費力，而且隨著菌種分類的不斷增多，鑒定到種水平受到了很大程度限制。近年來，MALDI-TOF MS技術由于其快速、準確、靈敏、自動化及高通量等特點，在微生物鑒定中的應用發(fā)展迅猛[6]。本研究利用VITEK MS系統(tǒng)鑒定諾卡菌，與16S rRNA基因測序結果基本一致，種鑒定率為83.3%(10/12)，由于天美諾卡菌在VITEK MS IVD V3.2版本數(shù)據(jù)庫中缺乏相關數(shù)據(jù)，被錯誤鑒定為亞洲諾卡菌，豚鼠耳炎諾卡菌由于菌落噬瓊脂生長嚴重，提取蛋白時存在瓊脂干擾，導致質譜圖譜分辨率降低而無法鑒定。陳瑩等[5]與王鵬等[6]報道利用MALDI-TOF MS技術可對85.1%和84.8%的諾卡菌鑒定到種，與本研究結果接近。美國的一項研究結果略低(76%)[7]。德國研究者則在質譜鑒定時經(jīng)甲酸和乙腈處理后，種鑒定率從74.4%提高到89.7%[8]。諾卡菌分類和鑒定比較復雜，雖然MALDI-TOF MS技術可以將最常見的諾卡菌準確鑒定至種或復合物水平，但其局限性是系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫不完善，對于不常見菌種，仍需通過基因測序鑒定。由于16S rRNA基因測序技術復雜且難以常規(guī)開展，CONVILLE等[9]建議使用更多的MALDI-TOF MS系統(tǒng)，作為第1步鑒定方法，驗證最常見的諾卡菌種，以減少需要基因測序或轉送到參考實驗室進行鑒定的菌株數(shù)量。隨著細菌分離種類的增多，數(shù)據(jù)庫的不斷更新，未來MALDI-TOF MS技術對于少見菌的鑒定準確率將提高。

不同國家和地區(qū)諾卡菌菌種分布有所不同。美國和澳大利亞最常見分離菌種為新諾卡菌，法國和泰國為皮疽諾卡菌，我國的北京和河北地區(qū)報道以圣喬治教堂諾卡菌最常見[5]。本研究以皮疽諾卡菌(41.7%，5/12)最多，其次為圣喬治教堂諾卡菌(16.7%,2/12)，與HUANG等[10]報道結果基本一致。由于國內與國外文獻關于諾卡菌報道的樣本量偏少，菌種分布的差異可能還需進一步研究、證實。

不同諾卡菌的感染部位和感染途徑有所差異，如膿腫諾卡菌、皮疽諾卡菌和蓋爾森基興諾卡菌主要造成肺部感染和播散性感染，巴西諾卡菌則常引起皮膚感染[2]。本研究1例腿部感染患者即由巴西諾卡菌引起。肺是諾卡菌最常侵犯的器官，可導致肺諾卡菌病[11]。本研究12株諾卡菌以呼吸道標本占比最高，為75%(9/12)。本研究1株天美諾卡菌分離自肺泡灌洗液，該菌是2007年在日本新發(fā)現(xiàn)的菌種，目前僅有4例報道[12-13]。

文獻[14]報道，諾卡菌感染者中，免疫功能低下者較非免疫功能低下者病情更重，病死率更高，但二者臨床表現(xiàn)無差異。本研究中64%(7/11)的患者有1種及以上基礎疾病。2例放棄治療者為典型的免疫功能低下人群，其中患者1患有肝炎、糖尿病和COPD，患者9患有支氣管擴張癥和肺癌，且二者年齡均超過70歲。2例無基礎疾病者未使用抗菌藥物，其中1例經(jīng)鼻息肉摘除術后，通過鹽水沖洗、霧化治療后好轉出院，隨訪治療效果較好，考慮與局部病灶未擴散，手術治療效果較好及患者無基礎疾病有關。另1例僅針對呼吸道癥狀對癥治療后出院，不排除標本污染或者定植可能。

目前，治療諾卡菌感染首選使用磺胺類藥物，但本研究中諾卡菌對復方磺胺甲噁唑的耐藥率為28.57%，高于黃磊等[15]的報道，不同于文獻[16]報道的全部敏感，應引起重視。

綜上所述，本院分離的諾卡菌以皮疽諾卡菌為主，肺部感染為主要感染方式，患者多患有1種及以上基礎疾病，所以當臨床使用常見抗菌藥物效果不佳，患者伴有基礎疾病或使用免疫抑制劑時應考慮諾卡菌感染的可能。MALDI-TOF MS技術可對臨床少見的諾卡菌進行快速鑒定，實驗室應逐步開展諾卡菌藥敏試驗，為臨床合理用藥提供可靠依據(jù)。

志謝：本研究16S rRNA基因測序及諾卡菌藥敏試驗均由上海市東方醫(yī)院檢驗科郭建老師支持完成！