開(kāi)菲爾粒中微生物對(duì)苯并（α）芘的非靶向代謝組學(xué) 分析

古麗加馬力·艾薩 邢軍 李安 張瑞

（1. 新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830054；2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 烏魯木齊 830000）

開(kāi)菲爾粒（Kerfir grains）是傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品——開(kāi)菲爾（kefir）的發(fā)酵劑，其主要成分除黏性多糖（由半乳糖和葡萄糖構(gòu)成）外，還有大量的水和少量蛋白、脂質(zhì)等成分［1-2］。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究表明新疆傳統(tǒng)發(fā)酵劑開(kāi)菲爾粒在屬水平上的發(fā)酵優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要有乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和奈瑟氏菌屬（Neisseria）等［3］，微生物的相互適應(yīng)和協(xié)同作用聚集成了復(fù)雜的菌相，使開(kāi)菲爾粒形成了整體“戰(zhàn)斗力”，能夠抑制雜菌和致病菌的溢生，特有的黏多糖能夠保護(hù)開(kāi)菲爾粒不受外界微生物侵染［4-5］，使其具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和抗污染能力，因此開(kāi)菲爾?？梢宰鳛橐粋€(gè)相對(duì)較為穩(wěn)定的生物反應(yīng)器［6-7］。開(kāi)菲爾發(fā)酵乳制品具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有消化性很高的乳蛋白質(zhì)和乳脂肪。蛋白質(zhì)中水溶性氮和氨基酸含量高，發(fā)酵過(guò)程中基本無(wú)損失；脂肪球能夠充分乳化，更易消化吸收，游離脂肪酸和揮發(fā)性脂肪酸含量高，風(fēng)味良好。另外開(kāi)菲爾由于多種有益微生物菌相作用使產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)比原乳有了很大提高，且易于消化，成為具有豐富營(yíng)養(yǎng)的保健食品［8-11］。

苯并（a）芘分子量較大，由5個(gè)苯環(huán)組成，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難溶于水。環(huán)境和食品中的苯并（a）芘，雖然可以通過(guò)一些物理、化學(xué)方法降解和清除，但易帶來(lái)二次污染，且成本較高，而生物降解是非常重要和有效的措施，具有經(jīng)濟(jì)、安全、方便的特點(diǎn)，其中最為關(guān)注的是微生物降解研究，并已取得了一定成績(jī)［12-16］。有研究表明，能夠降解苯并（a）芘的微生物，主要?dú)w屬于分枝桿菌屬（Mycobacterium）和假單胞菌屬（Pseudomonas），它們大多來(lái)自被污染的水體、土壤、海洋及其沉積物［17-19］。Zhao等［20］研究了乳酸菌菌株對(duì)苯并（α）芘的結(jié)合能力發(fā)現(xiàn)， L. plantarum CICC 22135和 L. pentosus CICC 23163菌株的結(jié)合率分別為66.76%和64.31%。Zhang［21］等人發(fā)現(xiàn)了乳酸菌具有去除在淀粉基食品中苯并（α）芘的潛在能力。

新疆地區(qū)少數(shù)民族自古以來(lái)就有制作和食用發(fā)酵乳制品的習(xí)慣，經(jīng)過(guò)幾千年的馴化，這些傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中保留了許多具有傳代性好，抗逆性強(qiáng)，風(fēng)味濃郁獨(dú)特對(duì)人體健康有益的乳酸菌及其它微生物菌群［22-24］。本文針對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵劑開(kāi)菲爾粒中微生物對(duì)多環(huán)芳烴類化合物苯并（α）芘的作用機(jī)制這一問(wèn)題，研究在苯并（α）芘脅迫作用下，開(kāi)菲爾粒微生物在發(fā)酵乳中代謝產(chǎn)物發(fā)生的特征性變化，采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)［25-26］，結(jié)合主成分分析和偏小二乘判別分析方法，尋找特征代謝產(chǎn)物，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋特征代謝物參與可能的代謝途徑，進(jìn)而推導(dǎo)出開(kāi)菲爾粒中微生物對(duì)苯并（α）芘降解的可行代謝物通路。研究可以為微生物對(duì)苯并（α）芘的作用機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)，為降低苯丙（a）芘對(duì)人體的危害提出可能的生物防治策略，進(jìn)而為開(kāi)菲爾發(fā)酵乳制品在食品工業(yè)中的合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 采集新疆阿勒泰地區(qū)牧民家庭手工制作的開(kāi)菲爾發(fā)酵乳制品，采集后裝入滅菌自封袋中冷凍保藏運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 苯并（α）芘（分析純，＞96%）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，甲醇、乙腈（均為色譜純，≥99.9%）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，甲基叔丁醚（分析純，≥99.9%）：購(gòu)自北京沃凱生物科技有限公司，甲酸銨（分析純，≥99.9%）購(gòu)自自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司，甲酸、丙酮、ddH2O等試劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 開(kāi)菲爾粒的活化與開(kāi)菲爾乳的制備 取適量開(kāi)菲爾發(fā)酵乳制品加入無(wú)菌水輕輕搖晃，清洗，過(guò)濾后留下傘狀開(kāi)菲爾粒備用。將清洗后的開(kāi)菲爾粒按1∶5的質(zhì)量比加入到滅菌牛乳中，在（37±1）℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)上述活化步驟活化1-2次，備用。

苯并（α）芘溶液的配置：將苯并（α）芘固體溶于丙酮中配制為1 mg/mL的苯并（α）芘貯備液，然后用水稀釋為苯并（α）芘濃度為100 μg/mL的工作液。

1.2.2 樣品制備及處理 樣品制備：將牛奶在80-82℃下加熱20 min后冷卻至40℃，然后以2%的接種量添加已活化的開(kāi)菲爾粒，取剛接種開(kāi)菲爾粒的牛乳為發(fā)酵0 h的樣品作為對(duì)照樣；在發(fā)酵乳中添加苯并（α）芘儲(chǔ)備液，使其濃度為50 μg/mL，樣品在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，從發(fā)酵8 h起每隔8 h取5個(gè)平行樣，直到發(fā)酵32 h共25份樣本，分別 編 號(hào) 為KBD001、KBD002…KBD005，KBD081、KBD082…KBD085，KBD161、KBD162…KBD165，依此類推，-80℃保藏備用。

發(fā)酵樣品的前處理：將所有樣本在4℃下融化（樣品量不足按照等比例縮減）；從每個(gè)樣本中取150 μL 于1.5 mL 離心管中；每個(gè)離心管加入200 μL 甲醇和200 μL 甲基叔丁基醚（MTBE），振蕩60 s，充分混勻；在12 000 r/min 4℃ 離心10 min，上清液使用0.22 μm 膜過(guò)濾，得到待測(cè)樣本；自每個(gè)待測(cè)樣本各取20 μL 混合成QC樣本（QC：quality control，用來(lái)校正混合樣品分析結(jié)果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤）。

1.2.3 LC-MS分析 色譜條件：儀器采用Thermo Ultimate 3000，使用ACQUITY UPLC? HSST3 1.8 μm（2.1 mm×150 mm）色譜柱，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)為8℃，以0.25 mL/min 的流速，40℃的柱溫，進(jìn)樣2 μL 進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相為正離子0.1%甲酸水（C）- 0.1%甲酸乙腈（D）；負(fù)離子5 mmol/L 甲酸銨水（A）-乙腈（B）。梯度洗脫程序?yàn)?-1 min，2% B/D；1-9 min，2%-50% B/D；9-12 min，50%-98% B/D；12-13.5 min，98% B/D；13.5-14 min，98%-2% B/D；14-20 min，2% D -正模式（14-17 min，2% B -負(fù) 模式）。

質(zhì)譜條件：儀器使用Thermo Q Exactive Focus，電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣 10 arb。毛細(xì)管溫度325℃，以分辨率70 000 進(jìn)行全掃描，掃描范圍81-1 000，并采用HCD 進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓為30 eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無(wú)必要的MS/MS信息。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 所有的LC-MS圖譜使用R（v3.1.3）的XCMS程序包進(jìn)行峰識(shí)別、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊得到包括質(zhì)核比（mass to charge ratio，m/z）和保留時(shí)間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣，進(jìn)而得到正負(fù)離子模式下的前體分子，導(dǎo)出數(shù)據(jù)至R語(yǔ)言statTarget包的QC-RFSC算法對(duì)各個(gè)樣本的特征（每個(gè)代謝物）信號(hào)峰進(jìn)行校正，使用R2和Q2進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）和最小二乘法判別分析PLS-DA（Partial Least Squares Discriminant Analysis），根據(jù)t檢驗(yàn)的P ＜0.05，同時(shí) PLS-DA 模型主成分的VIP 值＞1，進(jìn)行差異性代謝物的篩選。對(duì)篩選出的差異代謝物，通過(guò)KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫(kù)通路分析代謝物參與代謝途徑，推導(dǎo)出苯并（α）芘降解的代謝物通路。

2 結(jié)果

2.1 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段的開(kāi)菲爾代謝物主成分分析（PCA）

采用PCA分析對(duì)苯并（α）芘脅迫下的5個(gè)不同的發(fā)酵時(shí)間段的開(kāi)菲爾樣品進(jìn)行PCA分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。5個(gè)分組的點(diǎn)云（point cloud）明顯分布在不同區(qū)域，從總體上反映了各組樣品之間的總體差異和組內(nèi)樣品之間的變異度大小，5組不同發(fā)酵時(shí)間段的樣品組的平行樣品聚在一起，表明所有檢測(cè)具有良好的分析穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性；同時(shí)，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）解釋率分別為39%和14%，兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到53%，可見(jiàn)苯并（α）芘脅迫條件下不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)開(kāi)菲爾樣品之間分離趨勢(shì)較明顯，從整體上反映出這些樣品之間的代謝物差異。A組未添加苯并（α）芘的對(duì)照樣品與其他樣品代謝物之間存在明顯分離，可能是在苯并（α）芘脅迫下開(kāi)菲爾粒中微生物產(chǎn)生的謝物物所導(dǎo)致的。

圖1 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品主成分分析Fig. 1 Principal component analysis of the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

2.2 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段的開(kāi)菲爾代謝物PLS-DA分析

偏最小二乘判別分析是有監(jiān)督的，即分析時(shí)需要提供分組信息，能夠?qū)ふ易畲蟪潭葏^(qū)分樣品分組的因子（因子可以理解為所有代謝物的加權(quán)和）。如圖2，不同分組的樣本的點(diǎn)云分布在不同區(qū)域，說(shuō)明PLS-DA模型的判別效果較好，分組間應(yīng)該存在有顯著差異的代謝物，其結(jié)果與PCA相似，正離子模式下所構(gòu)建模型對(duì)開(kāi)菲爾代謝物的累積判別解釋能力R2Y=0.997，對(duì)模型預(yù)測(cè)能力Q2=0.971，這兩個(gè)指標(biāo)越接近于1時(shí)表示模型越穩(wěn)定可靠，模型的擬合度較好。在OPLS-DA的置換檢驗(yàn)中，我們用Q2作為檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，用置換的方法求得Q2的隨機(jī)分布。如圖3，如果箭頭所指的實(shí)際觀測(cè)Q2在隨機(jī)分布右側(cè)（觀測(cè)值明顯大于隨機(jī)值），說(shuō)明Q2是顯著的，模型的預(yù)測(cè)能力顯著。

圖2 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段段樣品PLS-DA得分圖Fig. 2 PLS-DA score map of samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

圖3 OPLS-DA置換檢驗(yàn)的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量（Q2）分布以及 P值Fig. 3 Distribution of the test statistic（Q2）of the OPLSDA substitution test and the P value

2.3 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段的開(kāi)菲爾代謝物

計(jì)算每個(gè)樣本內(nèi)各個(gè)代謝物的百分比含量，然后用堆積柱形圖可視化，能直觀的比較分組之間的代謝物組成結(jié)構(gòu)差異。圖4展示了含量排在前20的代謝物，橫坐標(biāo)是樣品名，根據(jù)分組順序排序，同時(shí)用不同顏色標(biāo)注了不同的分組樣本?？v坐標(biāo)表示各個(gè)代謝物的百分比含量，從上而下對(duì)應(yīng)代謝物的柱的順序與圖例一致，其余的代謝物被包括進(jìn)Others中。從圖中可以看出，有機(jī)酸類物質(zhì)占主導(dǎo)地位，檸檬酸類物質(zhì)在發(fā)酵初期積累最多，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少。發(fā)酵0 h的樣品中代謝物豐度與其他組分之間有較大差異，可能原因是發(fā)酵時(shí)間的不同與苯并（α）芘的脅迫所導(dǎo)致的。開(kāi)菲爾粒中微生物在8 h時(shí)磷酸膽堿類物質(zhì)減少，甘油磷酰膽堿類物質(zhì)增加，苯乙胺物質(zhì)在開(kāi)菲爾發(fā)酵8 h與24 h的含量較高。

圖4 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品中代謝物百分比堆積柱形圖Fig. 4 Stacked histogram of the percentages of metabolites in the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

在所有代謝物中，有的代謝物是在生物體內(nèi)扮演著特定角色的，比如激素、維生素等。我們將所有代謝物用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)br08001進(jìn)行注釋，得到代謝物所扮演的生物學(xué)角色，然后統(tǒng)計(jì)每個(gè)生物學(xué)角色的百分比含量，繪制百分比含量堆積柱形圖，如圖5所示。開(kāi)菲爾粒中微生物在經(jīng)過(guò)一系列代謝反應(yīng)過(guò)程之后，中間代謝產(chǎn)物逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轭惞檀碱愇镔|(zhì)，激素和遞質(zhì)，維生素，脂類物質(zhì)，核酸類物質(zhì)，碳水化合物以及有機(jī)酸類物質(zhì)。在發(fā)酵16 h時(shí)激素和遞質(zhì)類物質(zhì)也較之前有明顯遞增。

圖5 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階樣品扮演生物學(xué)角色的代謝物百分比Fig. 5 Percentage of metabolites playing a biological role in the samples of different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

2.4 特征代謝物（biomarker）的篩選

通過(guò)KEGG代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行映射，為了更直接地了解關(guān)鍵代謝物，使用箱圖比較來(lái)自5個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間段的開(kāi)菲爾粒中微生物代謝產(chǎn)物的含量豐度差異，結(jié)果見(jiàn)圖6，顯示具有極顯著差異排名前25的物質(zhì)。結(jié)果表明，胞核嘧啶、谷胱甘肽、4-胍基丁酸、胍丁胺、2-苯基乙醇、L-色氨酸、丙二酸、鞘氨醇、N-乙?；鵇-半乳糖胺、腺苷、X1-羧基乙烯基膦酸酯、N-乙酰膽堿、腺嘌吟、N6-乙酰L-賴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、肌氨酸、甲基丙二酸等代謝產(chǎn)物在對(duì)照組與苯并（α）芘脅迫組之間存在明顯差異。

圖6 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品代謝物差異箱式圖Fig.6 Box plot of the differences in metabolites of the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

同時(shí)為能夠?qū)ふ以谂袆e分析過(guò)程中作用（value importance in projection，VIP，重要性）最大的代謝物，將這些代謝物作為區(qū)分不同分組的biomaker。一般來(lái)說(shuō)，VIP大于1的代謝物對(duì)判別分析的貢獻(xiàn)是較大的，這些代謝物在分組間有較大差異。如圖7黃色區(qū)域中，鄰苯二甲酸（C8H6O4）、原兒茶酸 （（HO）2C6H3COOH）與苯乙酸（C8H8O）是校正后P＜0.05，VIP大于1的代謝物，這些代謝物在分組間有顯著差異，在PLS-DA中起到重要作用。

圖7 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品PLS-DA代謝物重要性圖Fig.7 Importance map of PLS-DA metabolites in the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

如圖6、7所示，對(duì)開(kāi)菲爾粒中微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的重要代謝物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示出原兒茶酸和鄰苯二甲酸雖然在含量圖中并未顯示，但在代謝物重要性中可以看出原兒茶酸與鄰苯二甲酸雖然含量不高，但在代謝過(guò)程中對(duì)代謝通路的判斷有著重要的方向引導(dǎo)。

結(jié)合圖1、2中PCA以及PLS-DA分析得出，在B組間明顯有差異代謝物的產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)通過(guò)LC-MS分析，深入研究了開(kāi)菲爾粒中微生物在對(duì)苯并（α）芘降解過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，其中通過(guò)圖3、4可明顯看出在開(kāi)菲爾粒中微生物在降解苯并（α）芘第8小時(shí)產(chǎn)生了苯乙酸等物質(zhì)。

2.5 降解菌代謝苯并（α）芘的途徑推測(cè)

富集分析是尋找在某個(gè)生物學(xué)過(guò)程中起關(guān)鍵作用的生物通路，從而揭示和理解生物學(xué)過(guò)程的基本分子機(jī)制。通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，可以獲得代謝物參與的代謝通路信息，不同發(fā)酵階段的開(kāi)菲爾乳中間代謝產(chǎn)物共注釋到56條代謝通路。對(duì)于代謝組數(shù)據(jù)，在富集分析之前，需要尋找特征代謝物，通常是那些在分組間有顯著差異（t檢驗(yàn)，P＜0.05）的代謝物。

為了了解苯并（α）芘脅迫下開(kāi)菲爾不同發(fā)酵階段關(guān)鍵的代謝途徑，通過(guò)計(jì)算這些代謝通路的過(guò)表達(dá)分析（over-representation analysis，ORA）P值，從而判斷顯著差異的代謝物是否在這些代謝通路中顯著富集。圖8中顯示了差異代謝物顯著富集的代謝通路。這些途徑包括：精氨酸和脯氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、嘧啶代謝、酪氨酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成等。顏色越深的通路表示這些代謝通路在重要代謝物鄰苯二甲酸、原兒茶酸以及苯乙酸在代謝過(guò)程中富集程度越大。

圖8 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品差異代謝物顯著富集的代謝通路（ORA富集分析）Fig.8 Metabolic pathways with significant enrichment of differential metabolites in the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress（ORA enrichment analysis）

即便關(guān)注的代謝物在某個(gè)通路中顯著富集，目前仍然不知道這些代謝物在這個(gè)代謝通路中是否起到關(guān)鍵作用，代謝物對(duì)代謝通路究竟有多大影響。拓?fù)浞治瞿軌蛴?jì)算顯著差異的代謝物在代謝通路中的作用大?。ㄓ肐mpact衡量）。圖9中虛線右側(cè)區(qū)域的代謝通路是ORA富集分析中顯著的代謝通路，縱坐標(biāo)展示了這些代謝通路在拓?fù)浞治鲋械淖饔么笮。浣Y(jié)果與ORA富集分析結(jié)果一致。由拓?fù)浞治鰣D顯示，原兒茶酸不僅在代謝過(guò)程中有著重要作用，同時(shí)原兒茶酸所在的這些代謝通路在苯并（α）芘降解的過(guò)程中也起到了關(guān)鍵性作用。

圖9 苯并（α）芘脅迫下不同發(fā)酵階段樣品差異代謝物顯著富集的代謝通路拓?fù)浞治鯢ig.9 Topological analysis of metabolic pathways with significant enrichment of different metabolites in the samples at different fermentation stages under benzo（α）pyrene stress

代謝通路圖能夠比較直觀的反映代謝物的上下游關(guān)系，作用模式，以及代謝通路的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，同時(shí)能找到與代謝物關(guān)聯(lián)的基因，是同時(shí)包含代謝物和基因的代謝通路（KEGG完整的代謝通路），有顏色的代謝物是在分組間有顯著差異的代謝物，顏色對(duì)應(yīng)分組，表示在對(duì)應(yīng)分組中代謝物含量較高（相對(duì)其它分組）。

經(jīng)過(guò)圖8、9的代謝通路顯著性分析，結(jié)合在PCA以及PLS-DA中分析得到的差異代謝物鄰苯二甲酸、原兒茶酸、苯乙酸、鄰苯二甲酸二異丙酯和苯酚等，可推斷開(kāi)菲爾粒中微生物在代謝苯并（α）芘時(shí)經(jīng)過(guò)的代謝通路，如圖10、11所示，苯乙酸在開(kāi)菲爾粒中微生物降解苯并（α）芘時(shí)所經(jīng)過(guò)的一條途徑為苯丙氨酸途徑，鄰苯二甲酸由鄰苯二甲酸二異丙酯通過(guò)鄰苯二甲酸途徑代謝產(chǎn)生。

圖10 苯丙氨酸途徑Fig. 10 Phenylalanine pathway

與空白對(duì)照樣比較，開(kāi)菲爾粒中微生物的代謝體系中發(fā)現(xiàn)5種物質(zhì)。分別為保留時(shí)間635.17、444.83、65.98、692.45和463.93 min的鄰苯二甲酸、原兒茶酸、苯乙酸、鄰苯二甲酸二異丙酯和苯酚。其中苯乙酸和苯酚推測(cè)為氫化肉桂酸進(jìn)一步氧化代謝所產(chǎn)生，而在有氧的情況下，鄰苯二甲酸首先被轉(zhuǎn)化為原兒茶酸，接著原兒茶酸在雙加氧酶的作用下被開(kāi)環(huán)，從而進(jìn)一步被利用［18］；而鄰苯二甲酸推測(cè)由鄰苯二甲酸二異丙酯代謝產(chǎn)生。而鄰苯二甲酸二異丙酯的存在推測(cè)是由1-羥基-2-萘甲酸在脫氫酶、雙加氧酶、脫氫異構(gòu)酶等一系列酶的作用下苯環(huán)裂解產(chǎn)生的［27］。

圖11 鄰苯二甲酸途徑Fig. 11 Phthalic acid pathway

3 討論

由于苯并（α）芘具有較強(qiáng)的致癌性、致突變性和致畸性，所以在研究高分子量多環(huán)芳烴的生物轉(zhuǎn)化中，主要集中在苯并（α）芘的降解領(lǐng)域中，馬靜等［28］研究得出假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌是將多環(huán)芳烴化合物降解成為水楊酸和鄰苯二酚等代謝產(chǎn)物最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)；分枝桿菌屬（Mycobacterium）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、糞產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、微球菌屬（Microcoecus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）［29］，是將多環(huán)芳烴化合物代謝成為鄰苯二甲酸和原兒茶酸再進(jìn)入三羧酸循環(huán)［30］。還有一些菌株同時(shí)擁有兩條甚至兩條以上的苯并（α）芘代謝路徑，如楊璐溪等［31］的研究表明新鞘氨醇桿菌US6-1以鄰苯二酚代謝路徑和原兒茶酸代謝路徑。

細(xì)菌降解苯并（α）芘的過(guò)程中，中間代謝產(chǎn)物變化快且累積少，代謝產(chǎn)物的分離難度也大，因此有些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)降解苯并（α）芘時(shí)出現(xiàn)的中間代謝產(chǎn)物，未能進(jìn)一步研究降解途徑，只有少數(shù)研究表明，分離到苯并（α）芘代謝的中間產(chǎn)物并對(duì)其降解途徑進(jìn)行了分析。Kamlesh等［32］在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis BMT4i’deki MTCC 9447）對(duì)苯并（α）芘的降解產(chǎn)物中檢測(cè)到了苯并（a）芘-11、12-環(huán)氧化物，苯并（a）芘順式7、8-二氫二醇等7種代謝產(chǎn)物，并由此推斷表明枯草芽孢桿菌中苯并（α）芘降解有多種途徑。苯并（α）芘在最初階段由氧化還原反應(yīng)活化，通過(guò)氫原子的還原和飽和碳原子中的碳-碳鍵被氧化而形成1-羥基-2-萘甲酸。而1-羥基-2-萘甲酸被認(rèn)為是多環(huán)芳烴生物降解的關(guān)鍵中間產(chǎn)物［27］。雖然在本研究中并未測(cè)得1-羥基-2-萘甲酸，但在許多推定芳烴雙加氧酶基因的研究可以支持這一推論［33-35］。而1-羥基-2-萘甲酸通?？梢酝ㄟ^(guò)“鄰苯二甲酸途徑”或“萘途徑”的兩種不同途徑進(jìn)行降解［34］。通過(guò)已經(jīng)測(cè)得的鄰苯二甲酸經(jīng)由“鄰苯二甲酸途徑”進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為原兒茶酸［36］，推測(cè)開(kāi)菲爾粒中微生物對(duì)苯并（α）芘的降解是經(jīng)過(guò)“鄰苯二甲酸途徑”代謝途徑。雖然1-羥基-2-萘甲酸通過(guò)“萘途徑”的代謝途徑可能產(chǎn)生的氫化肉桂酸并未檢出，但苯乙酸和苯酚的存在可以推斷出氫化肉桂酸為1-羥基-2-萘甲酸通過(guò)“萘途徑”代謝的降解產(chǎn)物。苯酚可以通過(guò)羥化酶基因的作用轉(zhuǎn)化成為兒茶酚進(jìn)入三羧酸（TCA）循環(huán)后被降解，羥化酶基因通過(guò)編碼苯酚降解途徑的第一個(gè)酶，負(fù)責(zé)將苯酚轉(zhuǎn)化為兒茶酚；將兒茶酚開(kāi)環(huán)裂解為T(mén)CA產(chǎn)物，是由鄰位和間位酶負(fù)責(zé)的；兒茶酚的進(jìn)一步降解具有不同的途徑和酶系統(tǒng)：鄰苯二酚2，3-雙加氧酶（間位裂解）或鄰苯二酚1，2-雙加氧酶（鄰位裂解）［37］。苯酚也可通過(guò)羥基被氧化為羧基形成糖醛酸。通過(guò)以上分析，推測(cè)開(kāi)菲爾粒中微生物在降解苯并（α）芘時(shí)具有“萘途徑”“鄰苯二甲酸途徑”“苯丙氨酸途徑”3條代謝途徑，最后進(jìn)入TCA循環(huán)。研究結(jié)果表明開(kāi)菲爾粒中微生物在降解苯并（α）芘方面具有較大潛力，可以為微生物對(duì)苯并（α）芘的作用機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)，可以為降低苯丙（a）芘對(duì)人體的危害提出可能的生物防治策略，為開(kāi)菲爾發(fā)酵乳制品在食品工業(yè)中的合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供研究依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究基于LC-MS 的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)添加苯并（α）芘發(fā)酵0 h、8 h、16 h、24 h和32 h 的5個(gè)發(fā)酵時(shí)間段樣品的差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。通過(guò)對(duì)差異代謝物和通路進(jìn)行相關(guān)性分析，獲得了鄰苯二甲酸、原兒茶酸、苯乙酸、鄰苯二甲酸二異丙酯和苯酚等特征代謝物。從以上5種物質(zhì)推測(cè)出開(kāi)菲爾粒中微生物在降解苯并（α）芘時(shí)可能經(jīng)過(guò)“萘途徑”“鄰苯二甲酸途徑”“苯丙氨酸途徑”3條代謝途徑，最后進(jìn)入TCA循環(huán)。