水相Cd2+在南美白對蝦體內(nèi)的富集及氧化應激特征

梅光明 朱羽莊, 楊盈悅, 顧 捷 張小軍 楊文鴿

(1. 寧波大學食品與藥學學院, 寧波 315800; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室, 舟山 316021;3. 浙江海洋大學食品與藥學學院, 舟山 316022)

Cd作為一種有害重金屬元素, 能干擾生物體各種代謝過程, 造成各組織器官不同程度的慢性損傷,引起腎臟損傷、抑制免疫系統(tǒng)、損害生殖系統(tǒng)、引起骨疾患和鈣代謝異常等毒性作用[1]。由于具有強穩(wěn)定性(生物半衰期長達10—30年)和強富集性, 環(huán)境中Cd能夠通過食物鏈傳遞進行生物累積和形態(tài)轉(zhuǎn)化, 最終誘發(fā)人類食物安全和健康風險問題[2,3]。受陸源工業(yè)污水和農(nóng)業(yè)活動排放的影響[4], 海洋作為環(huán)境中Cd污染最大的匯集地, 監(jiān)測顯示2019年全國448個直排海污染源Cd排放量達339.2 kg[5]。環(huán)境中Cd的污染脅迫也會誘發(fā)水生生物產(chǎn)生一些毒理效應, 如造成生物體內(nèi)的過氧化脅迫, 產(chǎn)生大量活性氧自由基, 導致體內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化、DNA斷裂和酶蛋白等生物大分子失活, 從而誘發(fā)機體多種損害[6—10]。由于生物種屬和生活習性的區(qū)別, 不同海洋生物對特定污染物的富集特征和耐受解毒機制也有較大差異。海洋貝類、甲殼類屬于底棲生物, 移動性較差, 屬于非選擇濾食性生物, 已有較多的研究表明蝦蛄(Oratosquilla oratoria)[11]、梭子蟹(Portunus trituberculatus)[12,13]等甲殼類和扇貝(Scallop)[14]、貽貝(Mytilus edulis)[15]等海洋貝類具有較強的Cd富集特性。目前已有較多的文獻報道了海洋生物中Cd污染調(diào)查監(jiān)測與食用風險評估方面的研究, 而在Cd高富集海洋生物特別是一些海洋甲殼類水生物的Cd富集與耐受解毒機理上研究不足?，F(xiàn)階段對生物體中Cd富集機理機制研究多集中于Cd超富集植物方面[16—19], 物種間的巨大差異,必然導致海洋水生物存在著不同于陸源植物的Cd富集機制。

細胞區(qū)隔化分布特征是生物體耐受和積累重金屬的重要機制之一。進入生物體組織內(nèi)的重金屬元素并不是都能被機體吸收利用并產(chǎn)生毒性, 而是在具有不同生物功能的各亞細胞器中進行區(qū)隔化分布, 通過與不同組分(重金屬敏感組分或解毒組分)結(jié)合來表現(xiàn)出不同的生物毒性和生物可利用性[20,21], 因此明確Cd在海洋生物體內(nèi)的區(qū)隔化微區(qū)分布可以提供有關(guān)富集及耐受Cd的信息, 從金屬元素的亞細胞分布水平來深入地解釋水生物高鎘積累機理。重金屬在水生生物體內(nèi)的亞細胞微區(qū)分布特征方面已有一些研究, 如尚德榮等[22]對條斑紫菜(Porphyra yezoensis)中砷的富集形態(tài)和亞細胞分布研究表明其砷含量分別為細胞液(占比80%)＞細胞壁(占比15%)＞細胞器(占比5%); 趙艷芳等[23]研究表明櫛孔扇貝(Chlamys farreri)內(nèi)臟、鰓和性腺組織的Cd主要分布在類金屬硫蛋白和細胞器中, 而閉殼肌組織中Cd主要分布在類金屬硫蛋白中; Zhao等[24]通過水蚤(Daphnia magna)的重金屬暴露試驗證實了Zn均勻分布在細胞碎片、細胞器、富金屬顆粒、熱敏蛋白和金屬硫蛋白中, 而60%的Cd與金屬硫蛋白結(jié)合; Li等[25]研究表明日本青鳉(Oryzias latipes)在Cr暴露富集后, 肝臟中積累的Cr元素 46%與熱穩(wěn)定蛋白組分有關(guān)。以上研究均表明當水生生物體內(nèi)重金屬累積過量時, 機體會通過自身的結(jié)合分配調(diào)節(jié)機制, 降低生物利用率, 緩解對機體的毒性作用。此外, 生物機體在外界環(huán)境改變或污染物脅迫下會產(chǎn)生一系列應激反應, 如免疫系統(tǒng)[26]和抗氧化防御系統(tǒng)[27,28]等發(fā)生變化, 在造成生物學功能不利影響的同時, 也是自身對周圍環(huán)境改變或體內(nèi)過量污染物積累的防御和調(diào)節(jié)適應機制, 對于重金屬的耐受和解毒上同樣具有重要作用。研究表明環(huán)境中Cd污染脅迫對草魚(Ctenopharyngodon idellus)[29]、金頭鯛(Sparus aurata)[30]、貽貝[31]和海鱸(Dicentrarchus labrax)[32]等水生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、CAT和谷胱甘肽(Glutathione, GSH)等酶活力改變與暴露劑量或時間存在顯著的依賴關(guān)系。目前從重金屬元素的亞細胞微區(qū)分布特征結(jié)合氧化應激效應來闡述Cd在海洋甲殼類生物的特異性富集過程還沒有報道。

南美白對蝦作為典型的海洋甲殼類代表物種,是我國沿海地區(qū)海水蝦類養(yǎng)殖的主導品種之一, 養(yǎng)殖經(jīng)濟效益顯著。由于其喜好生活在環(huán)境底棲中,極易受環(huán)境污染影響, 闡明其對環(huán)境中Cd元素的富集代謝及氧化應激特征, 對了解其他海洋甲殼類生物的高鎘富集特性及富集機理方面具有重要參考意義。本研究以南美白對蝦為試驗對象, 應用雙箱動力學模型設置水環(huán)境下不同Cd暴露水平的富集吸收與清水凈化釋放試驗, 研究Cd的富集與代謝動力學過程, 分析不同暴露時間點下的Cd元素亞細胞微區(qū)分布特征和抗氧化應激響應情況, 以期為闡述甲殼類海洋生物對環(huán)境中Cd元素的富集與分布特征, 初步了解Cd富集可能性機理, 為海洋甲殼類Cd污染風險評價與環(huán)境控制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用健康海水養(yǎng)殖南美白對蝦取自浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒島海水養(yǎng)殖基地, 個體體長8—10 cm、體重10—14 g/尾。養(yǎng)殖海水取自浙江省舟山市普陀區(qū)西閃島附近海域, 經(jīng)充分沉降去泥沙后作為后續(xù)試驗用水體。海水鹽度為24.2, pH為8.1, 溶解氧為8.65 mg/L, Cd本底濃度為0.04 μg/L。

1.2 儀器與試劑

7900型ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國安捷倫), UV-3100 BPC紫外可見分光光度計(上海美譜達公司), Ethos one微波消解儀(德國Milestone公司), Avanti JXN-30高速冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特公司), Mili-Q Element純水機(美國密理博公司), 硝酸(色譜純, 上海起發(fā)實驗試劑有限公司), 鎘元素標準儲備液(1000 μg/mL, GBW 10050642, 國家有色金屬及電子材料分析測試中心), Tris (純度＞99%, 北京索萊寶科技有限公司),NaCl (純度＞99%, 國藥集團化學試劑有限公司),PMSF (純度≥98%, 美國Sigma公司), DTT [純度99.5%, 阿拉丁試劑(上海)有限公司], 大蝦粉(GBW10050, 地球物理地球化學勘查研究所), 總蛋白含量、GPx、GST和CAT測定試劑盒(南京建成生物有限公司)。

1.3 實驗方法

鎘的富集與凈化動力學試驗南美白對蝦運回實驗室后, 先在海水中暫養(yǎng)24h, 不間斷充氧,選取初始體重均為(12±2) g的健康有活力的對蝦個體(約占暫養(yǎng)總數(shù)的80%)進行后續(xù)分組試驗。Cd的富集階段: 采用半靜態(tài)暴露法模型, 在預先經(jīng)10 g/m3高錳酸鉀溶液消毒處理并清洗干凈的聚乙烯養(yǎng)殖箱(80 cm×60 cm×60 cm)中進行。設置1個對照組(自然海水組)和低、中、高3個不同Cd濃度的暴露試驗組, 每組試驗設置3個平行, 每個養(yǎng)殖箱中試驗海水40 L、投放約110尾南白白對蝦。結(jié)合《GB 11607-1989 漁業(yè)水質(zhì)》中規(guī)定漁業(yè)用水Cd濃度不高于0.005 mg/L的要求和預實驗得出Cd2+對南美白對蝦72h半致死濃度LC50為0.42 mg/L, 采用1000 μg/mL的Cd標準溶液調(diào)整得到Cd濃度分別為0.002、0.02和0.2 mg/L的3個暴露試驗組。控制環(huán)境溫度為(22±2)℃、濕度為75%—90%。為避免進食飼料帶來的鎘攝入影響, 試驗期間不投喂餌料, 24h不間斷充氧, 每24h更換1/2體積的海水(調(diào)節(jié)保持該試驗組海水Cd濃度不變), 富集試驗共持續(xù)6d, 期間每天取樣, 每個養(yǎng)殖箱采集對蝦8尾, 去殼后取肌肉和蝦胰腺等內(nèi)臟組織, 經(jīng)玻璃勻漿器勻漿后-18℃保存待用。

Cd的釋放凈化階段: 在富集試驗結(jié)束后, 將剩余活體南美白對蝦先經(jīng)自然海水沖洗體表后迅速轉(zhuǎn)移至自然海水中進行Cd的釋放凈化試驗。凈化試驗持續(xù)4d, 期間不投喂餌料, 24h不間斷充氧, 每24h更換1/2體積的新鮮海水。期間連續(xù)每天從各養(yǎng)殖箱采集對蝦8尾, 去殼后取肌肉和肝胰腺等內(nèi)臟團組織, 經(jīng)玻璃勻漿器勻漿后-18℃保存待用。

Cd含量測定參照GB 5009.268-2016[33]進行。采用微波消解前處理樣品、ICP-MS定量測定,同時做試劑空白實驗和采用大蝦粉GBW10050質(zhì)控樣進行結(jié)果質(zhì)量控制。檢測限為0.002 mg/kg, 質(zhì)控樣測定結(jié)果每次均應在參考值(0.039±0.002) mg/kg范圍內(nèi), 才表明該批次樣品測定結(jié)果有效。

Cd的亞細胞微區(qū)分布測定采用PAN等[34]的亞細胞分離方法稍加修改, 取3.0 g肝胰腺等內(nèi)臟團組織樣品加入15 mL pH 8.0的0.02 mol/L Tris緩沖液(內(nèi)含0.01 mol/L NaCl、0.1 mmol/L DTT和0.1 mmol/L PMSF), 在4℃冰浴下進行勻漿, 勻漿后于3℃、1450×g離心下15min, 得上清液S1和沉淀物P1; P1用1 mol/L的NaOH在80℃下加熱消化10min,再于3℃、8000×g離心10min后, 收集沉淀P2為MRG組分, 上清液S2為CD; 上清液S1繼續(xù)于3℃、14000×g離心1h, 收集沉淀P3和上清液S3, P3為ORG組分, S3經(jīng)過80℃熱處理10min后, HSP發(fā)生熱變性, 用冰水冷卻后, 于3℃、10000×g離心, 最后的上清液S4為MTLP, 沉淀物P4為HSP。取分離得到的各亞細胞組分測定Cd含量。本研究取高濃度暴露組(0.2 mg/L)試驗條件下的對蝦內(nèi)臟組織樣品,采用該方法亞細胞微區(qū)分布測定。

抗氧化酶酶活的測定取1.0 g肌肉和肝胰腺等內(nèi)臟團組織用玻璃勻漿器在冰浴下研磨勻漿后, 加入10 mL的在4℃下預冷的0.86%生理鹽水, 混勻后制備成10%勻漿液, 在4℃、8000 r/min的條件下離心15min, 取上清液立即進行總蛋白質(zhì)和GPx、GSH和CAT的酶活力測定, 測定步驟按照相關(guān)試劑盒使用說明操作, 酶活單位采用U/(mg·prot)表示。經(jīng)測定, 自然海水組暫養(yǎng)期間南美白對蝦肌肉和內(nèi)臟組織中GPx、GSH和CAT等抗氧化酶酶活力變化均不顯著(P＞0.05), 因此以水相Cd2+暴露之前(第0d)各組織中抗氧化酶酶活力為初始值來比較富集凈化期間的酶活力變化情況。

鎘的富集及凈化排出動力學特征參照文獻[35], 采用雙箱動力學模型來模擬Cd在南美白對蝦體內(nèi)的富集及排出動力學過程。該模型主要公式如下:

(1) 富集方程(0＜t＜t*)

(2) 排出方程(t＞t*)

式中,t為試驗持續(xù)時長(d),t*為富集結(jié)束時間(d),C0為實驗進行前生物體中元素含量(mg/kg),Cw為環(huán)境元素濃度(mg/kg), k1為生物吸收速率常數(shù),k2為生物釋放速率常數(shù),CA為生物體中Cd含量(mg/kg), k1和k2由富集方程(1)和排出方程(2)通過非線性曲線擬合結(jié)果得出。

(3) 生物富集因子(Bioaccumulation Factor,BCF)計算公式為(富集和排出為平衡狀態(tài)時):

(4) 生物學半衰期(B1/2)生物體內(nèi)該元素濃度降為初始點的1/2所花費的時長, 計算公式為:

(5) 富集排出為平衡狀態(tài)時生物體內(nèi)金屬元素含量(CAmax)計算公式為:

數(shù)據(jù)處理與分析方法組織中的Cd含量均以濕重計, 采用 Excel 2010 和 SPSS 26.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析, 所有數(shù)據(jù)3次重復測定, 結(jié)果采用平均值加標準偏差表示, 使用Origin8.0對數(shù)據(jù)進行非線性曲線擬合。

2 結(jié)果

2.1 水相環(huán)境中Cd2+在南美白對蝦組織中的富集與凈化特征

如圖 1所示, 在各暴露組下, 組織中Cd含量與富集持續(xù)時間之間呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.999,P＜0.01), Cd含量隨著富集時間的延長呈現(xiàn)出不斷的增長趨勢。從低濃度到高濃度暴露組, 內(nèi)臟組織中Cd富集量均在富集階段的中后期出現(xiàn)了一個較大增幅點, 分別出現(xiàn)在第5、第5和第4天, 較前一個富集時間下Cd含量分別增長了51.2%、61.9%和142%。肌肉組織中Cd富集量在低劑量暴露第4天和高劑量暴露第5天也均出現(xiàn)了一個明顯的增長,較前一個富集時間下Cd含量分別增長了34.8%和57.8%。在富集試驗結(jié)束時, 從低濃度到高濃度3個劑量水平下的暴露試驗中, 內(nèi)臟組織中Cd含量分別為0.669、1.98和19.5 mg/kg, 達到初始值的6.6、19.6和192.8倍, 肌肉組織中Cd含量分別為0.0039、0.012和0.17 mg/kg, 達到初始值3.0、9.2和128.2倍。

圖1 不同暴露劑量下南美白對蝦內(nèi)臟和肌肉組織中Cd的富集和釋放曲線Fig. 1 Enrichment and release curves of Cd in the viscera and muscle tissue of Litopenaeus vannamei at different exposed doses

在持續(xù)4d的凈化實驗中, 低、中劑量暴露組的內(nèi)臟組織中Cd含量呈持續(xù)下降趨勢, 而高劑量暴露組Cd含量在凈化期第1天仍處于上升并達到峰值,之后呈下降趨勢; 至凈化試驗結(jié)束時, 內(nèi)臟組織中Cd含量分別為0.50、1.76和16.17 mg/kg, 與富集結(jié)束時的內(nèi)臟組織中Cd含量相比, 凈化試驗對內(nèi)臟Cd富集量有一定程度的清除, 消除率分別為24.8%、10.9%和16.9%。對肌肉組織而言, 在低劑量暴露組下Cd含量在前3d的凈化期內(nèi)呈逐漸下降趨勢, 在第4天凈化結(jié)束時略有上升; 在中濃度暴露組下肌肉中Cd含量在富集第1天出現(xiàn)上升趨勢, 后續(xù)3d的凈化期內(nèi)又逐漸下降; 高劑量暴露組在后續(xù)的凈化期內(nèi), Cd含量在0.167—0.175 mg/kg, 無顯著變化(P＞0.05); 至凈化試驗結(jié)束時, 3個暴露組試驗下肌肉組織中Cd含量分別為0.0035、0.011和0.17 mg/kg, 與富集試驗結(jié)束時相比, 低劑量和高劑量暴露試驗的肌肉組織中Cd含量經(jīng)凈化試驗后獲得的清除率分別為10.26%和10.83%, 而高劑量暴露組中沒有觀察到Cd清除凈化效果, 反而小幅度增加了4.14%。

在不同暴露時間下南美白對蝦Cd富集量與水相中Cd劑量水平之間的相關(guān)性分析結(jié)果(表 1)顯示: 在不同暴露時間點下, 各組織中Cd富集量均與暴露劑量之間存在顯著性差異(P＜0.05); 隨著富集過程的持續(xù), 內(nèi)臟組織中Cd富集量與水相Cd暴露劑量之間的顯著性不斷提高(P值不斷減小), 而肌肉組織中Cd富集量與水相Cd暴露劑量之間的顯著性逐漸下降(P值不斷增加)。這說明南美白對蝦組織中Cd含量與環(huán)境水相中Cd污染水平密切相關(guān), 也反映出暴露時間對內(nèi)臟組織中Cd富集的影響比對肌肉組織要大, 二者在重金屬Cd富集速率上有較大差異。

表1 南美白對蝦體內(nèi)Cd富集量與水相暴露劑量間的相關(guān)性分析Tab. 1 Linear correlations between Cd content in Litopenaeus vannamei and Cd concentration in water during the experiment of enrichment phase

根據(jù)雙箱動力學模型, 經(jīng)曲線擬合并計算后得到南美白對蝦內(nèi)臟和肌肉組織對水相環(huán)境中Cd2+的富集和凈化動力學參數(shù)(表 2)。在Cd2+濃度0.002—0.2 mg/L的3個暴露水平下, 內(nèi)臟和肌肉組織對Cd的吸收速率常數(shù)k1分別為13.90—47.08和0.13—0.21(平均值分別為24.99和0.16), 兩者對Cd的釋放速率常數(shù)k2分別為0.01—0.17和0.01—0.05(平均值0.07和0.03), k1和k2值均隨著暴露水體中Cd2+濃度的增加而減小; 內(nèi)臟和肌肉組織對Cd的BCF分別為346.18—1158.33和4.67—13.00(平均值為688.17和8.83),CAmax為0.69—231.67和0.01—2.60(平均值81.19和0.93), B1/2為5.10—57.76和15.40—69.31(平均值為30.20和41.83), 三者均隨著暴露水體中Cd2+濃度的增加而增大。

表2 南美白對蝦內(nèi)臟和肌肉對Cd的富集動力學參數(shù)Tab. 2 Kinetic parameters of Cd enrichment in Litopenaeus vannamei

2.2 Cd在內(nèi)臟組織中的亞細胞微區(qū)分布

重金屬元素在生物體內(nèi)的亞細胞微區(qū)分布情況可以反映其生物毒性和生物可利用性。Wallace等[20,21]提出可以將生物體內(nèi)重金屬元素的分布微區(qū)分成MRG、HSP、MTLP、CD和ORG共5個部分, 其中ORG和HSP部分為重金屬敏感組分,MTLP和MRG是生物體的解毒組分。為了明確水相Cd暴露在南美白對蝦細胞組分中的微區(qū)分布情況, 選取0.2 mg/L的高劑量暴露組, 在富集階段的不同時間點下取樣分析Cd在內(nèi)臟組織中的亞細胞微區(qū)分布情況, 得到亞細胞組分中Cd的含量占比情況見表 3所示。在各個暴露階段下Cd主要儲存于MTLP中(占比52%以上), 其次是CD和ORG, MRG和HSP中的Cd含量占比較少。MTLP中Cd含量百分比隨著富集時間的增加呈升高的趨勢, 由初始的52.02%升至了58.64%(P＜0.05); ORG中Cd含量百分占比也隨富集時間的增加而一定程度增加, 由9.47%增至12.19%(P＞0.05); HSP中Cd含量百分占比從對照組的0.65%升至2.15%(P＜0.05); 相反的是CD 和MRG中的Cd含量百分比隨著富集時間的延長在不斷下降, 分別由37.26%下降至26.43%(P＜0.05)和由0.93%下降至0.59%(P＜0.05)。

表3 南美白對蝦內(nèi)臟組織各亞細胞組分中Cd含量百分比Tab. 3 The percentage of Cd in five subcellular compartments in visceral tissue of Litopenaeus vannamei

2.3 Cd脅迫對氧化應激效應的影響

如圖 2所示, 自然海水組下南美白對蝦內(nèi)臟和肌肉組織中CAT酶活分別為4.25和2.33 U/(mg·prot)。隨著富集時間的延長, CAT酶活與對照組相比均呈顯著增加趨勢(P＜0.05), 且均在富集階段的最后1d達到峰值[分別為10.59和6.85 U/(mg·prot)], 相對于對照組分別提高了149%和194%, 此時內(nèi)臟組織中CAT活性與前5d富集期相比均顯著增加(P＜0.05), 肌肉組織中CAT活性與前4d相比也均顯著增加(P＜0.05), 說明CAT酶活性在富集階段被明顯激活。在凈化釋放階段, CAT酶活力隨著凈化過程的持續(xù), 都呈現(xiàn)出不斷下降趨勢; 經(jīng)過4d的凈化期后,與富集階段第6天下的CAT活性峰值相比較, 內(nèi)臟和肌肉組織分別降低了13.6%和23.4%, 但仍明顯高于對照組(P＜0.05)。結(jié)合圖 1c和圖 1f, 在凈化釋放階段, 高劑量暴露組下南美白對蝦各組織中Cd含量仍是處于高含量水平, 從而可能導致釋放階段下CAT仍處于被激活的狀態(tài)。

圖2 Cd2+對南美白對蝦組織中CAT活性的影響Fig. 2 The effect of Cd2+ on CAT enzyme activity of Litopenaeus vannamei

如圖 3所示, 南美白對蝦內(nèi)臟和肌肉組織中GST酶活初始值分別為5.69和3.20 U/(mg·prot)。隨著富集時間的延長, 各組織中GST酶活呈現(xiàn)出不斷增加趨勢, 其中內(nèi)臟組織在富集結(jié)束時GST酶活顯著增加(P＜0.05), 達到峰值10.16 U/(mg·prot), 與對照組比較提高了78.6%, 之后在凈化釋放階段呈下降趨勢; 肌肉組織中GST酶活在富集結(jié)束時也顯著增加(P＜0.05), 之后在凈化期內(nèi)依然處于不斷上升趨勢, 并在凈化第2天達到酶活力峰值7.06 U/(mg·prot),此時與對照組比較提高了120.6%。在釋放試驗結(jié)束時, 內(nèi)臟和肌肉組織中GST酶活分別為8.06和6.62 U/(mg·prot), 與峰值相比分別下降了20.7%和6.20%, 二者均顯著高于對照組下GST酶活水平(P＜0.05)。

圖3 Cd2+對南美白對蝦組織中GST活性的影響Fig. 3 The effect of Cd2+ on GST enzyme activity of Litopenaeus vannamei

富集暴露試驗前南美白對蝦內(nèi)臟和肌肉組織中GPx酶活初始值分別為8.05和6.67 U/(mg·prot)。隨著富集階段的持續(xù), 內(nèi)臟和肌肉組織中GPx酶活都呈現(xiàn)出不斷增加趨勢(圖 4)。肌肉組織中GPx酶活在富集期結(jié)束時達到峰值11.02 U/(mg·prot), 較初始酶活值顯著提高(P＜0.05), 增幅65.2%; 內(nèi)臟組織GPx酶活在富集階段也受到誘導而一直處于顯著增加趨勢(P＜0.05), 在釋放初期酶活依然處于上升趨勢, 經(jīng)過1d的釋放期后酶活達到峰值17.43 U/(mg·prot), 達到初始酶活的2.16倍。在凈化釋放階段, 肌肉組織中GPx酶活呈顯著下降趨勢(P＜0.05),至試驗結(jié)束時GPx酶活為7.71 U/(mg·prot), 與峰值相比降低了30.0%, 回落到與初始酶活無顯著差異水平(P＞0.05); 內(nèi)臟組織中GPx酶活在釋放階段無顯著變化(P＞0.05), 先于凈化期第1天 略有提升后又緩慢下降, 至試驗結(jié)束時GPx酶活為15.72 U/(mg·prot), 較試驗前的初始酶活值顯著提高(P＜0.05),增幅達95.3%。

圖4 Cd2+對南美白對蝦組織中GPx活性的影響Fig. 4 The effect of Cd2+ on GPx enzyme activity of Litopenaeus vannamei

3 討論

3.1 Cd在南美白對蝦體內(nèi)的富集與凈化動力學特征

通過建立Cd2+污染暴露與清水凈化動力學試驗, 本研究表明南美白對蝦內(nèi)臟和肌肉組織對水相Cd富集能力與環(huán)境暴露水平呈明顯的正向依賴關(guān)系, 內(nèi)臟組織對Cd的吸收速率、凈化速率、生物富集因子及平衡狀態(tài)時Cd含量均顯著高于肌肉組織,相同暴露劑量下前者的生物富集因子平均為后者的75.5倍, 而肌肉組織的Cd生物學半衰期又明顯比內(nèi)臟組織長, 說明肝胰腺等內(nèi)臟組織是南美白對蝦主要的環(huán)境Cd元素吸收與代謝組織。Zhang等[36]通過對巨指長臂蝦(Palaemon macrodactylus)的Cd暴露試驗也得出了Cd在巨指長臂蝦組織中呈明顯地濃度依賴性增加, 肝胰腺組織中的Cd含量可達腹部肌肉組織中近100倍, 該課題組也研究發(fā)現(xiàn)Zn和Hg兩種元素在脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)中的富集能力也呈現(xiàn)出鰓＞肝胰腺＞肌肉[37]; Xu等[38]發(fā)現(xiàn)Pb在日本鱘(Charybdis japonica)中的富集能力呈現(xiàn)出鰓＞肝胰腺＞卵巢、肌肉; Wang等[39]也同樣證實Pb元素在櫛孔扇貝中, 富集能力鰓＞內(nèi)臟＞肌肉。上述研究結(jié)果和本試驗得出的結(jié)論具有較強的一致性, 可能反映了金屬元素在水生物體內(nèi)的吸收、運輸和儲存過程大致為: 在水環(huán)境重金屬元素的急性暴露期間, 水生物會在第一時間通過鰓組織來吸收重金屬元素, 后續(xù)通過轉(zhuǎn)運到肝組織中進行解毒, 最后儲存蓄積在肌肉組織中。甲殼類生物對重金屬的積累主要通過三種途徑: 第一是呼吸作用, 鰓會吸收水體中的溶解態(tài)金屬, 再擴散至各組分; 第二是攝食作用, 重金屬通過食物隨消化系統(tǒng)進入生物體; 第三是滲透作用, 生物體與水之間存在的滲透交換作用使得金屬離子進入生物體[40]。富集初期, 從環(huán)境中吸收累積的Cd誘導生物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧等自由基, 進而組織中的抗氧化酶被誘導激活來實現(xiàn)自由基清除, 起到調(diào)節(jié)適應作用,因而在富集階段能夠持續(xù)不斷地吸收環(huán)境中的Cd,造成組織中Cd含量水平持續(xù)上升。隨著富集過程的持續(xù), 蓄積的高濃度Cd開始對生物體組織中的抗氧化酶酶活性產(chǎn)生抑制作用, 清除能力逐漸達到飽和, 大量自由基不能及時清除而導致細胞受損使酶活性降低, 使得Cd吸附速率降低, 當吸附速率小于釋放速率則可能出現(xiàn)Cd含量下降, 這也解釋了暴露組采用的Cd濃度越高其吸收速率常數(shù)k1值卻越低的原因。本試驗在6d的富集階段期, 內(nèi)臟和肌肉組織中的Cd含量持續(xù)上升, 說明還未達到吸附飽和狀態(tài)。在凈化釋放階段, 吸收速率和排除速率趨于平衡狀態(tài), 整體上Cd含量降低緩慢, 當吸附速率大于

釋放速率時還能導致在釋放階段Cd含量出現(xiàn)回升的可能。在凈化釋放階段, Cd的排出速率常數(shù)k2值遠遠小于富集階段的吸收速率常數(shù)k1, 導致生物半衰期也較長。

3.2 Cd在南美白對蝦內(nèi)臟組織中的亞細胞微區(qū)分布

本研究發(fā)現(xiàn)南美白對蝦內(nèi)臟組織中的Cd主要儲存于MTLP和CD, 還有少量部分存在于ORG、MRG和HSP。隨著富集過程的持續(xù), MTLP、ORG和HSP中Cd含量百分比逐漸升高, CD 和MRG中的Cd含量百分比呈逐漸下降趨勢, 說明在富集后期部分Cd從CD、MRG中轉(zhuǎn)移到了MTLP、ORG和HSP等亞細胞組分中。MTLP與金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)結(jié)構(gòu)類似, 為一類基因編碼的富含半胱氨酸的低分子量蛋白(6—7 kD), 在生物體內(nèi)可被重金屬誘導合成, 具有較強的金屬親和性, 可作為潛在重金屬暴露和毒性效應早期預警的主要生物標志物[41—44]。南美白對蝦內(nèi)臟組織MTLP中Cd含量百分比的升高說明該亞細胞組分與Cd元素的富集有明顯的相互作用, 這與Moksnes等[45]研究發(fā)現(xiàn)南美白對蝦肝臟細胞中的金屬硫蛋白MT誘導量與Cd的累積有著顯著相關(guān)性的結(jié)論相一致。趙艷芳等[23]發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝在Cd富集過程中不僅會累計在金屬硫蛋白MT中, MRG中Cd含量百分比也有顯著的上升趨勢, 說明MRG是貝類調(diào)解Cd的主要亞細胞組分。這一點與本研究得出南美白對蝦內(nèi)臟組織中MRG中Cd含量百分比有下降趨勢的結(jié)論有所不同, 這可能與不同物種對重金屬元素的調(diào)節(jié)機制存在差異有關(guān)。目前已有較多的研究證實了MTLP在部分雙殼貝類Cd儲存中發(fā)揮的重要作用,如翡翠貽貝(Perna viridis)約5%—25%的Cd、華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis) 20%—30%的Cd、櫛孔扇貝內(nèi)臟團、鰓、性腺和閉殼肌等組織中42.3%—84.6%的Cd均是與MTLP結(jié)合[23,34,46], Boudet 等[47]發(fā)現(xiàn)MT誘導表達是阿根廷白蝦(Palaemon argentinus)應對高濃度環(huán)境Cd暴露的主要途徑, Jorge[48]通過對南美白對蝦體內(nèi)MT基因進行克隆、表達和蛋白提取純化后, 發(fā)現(xiàn)南美白對蝦MT基因編碼為一種具有抗氧化能力并結(jié)合Cu和Cd的功能蛋白, 能夠抵消活性氧產(chǎn)生的氧化應激。本研究表明南美白對蝦內(nèi)臟組織中52%以上的Cd以MTLP相結(jié)合的形式儲存, 也證實了MTLP 在南美白對蝦體內(nèi)重金屬Cd富集過程中起到重要作用。CD組分主要包括組織碎片和細胞膜, 儲存了南美白對蝦內(nèi)臟組織中26.43%—37.26%的Cd, 說明CD也是受污染南美白對蝦體內(nèi)重金屬主要吸附位點, 王蕾[49]也研究發(fā)現(xiàn)CD同樣也是牡蠣體內(nèi)除MTLP組分外結(jié)合重金屬的最重要的亞細胞組分, CD組分對Cu (30.5%—40.3%)、Zn (30.1%—45.8%)和Pb (33.1%)有很好的結(jié)合能力。在富集階段, ORG中Cd含量百分占比由9.14%增至12.19%, 說明ORG也后期Cd富集中也起到了促進作用。已有研究指出溶酶體作為貽貝體內(nèi)被單層膜包被且含有水解酶的細胞器, 具有細胞內(nèi)消化功能, 儲存了細胞器中大部分的Cd[50]。南美白對蝦內(nèi)臟團中的消化腺細胞、性腺細胞等也同樣含有大量溶酶體, 胞內(nèi)消化功能較強, 豐富的溶酶體可能在ORG組分儲存Cd的過程中起到了重要作用。一般認為ORG和HSP為金屬敏感組分, 而MTLP和MRG對生物體內(nèi)重金屬解毒有幫助, 成為生物解毒組分[20,21]。隨著富集過程的持續(xù), MRG組分中的Cd含量占比呈下降趨勢, 而ORG和HSP兩種組分中的Cd含量占比逐漸上升, 說明富集后期更多的Cd開始轉(zhuǎn)移到與ORG和HSP等亞細胞敏感組分結(jié)合, 此時高濃度的Cd脅迫已經(jīng)對南美白對蝦產(chǎn)生了一定的毒性效應。Rainbow[51]研究也表明當結(jié)合在MTLP、MRG中的重金屬超過其容納量時, 過多的重金屬與其他亞細胞組分的結(jié)合, 才可能會導致毒性的產(chǎn)生。HSP是廣泛存在于原核與真核細胞內(nèi)的一類高度保守的蛋白質(zhì), 又稱為熱應激或熱休克蛋白, 根據(jù)分子量大小主要分為HSP90家族(83—90 kD)、HSP70家族(66—78 kD)、HSP60家族及小分子HSP家族(15—30 kD)和泛素[52]。已有研究發(fā)現(xiàn)Cd暴露能夠誘導褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)[53]、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[54]及河蜆(Corbicula fluminea)[55]中部分HSP家族基因的表達, 本研究發(fā)現(xiàn)在富集第4和第6天, HSP中Cd含量占比呈顯著升高變化(P＜0.05), 推測也可能是部分HSP基因被誘導表達的結(jié)果。當生物體細胞受到環(huán)境刺激時, 會引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性, 而HSP可與變性蛋白質(zhì)相結(jié)合, 修復錯誤折疊蛋白或加速其降解, 保持細胞自穩(wěn), 防止細胞受到損傷, 從而起到緩解重金屬毒性作用[56]。Cd污染暴露吸收后的亞細胞區(qū)隔化分布特征能夠有效減小生物體內(nèi)重金屬的生物可給性, 降低毒性損傷作用, 因而提高了其在生物體中的蓄積能力。在后期自然海水凈化期內(nèi), 南美白對蝦內(nèi)臟和肌肉組織中的Cd凈化釋放速率較低, 至凈化期結(jié)束時各組織中Cd含量依舊維持在較高水平而難以有效清除, 也與重金屬亞細胞組分區(qū)隔化形成的短期內(nèi)重金屬穩(wěn)態(tài)分布有一定關(guān)系。

3.3 Cd脅迫對引的南美白對蝦氧化應激效應

當生物體受到重金屬等污染物脅迫時, 活性氧含量會迅速上升, 若體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)不能及時將其清除, 將會形成細胞膜脂質(zhì)過氧化物, 造成機體氧化損傷[57]。GST、GPx、CAT和SOD是生物體抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶類, 起到清除體內(nèi)超氧自由基、實現(xiàn)解毒作用[58,59]。在Cd脅迫下, 南美白對蝦肝臟和肌肉組織中的3種抗氧化酶(GST、GPx和CAT)酶活在富集階段均持續(xù)顯著升高, 表明由于Cd脅迫已經(jīng)造成南美白對蝦體內(nèi)ROS含量顯著升高, 進而使得抗氧化酶被誘導激活。其他水生物體Cd暴露脅迫中也出現(xiàn)上述類似結(jié)果, 如王麗麗[60]研究Cd在蝦夷扇貝體內(nèi)的時空分布規(guī)律及對抗氧化防御系統(tǒng)的影響, 發(fā)現(xiàn)SOD和CAT這兩種酶對實驗設計的Cd濃度反應敏感, 呈現(xiàn)出“誘導-抑制”規(guī)律,王凡等[61]研究證實牙鲆(Japanese flounder)鰓組織中CAT對Cu污染表現(xiàn)出低濃度促進酶活力, 高濃度抑制酶活力。在凈化釋放階段, 由于組織中Cd含量依然處于較高水平, 使得3種抗氧化酶酶活與初始值相比依然處于被激活狀態(tài), 但伴隨著組織中Cd含量逐漸下降趨勢, 酶活也處于不斷下降狀態(tài); 在同一試驗組下肝臟組織中抗氧化酶酶活力明顯高于對應的肌肉組織, 這可能與內(nèi)臟組織在重金屬元素的消化、吸收和解毒等方面具有更高的代謝速率相關(guān), 進一步證實了肝臟等內(nèi)臟組織是最主要的解毒和代謝器官。隨著富集過程的持續(xù), Cd逐步激活南美白對蝦肌肉組織中的GST酶, 即使在釋放階段CAT酶也仍處于被激活上升的狀態(tài), 與該濃度暴露組下肌肉組織中Cd含量峰值出現(xiàn)在釋放階段第1天的情形類似, 說明釋放階段GST酶活調(diào)控可能在肌肉組織對Cd累積的適應性方面起到了重要作用。在4d凈化試驗結(jié)束時, 除南美白對蝦肌肉組織中GPx恢復至初始酶活水平外, 肌肉組織中CAT、GST及內(nèi)臟組織中CAT、GST和GPx的酶活值仍顯著高于對照組水平, 說明Cd脅迫期間造成的氧化損傷在短時間內(nèi)較難恢復。

4 結(jié)論

本文研究了水環(huán)境Cd2+暴露脅迫下南美白對蝦體內(nèi)的Cd富集與凈化動力學過程, 分析了Cd在內(nèi)臟組織富集后的亞細胞微區(qū)分布及組織中3種抗氧化酶(GST、GPx和CAT)的酶活變化特征。研究表明南美白對蝦對水環(huán)境中Cd的富集能力與水體暴露濃度呈明顯的正相關(guān)關(guān)系, 內(nèi)臟團是南美白對蝦最主要的Cd元素吸收與代謝組織, 其富集能力、富集速度和凈化速率均大于肌肉組織; Cd主要儲存于MTLP和CD組分中, 少部分存在于ORG、MRG和HSP中, 且隨著富集過程的持續(xù), MTLP、ORG和HSP中Cd含量百分比逐漸升高, CD 和MRG中的Cd含量百分比呈逐漸下降; 肝臟和肌肉組織中的GST、GPx和CAT酶活力在Cd富集階段均持續(xù)顯著升高, 在凈化釋放階段呈下降趨勢但仍難以恢復至對照組水平。