溫度對池蝶蚌雌雄同體和性逆轉(zhuǎn)的影響

徐紅琴 馬慧妹 曾 起 胡蓓娟 盛軍慶 洪一江

(1. 南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330031; 2. 江西省水產(chǎn)動物資源與利用重點實驗室, 南昌 330031)

在池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn), 成熟池蝶蚌中雌蚌比例偏高。這種現(xiàn)象在其他貝類中也普遍存在, 例如如馬氏珠母貝Pinctada martensi, 雄蚌先熟, 隨著貝齡的增加, 比例逐漸減少, 三齡之后, 雌蚌比例占優(yōu)勢[1,2]。在貝類性腺發(fā)育過程中, 發(fā)生了一定程度的性逆轉(zhuǎn)。在無脊椎動物軟體動物門中的雌雄同體現(xiàn)象也有不少報道, 如在牡蠣Saccostrea echinata[3]、櫛孔扇貝Chlamys nobilis[4]、蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis[5]、馬氏珠母貝[6]、菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum[7]和池蝶蚌[8]等貝類中發(fā)生雌雄同體或者性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象, 且以海水貝類雌雄同體現(xiàn)象為主要報道, 淡水貝類雌雄同體現(xiàn)象目前有扭蚌Arconaia lanceolata[9]、褶紋冠蚌cristaria plicata[10]和池蝶蚌[8], 研究都不深入, 關(guān)于雌雄同體現(xiàn)象或性逆轉(zhuǎn)發(fā)生的機(jī)制仍不清楚。

物種的性別可以通過兩種方式來決定[11,12]: 基因(基因型性別決定或Genotypic Sex Determination,GSD), 即受精時染色體的組成決定了物種的性別;環(huán)境(環(huán)境性別決定或Environmental Sex Determination, ESD), 即胚胎發(fā)育過程中遇到的外在條件決定了物種的性別。但是即使都是GSD型, 不同物種的性別決定機(jī)制仍存在很大差異。如, 哺乳動物通過Sry(Sex-determining region on Y)[13,14]調(diào)控Sox9(Sry-box 9)與促進(jìn)雌性發(fā)育的Wnt/β-catenin相互抑制共同決定個體的性別[15], 其中能獨立決定雌性性別發(fā)育的Foxl2[16], 也與Sox9存在抑制作用[17]; 黑腹果蠅通過性染色體與常染色體的比例(X∶A)決定性別: 當(dāng)X∶A≥1時, 機(jī)體釋放雌性遺傳信號激活Sxl(Sex lethal)[18]表達(dá)蛋白,Tra(Transformer)mRNA前體與之結(jié)合后發(fā)生雌特異性的可變剪接,激活Dsx(Doublesex)發(fā)生雌特異性剪接, 表達(dá)出雌特異DSX蛋白, 個體發(fā)育為雌性[19]。當(dāng)X∶A=0.5時,機(jī)體釋放雄性遺傳信號,Sxl和Tra均未活化,Dsx直接發(fā)生雄特異性剪接, 表達(dá)雄特異DSX蛋白, 個體發(fā)育為雄性[20]; 秀麗隱桿線蟲通過性染色體的數(shù)量決定性別: XO(1條X染色體)個體釋放雄性遺傳信號激活Her-1(Hermaphrodization)表達(dá)蛋白, 抑制Tra-2的表達(dá), 激活雄性性別決定必需基因Fem(Feminization)[21]表達(dá)FEM蛋白, 抑制Tra-1后又進(jìn)一步激活DM域轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá), 發(fā)育為雄性。XX個體Her-1不表達(dá)蛋白,Tra-2被激活[22], 抑制Fem表達(dá)[23],Tra-1被激活[24], 表達(dá)TRA1蛋白抑制DM域轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄, 促進(jìn)卵巢的發(fā)生, 發(fā)育為雌雄同體[25,26]。ESD型物種決定性別的方式也很多樣, 其中比較普遍的是ESD中的TSD型(Temperature Sex Deterination), 如爬行動物[27]。

于非非等[28]曾探討過雙殼類的性轉(zhuǎn)換現(xiàn)象及其機(jī)理, 認(rèn)為影響雙殼類性別轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因素在于基因和環(huán)境因素(營養(yǎng)條件、水溫、群體性別構(gòu)成)兩個方面, 但雙方在雙殼類性別轉(zhuǎn)換中的主導(dǎo)地位, 有待于進(jìn)一步研究。已知溫度能增加貝類第一次性腺分化和配子發(fā)生的動力學(xué)[29], 影響淡水貝類的配子發(fā)育[30]。本文探究了溫度對池蝶蚌雌雄同體和性逆轉(zhuǎn)的影響, 結(jié)合性別相關(guān)基因的表達(dá)變化, 說明溫度對池蝶蚌生殖濾泡的分化有影響, 并且可能是通過影響Dmrt1等性別決定相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

池蝶蚌取自于江西省撫州市南城縣池蝶蚌良種場。

雌雄同體蚌篩選材料(表 1): 2017年5月繁育的26—32月齡雌雄蚌(取樣時間為2019年7月—2020年1月)、2018年5月繁育的26、29—31月齡雌雄蚌(取樣時間為2020年7月、10—12月)和2020年5月繁育的6月齡雌雄蚌, 共960只(表 1)。

溫度刺激實驗材料: 2018年5月繁育的26月齡雌雄蚌, 雌、雄蚌各45只; 2019年6月繁育的13月齡雌雄蚌, 雌、雄蚌各40只。

時空表達(dá)實驗材料: 分別是2017年5月繁育的27—32月齡雌雄蚌, 每月定期取樣1次, 共6次, 每次雌、雄蚌各9只; 胚胎及2019年6月繁育的1—7月齡蚌, 每月定期取樣一次, 共8次, 每次30—50只。

Dmrt1原位雜交: 6月齡雌雄蚌、31月齡雌雄同體蚌。

1.2 雌雄同體蚌篩選及其發(fā)育跟蹤觀察

2019年7月17日開始逐月篩選雌雄同體蚌,2020年11月20日結(jié)束篩選。2019年10月10日抽樣觀察233只29月齡蚌, 獲得20只雌雄同體蚌。其中10只刻字標(biāo)記(編為1—10號), 每月跟蹤觀察一次, 2020年7月結(jié)束, 共4次; 2020年10月04日—2020年10月05日抽樣觀察190只29月齡蚌,獲得8只雌雄同體蚌, 刻字標(biāo)記(編為11—18號),每月跟蹤觀察一次, 2020年12月結(jié)束, 共2次;2020年11月06日—2020年11月07日抽樣觀察150只30月齡蚌, 獲得1只雌雄同體蚌, 刻字標(biāo)記(編為19號), 每月跟蹤觀察1次, 2020年12月結(jié)束,共1次。

1.3 溫度刺激

基地抽取池蝶蚌性腺, 鏡檢分雌雄, 各自編號標(biāo)記, 帶回實驗室, 室溫暫養(yǎng)1周。準(zhǔn)備兩套相同的養(yǎng)殖系統(tǒng), 一套養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)包含4口小缸, 長48 cm、寬30 cm、高40.5 cm (SUNSUN HE-480桌面小魚缸)和1口大缸, 長60 cm、寬35 cm、高40 cm, 4臺魚類專用冷水機(jī)、2個加溫棒和10個增氧石(統(tǒng)一開到最大, 控制溶氧量)。置水(4個蚌5 L水, 32個蚌40 L水, 大約在小缸的高27.8 cm處, 42個蚌52.5 L水, 大約在大缸的高25 cm處, 控制養(yǎng)殖密度), 另一套換水備用。設(shè)置5個溫度梯度: (15±1)℃、(19±1)℃、(23±1)℃、(27±1)℃和(31±1)℃(池蝶蚌養(yǎng)殖水域最低溫為1月份10℃左右, 最高溫為繁殖季節(jié)30℃左右[31])。將170只蚌分為5組, 每小組的蚌數(shù)和蚌號如表 1。在溫度刺激30d后, 13月齡的第22號雌蚌、26月齡的第26號雄蚌、26月齡的第10、第12、第20、第21、第30號雌蚌死亡。

1.4 總RNA提取

TRIzol法提取。在時空表達(dá)材料中, 大齡蚌每次3只蚌1組混樣(雌雄分開), 小齡蚌每次10—15只混樣, 平行混3組; 在溫度刺激材料中, 存活的同溫度蚌2只蚌1組混樣(雌雄分開), 每個溫度約3個平行組; 在雌雄同體材料中, 29月齡和31月齡的雌雄同體蚌單只蚌成組。在每只蚌開殼后, 剪開內(nèi)臟團(tuán)表皮, 從中間部位夾取適量性腺顆粒, 置于加入RNAiso Plus裂解液的離心管內(nèi), 過液氮, 研磨儀研磨, 氯仿分離總RNA, 異丙醇沉淀, 75%的無水乙醇洗滌,DEPC水溶解。

1.5 qRT-PCR

根據(jù)已克隆出來的Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9、Dmrt1和Foxl2六個基因的 cDNA, 使用 Oligo7.0 軟件設(shè)計qRT-PCR引物(表 2)。采用2-ΔΔCt法,以β-actin基因作為內(nèi)參基因評估結(jié)果。

1.6 HE染色

將溫度刺激的蚌取性腺組織分塊。14月齡蚌取部位1、2和3進(jìn)行HE染色(qRT-PCR檢測部位4,圖 1A); 27月齡取部位1、2、3、4和5進(jìn)行HE染色(qRT-PCR檢測部位6, 圖 1B)。同時鏡檢2020年篩選的9只雌雄同體蚌, 將仍有同體現(xiàn)象的16號、18號、19號31月齡雌雄同體池蝶蚌性腺分8塊(參照本實驗室前期分塊方法[32], 如圖 1C和1D, 部位7用于原位雜交分析), 并隨機(jī)挑選12只6月齡小蚌,性腺組織對半分2塊。

圖1 池蝶蚌性腺組織分區(qū)Fig. 1 Gonadal tissue division of H. schlegelii

中性通用型組織固定液固定24h以上, 無水乙醇梯度脫水, 純二甲苯透明, 石蠟包埋(6月齡蚌的性腺全部包埋在同一蠟塊內(nèi))。切片厚度6 μm, 二甲苯脫蠟, 乙醇梯度復(fù)水, 蒸餾水流洗(用于原位雜交的切片烘干備用, 不進(jìn)行下一步的染色), 蘇木精染色, 1%鹽酸99%乙醇分化, 3%氨水返藍(lán), 乙醇梯度脫水, 曙紅染色, 無水乙醇脫水, 二甲苯透明, 中性樹脂封片, 烘干, 鏡檢。

1.7 Dmrt1原位雜交

構(gòu)建帶有EcoRⅠ酶和XhoⅠ酶切位點的pET-32a-Dmrt1重組質(zhì)粒(表 2), 將生工測序正確的菌液提取重組質(zhì)粒為cDNA模板, 設(shè)計探針引物(表 2),克隆目的序列并回收PCR產(chǎn)物為制備探針模板, 按照T7 High Efficiency Transcription Kit (Tranagen,Beijing)試劑盒的說明將dNTP Mix換成地高辛標(biāo)記的RNA Labeling Mix, 合成探針后立即按照Easy?RNA Purification Kit說明書純化, 并稀釋至0.5—2 μg/mL備用。

表2 本實驗所用引物序列Tab. 2 Primers used in this study

取6月齡雌、雄蚌, 31月齡雌雄同體蚌(部位7),中性通用型組織固定液(含有1/1000 DEPC)固定1.5h, 常規(guī)脫水, 包埋。切片厚度6 μm, 常規(guī)脫蠟,復(fù)水, 烘干, 組化筆圈住組織, mRNA核酸片段暴露,預(yù)雜交, 雜交, 封閉, 孵生物素化鼠抗地高辛, SABCAP和BCIP/NBT顯色, 充分水洗, 封片。

2 結(jié)果

2.1 雌雄同體池蝶蚌篩選和跟蹤觀察

本實驗室前期已在26—32月齡發(fā)現(xiàn)雌雄同體池蝶蚌[32], 本研究兩年內(nèi)不斷地對6月齡和26—32月齡池蝶蚌性腺進(jìn)行雌雄同體現(xiàn)象篩選, 并將篩選出的雌雄同體蚌定期跟蹤觀察, 結(jié)果顯示池蝶蚌在6、28和29月齡較容易出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象(表 3), 且雌雄同體蚌在發(fā)育至30月齡左右向不同性別分化:77.8%分化為雄蚌、16.7%維持雌雄同體現(xiàn)象和5.5%分化為雌蚌(表 4和圖 2)。

圖2 跟蹤觀察的雌雄同體蚌Fig. 2 The regular observation of hermaphroditic H. schlegelii

表3 雌雄同體蚌篩選情況Tab. 3 The screening situation of hermaphrodite H. schlegelii

表4 雌雄同體蚌跟蹤觀察Tab. 4 Tracking observation of hermaphrodite H. schlegelii

2.2 溫度影響池蝶蚌雌雄生殖濾泡分化

本研究對隨機(jī)篩選的6月齡蚌和已鏡檢確定的31月齡雌雄同體蚌性腺組織切片觀察, 結(jié)果顯示6月齡蚌出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象, 雌性生殖濾泡占70%,雄性生殖濾泡占30%(圖 3A—C); 31月齡雌雄同體蚌內(nèi)出現(xiàn)三種生殖濾泡: 雌性生殖濾泡、雄性生殖濾泡和雌雄生殖細(xì)胞共存濾泡(圖 3D—F), 同時發(fā)現(xiàn)其內(nèi)的雄性生殖濾泡有向雌性生殖濾泡轉(zhuǎn)分化的趨勢(圖 3G—J), 初步認(rèn)定篩選到的28月齡雌雄同體蚌(9月份)可能由雄蚌變化而來。結(jié)果表明池蝶蚌生殖濾泡具有多能性, 性腺中雌雄同體現(xiàn)象有三種產(chǎn)生方式: 一個個體中同時分化出雌和雄兩種生殖濾泡、一個生殖濾泡中同時分化出雌和雄兩種生殖細(xì)胞、雄性生殖濾泡轉(zhuǎn)分化為雌性濾泡的過渡階段。

圖3 池蝶蚌性腺發(fā)育期間的雌雄同體現(xiàn)象Fig. 3 Hermaphroditic phenomenon during development of H. schlegelii

另一方面, 本研究利用32℃、27℃、23℃、19℃和15℃五個溫度誘導(dǎo)13、26月齡雌和雄蚌生殖濾泡分化, 30d后, 切片結(jié)果顯示(圖 4): 32℃誘導(dǎo),14月齡雄蚌出現(xiàn)12.5%雌雄同體現(xiàn)象; 27℃誘導(dǎo),14月齡雄蚌和27月齡雄蚌分別出現(xiàn)37.5%和12.5%性逆轉(zhuǎn); 23℃誘導(dǎo), 14月齡雌蚌出現(xiàn)14.29%性逆轉(zhuǎn); 19℃誘導(dǎo), 14月齡雌蚌出現(xiàn)25%性逆轉(zhuǎn)。不包括死亡的蚌。

圖4 14、27月齡池蝶蚌在5個溫度(15℃、19℃、23℃、27℃和32℃)下的性比柱狀圖Fig. 4 Histograms of sex ratio of 14-month-old and 27-month-old H. schlegelii at five temperatures (15℃, 19℃, 23℃, 27℃ and 32℃)

以上結(jié)果表明, 池蝶蚌生殖濾泡在4月齡—37月齡具有多能性, 溫度影響其分化: 27℃及以上的高溫容易誘導(dǎo)雄蚌向雌蚌逆轉(zhuǎn)或產(chǎn)生雌雄同體現(xiàn)象, 23℃及以下的低溫容易誘導(dǎo)雌蚌向雄蚌逆轉(zhuǎn)。且性腺發(fā)育早期受溫度影響更大。

2.3 池蝶蚌性別調(diào)控機(jī)制的初步探究

本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測池蝶蚌胚胎、1—7月齡內(nèi)臟團(tuán)及27—32月齡雌、雄蚌性腺內(nèi)Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9和Dmrt1五個基因的時空表達(dá)水平, 結(jié)果顯示:Tra2a、Fem1b、Fem1c和Sox9四個基因在1—7月齡的mRNA水平與胚胎期相比沒有明顯變化, 但是Tra2a、Fem1b和Fem1c三個基因的mRNA水平有相同的變化趨勢, 而Sox9基因在5月齡內(nèi)臟團(tuán)內(nèi), 呈現(xiàn)與之相反的表達(dá)趨勢(圖 5)。同時Tra2a、Fem1b、Fem1c和Sox9四個基因在27—32月齡的雌、雄蚌中均有表達(dá), 其中Tra2a和Sox9在雄蚌中表達(dá)高于雌蚌。并且Tra2a、Fem1b和Fem1c三個基因在雌、雄蚌中的表達(dá)趨勢一致, 而Sox9基因在27—30月齡的表達(dá)趨勢與三者一致, 31、32月齡的表達(dá)趨勢與三者相反(圖 6)。這說明Fem1b和Fem1c的時空表達(dá)趨勢基本一致, 與Tra2a大體一致, 在5、32月齡與Sox9相互抑制。

圖5 池蝶蚌胚胎以及1—7月齡內(nèi)臟團(tuán)內(nèi)性別決定相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平Fig. 5 mRNA expression levels of sex-determining related genes in embryo and visceral mass of H. schlegelii at 1—7 months of age

圖6 27—32月齡池蝶蚌性腺組織內(nèi)性別決定相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平Fig. 6 mRNA expression levels of sex-determining related genes in gonad of H. schlegelii at 27—32months of age

另一方面Dmrt1基因在1—7月齡的mRNA水平與胚胎期相比, 1—5月齡基本上不表達(dá), 直到6、7月齡才開始表達(dá)量有顯著性上升, 并且在27月齡雄蚌中表達(dá)高于雌蚌, 之后在28—32月齡的雄蚌中特異性表達(dá)。這說明Dmrt1基因可能與原始生殖細(xì)胞的分化以及雄蚌的發(fā)育有關(guān)。

本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測13、26月齡雌和雄蚌性腺在15℃、19℃、23℃、27℃和32℃五個溫度刺激下Tra2a、Fem1b、Sox9、Dmrt1和Foxl2五個基因的表達(dá)水平, 結(jié)果顯示(圖 7): 不同發(fā)育階段的雌、雄蚌的Tra2a、Fem1b和Sox9三個基因在不同溫度下的變化趨勢總體上一致; 不同發(fā)育階段的雌、雄蚌的Dmrt1基因與Tra2a、Fem1b和Sox9三個基因在15、19和23℃變化趨勢相同, 在27和32℃變化趨勢不穩(wěn)定, 但是在27月齡雄蚌中與Fem1b基因變化趨勢一致, 與Sox9基因在27和32℃的表達(dá)趨勢相反; 另一方面, 雄蚌中的Foxl2基因基本不表達(dá), 14月齡的雌蚌的Foxl2與Tra2a、Fem1b、Sox9、Dmrt1四個基因在不同溫度下表達(dá)趨勢基本相反, 但在27℃與Fem1b基因相同; 27月齡雌蚌的Foxl2與Fem1b基因在不同溫度下的變化趨勢基本一致, 與Dmrt1基因在不同溫度下的變化趨勢基本相反, 與Tra2a和Sox9兩個基因在15、19℃下變化趨勢相同, 在23、27和32℃下變化趨勢相反。

圖7 在不同溫度刺激下13、26月齡雌和雄蚌性腺內(nèi)性別決定相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平Fig. 7 mRNA expression levels of sex-determining related genes in gonad of female and male H. schlegelii at 13 and 26 months of age

本研究利用qRT-PCR技術(shù)分別檢測29和31月齡雌、雄、雌雄同體蚌性腺內(nèi)Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9、Dmrt1和Foxl2六個基因的表達(dá)水平, 結(jié)果顯示(圖 8):

圖8 29、31月齡雌、雄和雌雄同體蚌性腺組織內(nèi)性別決定相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平Fig. 8 mRNA expression levels of sex-determining related genes in gonad of female, male and hermaphrodite H. schlegelii at 29 and 31 months of age

與同期雄蚌比較, 29和31月齡雌雄同體蚌的Tra2a、Fem1b、Sox9和Dmrt1四個基因在開始階段先全部表達(dá)量上升, 之后又下降。與同期雌蚌相比, 31月齡雌雄同體蚌的Foxl2基因的表達(dá)量明顯降低。

2.4 池蝶蚌Dmrt1 mRNA 在雌、雄、雌雄同體蚌性腺中的細(xì)胞學(xué)定位

Dmrt1mRNA原位雜交結(jié)果顯示, 在雄性生殖濾泡精原細(xì)胞、桑葚胚結(jié)構(gòu)、精母細(xì)胞和精細(xì)胞上檢測到陽性信號(圖 9D), 在雌性生殖濾泡初級卵母細(xì)胞上未出現(xiàn)陽性信號(圖 9B), 在雌雄同體生殖濾泡成熟卵母細(xì)胞上檢測到陽性信號(圖 9G)。這說明Dmrt1不僅與雄性原始生殖細(xì)胞分化有關(guān), 同時與成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)。

圖9 池蝶蚌 Dmrt1 mRNA 在性腺中的細(xì)胞學(xué)定位Fig. 9 Localization of Dmrt1 mRNA in H. schlegelii gonads at the mature stage demonstrated by in situ hybridization

3 討論

3.1 溫度對淡水貝類性腺發(fā)育的影響

本研究中, 在自然條件下, 6月齡蚌(12月份左右)中發(fā)現(xiàn)以雌性濾泡為主的雌雄同體池蝶蚌, 說明某些6月齡池蝶蚌在前期性別分化時, 原始生殖濾泡可能優(yōu)先分化為雌性濾泡, 后期由于持續(xù)低溫的誘導(dǎo), 原始生殖濾泡又分化為雄性濾泡, 從而出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象, 這表明低溫可能有利于雄蚌發(fā)育;28月齡蚌(9月份左右)中發(fā)現(xiàn)雄性濾泡為主的雌雄同體池蝶蚌, 說明某些28月齡池蝶蚌前期是雄蚌,由于持續(xù)高溫的誘導(dǎo), 原始生殖濾泡又開始分化出雌性濾泡, 這表明高溫可能有利于雌蚌的發(fā)育。另外, 本實驗室研究人員最開始在26月齡左右蚌內(nèi)發(fā)現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象[32], 與后期研究者在28月齡左右蚌內(nèi)發(fā)現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象有明顯的月齡差異[8], 但是因為雙方的研究對象分別為秋繁蚌和春繁蚌, 所以均是在歷經(jīng)酷暑的9月份左右發(fā)現(xiàn)蚌內(nèi)出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象, 這進(jìn)一步說明雌雄同體蚌的產(chǎn)生需要一定時間以及一定強(qiáng)度的溫度刺激。而且溫度對池蝶蚌生殖濾泡分化的影響可能比較大, 一方面是因為本文在觀察雌雄同體蚌的性腺組織時發(fā)現(xiàn)同一個生殖濾泡內(nèi)能分化出雌雄兩種生殖細(xì)胞; 另一方面是因為前期分析池蝶蚌雌雄線粒體DNA雙重單性遺傳時發(fā)現(xiàn)沒有明顯的性別連鎖線粒體遺傳現(xiàn)象[33]。

因此本文設(shè)計了溫度刺激實驗, 證實了溫度影響池蝶蚌原始生殖濾泡的分化, 27℃及以上的高溫容易誘導(dǎo)雄蚌向雌蚌逆轉(zhuǎn)或產(chǎn)生雌雄同體現(xiàn)象,23℃及以下的低溫容易誘導(dǎo)雌蚌向雄蚌逆轉(zhuǎn)。但是仍然還有一些問題亟須解決, 比如貝類性腺發(fā)育的整個生殖周期均會受到溫度的影響嗎? 所有貝類的性腺均具有分化出兩種生殖細(xì)胞的潛能嗎? 性腺發(fā)育受到溫度影響的貝類在下一個發(fā)育周期是維持影響后的性別還是再次回歸原本的性別呢?這些都需要進(jìn)一步研究。

3.2 溫度影響淡水貝類性腺發(fā)育的分子機(jī)制

溫度僅僅只是一種外在刺激, 它能增加貝類第一次性腺分化和配子發(fā)生的動力學(xué)[29], 但最終影響仍需通過內(nèi)在性別決定與分化機(jī)制級聯(lián)放大表現(xiàn)出來。本研究檢測了池蝶蚌性別決定相關(guān)基因(Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9、Dmrt1和Foxl2)在不同發(fā)育階段以及不同組織中的表達(dá)量, 發(fā)現(xiàn)Dmrt1在胚胎和6、7月齡表達(dá)顯著高于其他時期。且Dmrt1mRNA原位雜交在6月齡雄蚌生殖濾泡精原細(xì)胞、“桑葚胚”結(jié)構(gòu)、精母細(xì)胞、精細(xì)胞和發(fā)育后期的卵母細(xì)胞中檢測到陽性信號。這說明Dmrt1不僅參與6月齡雄性生殖細(xì)胞的分化, 而且參與在27月齡雌蚌生殖濾泡內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的排放。并且在這個時期, 雄蚌內(nèi)Sox9的表達(dá)高于其他時期, 雄蚌內(nèi)Dmrt1可能與其一起在此時調(diào)控DNA甲基化從而調(diào)節(jié)雄性生殖干細(xì)胞的多能性, 因此導(dǎo)致28月齡出現(xiàn)雄性濾泡轉(zhuǎn)分化的雌性濾泡, 如Dmrt1-Sox2級聯(lián)調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)的多能性[34]。另外,Dmrt1在胚胎期表達(dá)高可能是因為此時開始發(fā)生遺傳上的性別決定,開始激活雄性特異性基因的表達(dá), 類似于小鼠性腺分化時Dmrt1的表達(dá)變化, 開始在雌雄胚胎的生殖嵴內(nèi)表達(dá)差異不明顯, 隨著性腺的分化, 雌雄胚胎間Dmrt1表達(dá)量發(fā)生巨大變化[35]。

在本研究中, 在池蝶蚌性腺中,Fem1b和Fem1c有相同的表達(dá)趨勢, 且兩者在5和29月齡表達(dá)均低于其他時期, 說明它們可能行使同一種功能。池蝶蚌內(nèi)臟團(tuán)在5月齡時期出現(xiàn)性腺組織, 發(fā)育至29月齡時, 性腺組織濾泡數(shù)目增多, 體積增大[36],Fem基因在這兩個階段受到抑制, 是否同線蟲XX個體發(fā)育, 抑制Fem表達(dá), 進(jìn)而抑制DM域基因表達(dá),卵巢發(fā)生, 形成雌雄同體[25,26]。Foxl2為雌性特有,能獨立地決定雌性性別發(fā)育, 這已經(jīng)在多種物種中得到證實[16]。本文27℃下的27月齡雌蚌性腺內(nèi)Foxl2的表達(dá)量顯著高于其他溫度, 說明27℃有利于雌蚌發(fā)育。23℃下的14和27月齡雄蚌性腺內(nèi)Sox9的表達(dá)量顯著高于其他溫度, 19℃下的14和27月齡雌蚌性腺內(nèi)Dmrt1的表達(dá)量顯著高于其他溫度, 說明19和23℃有利于雄蚌發(fā)育, 并且Dmrt1可能參與19℃下誘導(dǎo)雌蚌性逆轉(zhuǎn)的過程。同時在雌雄同體蚌內(nèi),Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9和Dmrt1五個基因都存在先高表達(dá), 再低表達(dá)的趨勢?？傊?這五個基因可能都參與雌雄同體的形成以及性逆轉(zhuǎn)的發(fā)生, 并且可能位于多條調(diào)控通路上, 因為它們彼此之間沒有很明顯的表達(dá)互抑現(xiàn)象。而Sox9可能在Dmrt1上游, 一方面是Dmrt1啟動子上有Sry、Sox5等性別相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點[37], 另一方面是凝膠阻滯分析Sox9和Dmrt1兩個啟動子調(diào)控結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)Sox9可能自調(diào)控, 也可能調(diào)控Dmrt1[38]。

綜上, 溫度影響池蝶蚌生殖濾泡的分化, 27℃及以上的高溫容易誘導(dǎo)雄蚌向雌蚌逆轉(zhuǎn)或產(chǎn)生雌雄同體現(xiàn)象, 23℃及以下的低溫容易誘導(dǎo)雌蚌向雄蚌逆轉(zhuǎn); 并且溫度可能是通過調(diào)控Dmrt1等性別相關(guān)基因的表達(dá)量, 從而調(diào)節(jié)生殖濾泡分化的。