浮萍棘尾蟲Adss基因克隆及表達載體構建

王 影 范金鳳 張 晴 陳 瑛,

(1. 哈爾濱師范大學生命科學與技術學院, 哈爾濱 150025; 2. 哈爾濱工業(yè)大學(深圳)土木與環(huán)境學院, 深圳 518055)

1956年, Lieberman[1]首次從大腸桿菌菌株中分離得到腺苷酸基琥珀酸合成酶(Adenylosuccinate synthase, 簡稱Adss), 后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Adss廣泛存在于生物體內(nèi), 與不同環(huán)境中生存的生命體相適應形成較高的遺傳多樣性。從細菌到高等哺乳動物腺苷酸基琥珀酸合成酶同源性在40%—60%。NCBI數(shù)據(jù)庫中已登記了約三萬種不同生物的Adss基因序列和氨基酸序列, 其中真核生物Adss的共同特征是都含有430—470個氨基酸, 分子量為45—50 kD,而病毒和細菌等非真核生物的Adss長度較短, 約為90—120個氨基酸。1984年, 科學家首次利用同位素標記法在模式動物大鼠體內(nèi)研究Adss的生物學功能, 發(fā)現(xiàn)Adss可以在三磷酸鳥苷(GTP)去磷酸生成二磷酸鳥苷(GDP)的過程中發(fā)揮催化作用, 用肌苷酸(IMP)和天冬氨酸(Asp)作為原料合成腺苷酸基琥珀酸, 完成肌苷酸轉化為腺苷酸的過程, 是腺苷合成途徑最重要的關鍵酶之一[2,3]。近20年, 各種生物體內(nèi)Adss的結構特點、功能及其應用也被大量報道[4—13], 其中以Adss作為靶標分子開展的抗生素和抗癌新藥研究取得了重要進展。在人肺細胞中Adss的缺失會引起染色體發(fā)生變化, 影響遺傳物質(zhì)的正常表達, 導致癌變的產(chǎn)生[14]; 在病原體幽門螺桿菌中Adss以二聚體形式存在時, 具有極強的穩(wěn)定性, 可以與生活環(huán)境高度適應, 對其蛋白結構進行分析可為抑制類藥物的研發(fā)提供參考[15]。而在原生動物研究領域, Adss同樣可以作為抗寄生原蟲藥物的作用靶標位點, 應用于杜氏利什曼原蟲等寄生原蟲病的防治[16,17], 在惡性瘧原蟲嘌呤代謝過程中也有Adss的參與, 抑制Adss的活性可用于抗瘧藥物的研發(fā)[18]。Adss作為生物體內(nèi)嘌呤合成過程中必需的酶, 在嘌呤核苷酸合成代謝時需要三磷酸腺苷(ATP)幫助, 去調(diào)控細胞內(nèi)核苷酸的平衡[19]。因此, Adss作為一種重要的生物酶, 在生物體內(nèi)的合成代謝和能量代謝系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。

浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae)是高等自由生原生動物的代表之一, 作為單細胞模型生物物種已經(jīng)被成功地應用于細胞學、遺傳學及毒理學等領域的研究中[20—22]。在研究人表皮生長因子(hEGF)對浮萍棘尾蟲二分裂增殖的分子作用機制研究中,發(fā)現(xiàn)浮萍棘尾蟲Adss基因在hEGF誘導下表達量顯著上調(diào), 并與多個細胞分裂相關基因存在關聯(lián), 提示該基因可能參與了浮萍棘尾蟲細胞分裂和周期的調(diào)控過程[23]。因此有必要明確該基因序列和蛋白特征, 以便進一步開展功能和分子機制研究。

本研究在克隆浮萍棘尾蟲Adss基因的cDNA全長序列基礎上, 詳細分析了該基因序列及其編碼的氨基酸、蛋白質(zhì)的生物信息學特征, 以及與其他物種同類蛋白的親緣關系, 并通過重組質(zhì)粒構建表達定位載體, 確定Adss蛋白在浮萍棘尾蟲細胞中的空間分布, 為后續(xù)利用基因工程方法揭示該基因在原生動物中作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

浮萍棘尾蟲準備浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae), 由中國科學院水生生物研究所饋贈, 隸屬于纖毛門、多膜綱、下毛目、尖毛科、棘尾蟲屬[24]。以麥粒浸出液喂食, 在20—25℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行大量培養(yǎng)。進行分子實驗的前3天, 進行無菌化純培養(yǎng)和饑餓處理[25]。

主要試劑Taq酶(EasyTaq?DNA polymerase)、T4DNA連接酶、DNA Marker、EcoRⅠ和PstⅠ限制性核酸內(nèi)切酶和感受態(tài)細胞(Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell)購自北京全式金生物技術有限公司。RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universa RNA Extraction Kit)和逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit)購自寶生物工程有限公司, 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit)、pGM-T克隆試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(DP120)購自天根生化科技有限公司, pEGFPN1質(zhì)粒(增強型綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒, 所攜帶的增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP), 是一種優(yōu)化的突變型GFP, 可在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達, 產(chǎn)生的熒光強度比普通GFP增強約35倍)購自上海吉滿生物科技有限公司, Hoechst 33342購自于Solarbio公司, LB培養(yǎng)基和乙醇等其他藥品購自上海生工生物工程技術有限公司。

1.2 基因克隆

總RNA提取及cDNA合成吸取懸浮培養(yǎng)的浮萍棘尾蟲細胞5000cells于1.5 mL的離心管中,8000×g4℃離心2min, 棄上清。首先根據(jù)RNA提取試劑盒操作步驟洗脫獲得高質(zhì)量的RNA, 然后按照逆轉錄試劑盒操作步驟在Microtube中配制反應混合液: Oligo dT Primer 1 μL, dNTP Mixture 1 μL, 模板RNA 5 μL, RNase free ddH2O 3 μL, 總量為10 μL。首先在65℃條件下保溫5min后, 冰上迅速冷卻。使模板RNA變性, 提高反轉錄效率。在上述Microtube管中配制反轉錄反應液: 上述變性后反應液10 μL, 5×PrimeScript Ⅱ Buffer 4 μL, RNase Inhibitor 0.5 μL, PrimeScript Ⅱ RTase 1 μL, RNase free ddH2O 4.5 μL, 總量為20 μL, 緩慢混合均勻。首先在50℃條件下處理60min, 然后在95℃條件下處理5min, 進行反轉錄反應。冰上冷卻, 產(chǎn)物收于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物設計與合成根據(jù)浮萍棘尾蟲基因組數(shù)據(jù)庫(http://stylo.ciliate.org/index.php/home/welcome)中的腺苷酸琥珀酸合成酶基因序列Contig 2018.g2178的序列信息, 依據(jù)保守區(qū)域的氨基酸序列利用Primer Premier 5.0軟件設計引物, 上游引物(Adss-F)為: 5′-GTCTGAGGAACATAGCT-3′, 下游引物(Adss-R)為: 5′-GCATCAAGGCAAGTA-3′, 由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

Adss cDNA的克隆與測序以S. lemnae的cDNA為模板, 用設計的引物Adss-F/Adss-R擴增Adss基因的啟動子序列。PCR反應體系: 模板0.5 μL;上、下游引物各0.5 μL; EasyTaq?Buffer 2.5 μL;dNTPs 2 μL; EasyTaq?DNA Polymerase 1 μL;RNase free ddH2O 18 μL, 總量為25 μL。PCR擴增程序: 95℃預變性5min; 95℃變性30s, 退火52℃30s, 72℃延伸30s, 共35個循環(huán); 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖溶液電泳檢測, 凝膠成像系統(tǒng)拍照保存, 取鑒定正確的PCR產(chǎn)物依照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作步驟, 對目的產(chǎn)物進行切膠回收。參考pGM-T克隆連接試劑盒中的說明書將目的基因連接到pGM-T載體上, 轉入Trans1-T1感受態(tài)細胞中, 通過含有氨芐青霉素的LB固體平板進行抗性篩選, 挑取陽性菌落進行菌落PCR檢測, 同時進行LB液體培養(yǎng)基搖菌。選取經(jīng)菌液PCR檢測, 且目標條帶大小正確的菌液送哈爾濱博仕生物有限公司進行測序。

1.3 生物信息學分析

使用Prot-Param(http://web.expasy.org/protparam)軟件分析Adss蛋白的氨基酸序列、分子質(zhì)量、等電點及其他相關的理化性質(zhì); 通過Signa IP(http://www.cdb.dtu.dk/services/Signa IP/)軟件進行蛋白質(zhì)信號肽的預測; 使用Prot Scale(http://web.expasy.org/protscale/)軟件分析Adss蛋白的親水性和疏水性; NCBI protein BLAST分析, 可獲得Adss蛋白的結構域; 用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在線軟件分析蛋白的跨膜結構域; TASSER蛋白模型(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)預測蛋白的二級結構; 運用SWISSMODEL(http://swissmodel. expasy.org/)軟件對蛋白序列三級結構進行預測; 利用DNAstar軟件包中的MegAlign對Adss蛋白進行多重序列比對和序列相似性分析。

1.4 系統(tǒng)進化樹構建

首先在National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP比對, 選取和浮萍棘尾蟲Adss氨基酸序列相似度較高的序列, 進行多重序列比對, 然后進行手工校正, 通過自展(Bootstrap)檢驗對進化樹分支的可信度進行評估。最后, 利用軟件MEGA 7.0運用最大似然法ML(Maximum Likehood)構建Adss蛋白的系統(tǒng)進化樹。

1.5 Adss基因亞細胞定位表達載體的構建

根據(jù)Adss基因起始密碼子ATG后的CDS序列內(nèi)的限制性酶切位點及pEGFP-N1綠色熒光蛋白表達載體多克隆位點的情況, 設計啟動子序列擴增引物F/R, 在CDS上下游引物的5′端分別加入EcoRⅠ和PstⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切酶的切位點(酶切位點序列用下劃線標識)。引物為5′-GAATTCGTCTGAG GAACATAGCT-3′和5′-CTGCAGGCATCAAGG CAAGTA-3′。

以浮萍棘尾蟲cDNA為模板, 用設計的引物F/R擴增Adss基因啟動子表達序列。PCR擴增體系、PCR運行條件的設置、目的片段回收純化、連接產(chǎn)物轉化、復蘇、培養(yǎng)、驗證及測序步驟參見上文。使用EcoRI和PstⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切同時雙酶切pEGFP-N1載體和Adss基因的cDNA片段。酶切體系:Adss或pEGFP-N1載體3 μL, 10×Cutsmart Buffer 5 μL,EcoRI 1 μL,PstⅠ 1 μL, RNase free ddH2O 20 μL, 總量為40 μL。在37℃條件下, 酶切15min。然后用T4DNA連接酶連接, 連接體系:T4DNA連接酶 1 μL, 10×T4DNA Buffer 2 μL, 酶切后pEGFP-N1載體 1 μL, 酶切后AdsscDNA片段3 μL, RNase free ddH2O 3 μL, 總量為 10 μL。 在25℃條件下, 連接10min, 將目的基因Adss啟動子區(qū)和線性載體的連接產(chǎn)物轉化Trans1-T1感受態(tài)細胞中, 復蘇培養(yǎng)使其形成單菌落。進行菌液PCR鑒定及測序, 測序結果無突變的菌液使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Adss, 用于轉染定位使用。

1.6 重組質(zhì)粒轉染及定位觀察

轉染方法參考2003年Paschka等[26]的實驗方法,通過喂飼法將含有pEGFP-N1-Adss重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉進S.lemnae體內(nèi), 以pEGFP-N1為空載對照, 同時用Hoechst 33342 (1 μg/mL)進行細胞核染色。轉染前1天將細胞接種至六孔板中, 待細胞密度達到30%—40%時進行轉染。每孔細胞中加入30 μL的大腸桿菌菌液(A600=0.5), 每24h進行一次補液, 在蔡司熒光顯微鏡(Axio Imager A2)下觀察Adss蛋白的表達分布并采集圖像。

2 結果

2.1 Adss基因全長cDNA序列的克隆和分析

以反轉錄的cDNA為模板, 用引物Adss-F和Adss-R克隆Adss基因啟動子序列片段, PCR擴增片段經(jīng)膠回收、連接轉化及測序的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLASTX比對。發(fā)現(xiàn)該序列與嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)和海水派琴蟲(Perkinsus marinus)的腺苷酸基琥珀酸合成酶相似度達到50%以上。進一步分析表明, 浮萍棘尾蟲Adss基因片段的長度為1396 bp, GC含量占43%。最大開放閱讀框為126 bp, 預測分子量約為48.72 kD, 等電點為9.09。

2.2 Adss基因編碼氨基酸序列特征

Adss基因編碼458個氨基酸, 其中帶正電荷氨基酸(K、R)46個, 占10.53%, 帶負電荷氨基酸(D、E)39個, 占8.92%, 疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)152個, 占34.78%, 極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)133個, 占30.43%, 脂肪族類氨基酸(G、A、V、L、I)151個, 占34.55%, 芳香族類氨基酸(F、W、Y)15個, 占3.43%, 堿性氨基酸(K、R、H)62個, 占14.19%, 酸性氨基酸(B、D、E、N、Q、Z)75個, 占17.16%。親/疏水性分析結果顯示:Adss基因編碼的蛋白在1—9、18—31、47—102、115—129、185—189、209—215、231—242、267—279、310—334、376—380和401—410區(qū)域為疏水性區(qū)域, 在10—17、32—45、104—116、130—139、151—161、165—183、191—202、217—230、245—251、258—265、290—300、335—354、382—400和415—431區(qū)域為親水性區(qū)域。不穩(wěn)定系數(shù)為55.19, GRAVY是-0.264, 屬于親水蛋白。信號肽預測結果顯示該基因編碼的多肽鏈無信號肽, 未形成跨膜結構域。浮萍棘尾蟲屬于單細胞生物, 說明該蛋白質(zhì)屬于定位于細胞質(zhì)基質(zhì)或細胞器基質(zhì)中的蛋白質(zhì), 不屬于膜蛋白或分泌蛋白。

保守結構域分析顯示, Adss氨基酸序列包含有一個P-loop NTPase超家族結構域, 也被稱為Walker A和Walker B保守基序, 可以與ATP或者GTP結合, 參與細胞的生命活動過程。

同源性分析發(fā)現(xiàn),S.lemnaeAdss基因編碼的氨基酸序列與其他纖毛蟲Adss的氨基酸序列具有較高的同源性, 與第四雙小核草履蟲Paramecium tetraurelia、嗜熱四膜蟲Tetrahymena thermophila、天藍喇叭蟲Stentor coeruleus以及多子小瓜蟲Ichthyophthirius multifiliis的Adss氨基酸同源性分別為60.23%、56.84%、56.41%和55.92%。

2.3 Adss氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析

構建基于Adss氨基酸序列的最大似然樹ML(圖 1)顯示, 浮萍棘尾蟲Adss氨基酸序列與草履蟲、嗜熱四膜蟲、多子小瓜蟲及天藍喇叭蟲Adss氨基酸序列聚為一簇, 親緣關系最近。與長雙歧桿菌、土星狀毛霉以及奧爾森派琴蟲等距離較遠。

圖1 根據(jù)不同物種的Adss氨基酸序列構建的最大似然樹Fig. 1 Phylogenetic tree inferred from different species of Adss amino acid sequences using ML

2.4 Adss蛋白的空間結構預測

TASSER蛋白模型預測浮萍棘尾蟲Adss蛋白二級結構(圖 2A), 是由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲組成, 分別占比為53.9%、18.1%和27.8%。SWISSMODEL預測浮萍棘尾蟲Adss蛋白的空間結構(圖 2B),發(fā)現(xiàn)其與細胞色素P450結構相似性最高, 這與二級結構分析結果相一致。細胞色素P450是血紅素蛋白的超家族, 它存在于所有生物的有機體中, 從細菌、酵母菌、真菌、植物、動物到人體。這種酶的顯著特點是能催化多種有機化合物的反應, 并能將有害物質(zhì)轉化為可溶性物質(zhì)并排出體外[27]。

圖2 浮萍棘尾蟲Adss空間結構預測Fig. 2 Predicted spatial structure prediction of S. lemnae Adss

2.5 Adss表達序列擴增與重組質(zhì)粒鑒定及亞細胞定位

引物F/R擴增S. lemnaeAdss表達序列片段大小為1408 bp左右, 包括完全編碼區(qū)1396 bp和兩端添加的EcoRI和PstⅠ各6 bp的酶切保護位點。pEGFP-N1-Adss質(zhì)粒電泳條帶大小為6129 bp左右, 結果符合預期。

將構建的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Adss轉染到浮萍棘尾蟲中, 觀察24h和48h Adss蛋白在蟲體內(nèi)的分布情況(圖 3)。結果表明, 轉染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Adss的蟲體細胞質(zhì)中始終有Adss表達, 且48h的熒光表達量(圖 3J、3K和3L)強于24h的熒光表達量(圖 3G、3H和3I), 但是細胞核上始終沒有表達。轉入空載質(zhì)粒pEGFP-N1的蟲體中, 細胞核和細胞質(zhì)中均有明顯熒光反應, 但是強度沒有隨時間發(fā)生明顯變化, 在24h的熒光表達量(圖 3A、3B和3C)高于重組質(zhì)粒組(圖 3G、3H和3I), 48h的熒光表達量(圖3D、3E和3F)低于重組質(zhì)粒組(圖 3J、3K和3L)。這說明轉入蟲體的重組質(zhì)粒中Adss基因啟動子序列使Adss蛋白大量表達在細胞質(zhì)中。

圖3 Adss在S. lemnae細胞中的定位(40×)Fig. 3 Intracellular localization of Adss in S. lemnae cells

3 討論

本研究獲得的浮萍棘尾蟲Adss蛋白由458個氨基酸組成, 屬于典型的真核生物Adss。脊椎動物有兩種不同的Adss同工酶, 這兩種酶的等電點不同,一種是堿性酶Adss1, 等電點約為6.0, 參與嘌呤核苷酸循環(huán)的重要過程, 與糖酵解過程密切相關; 另一種是酸性酶Adss2, 等電點約為8.9, 催化AMP的從頭合成, 是反應過程中第一個關鍵的酶[28]。本研究中預測浮萍棘尾蟲Adss蛋白氨基酸組成中的堿性氨基酸有62個, 酸性氨基酸有75個, 含有的酸性氨基酸殘基個數(shù)較多, 且等電點約為9.09。因此, 其應該屬于第二類的酸性酶。

本研究采用構建重組質(zhì)粒的方法進行Adss蛋白定位檢驗, 選擇了一種增強型綠色熒光蛋白EGFP。由于細胞內(nèi)部沒有EGFP基因, 因此可以通過連接EGFP和靶基因的編碼區(qū), 從而通過熒光顯微鏡觀察活細胞中目標蛋白質(zhì)的表達情況。本研究結果表明這一方法在浮萍棘尾蟲目標基因表達定位研究中是可行的。同時發(fā)現(xiàn)轉染后48h熒光強度高于24h, 提示Adss蛋白表達量隨時間推移而升高, 其機制和生理意義還有待研究。本研究確定浮萍棘尾蟲的Adss蛋白定位于細胞質(zhì), 在人體骨髓細胞和豬腎上皮細胞中Adss2蛋白定位于細胞質(zhì)的線粒體中[29,30], 浮萍棘尾蟲Adss蛋白是否也定位于線粒體還有待進一步確認。

浮萍棘尾蟲Adss保守結構域中含有P-loop NTPase, P-loop NTPase結構域是細胞質(zhì)中蛋白組裝的重要組成部分[31], 因此推測浮萍棘尾蟲體內(nèi)Adss在蛋白質(zhì)加工過程中同樣發(fā)揮重要作用。已有研究表明Adss蛋白在生物的代謝過程中屬于必需酶, 作為關鍵的調(diào)節(jié)因子之一, Adss蛋白的定位對于理解蛋白質(zhì)功能和分子機制具有重要作用。而且, 目的基因Adss啟動子序列的克隆及相應表達載體的構建, 也是研究Adss基因啟動子區(qū)功能以及研究其如何進行轉錄調(diào)控的一個重要內(nèi)容。

因此, 本研究補充了單細胞真核動物Adss基因序列信息, 并對其基因序列特征、氨基酸序列、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、結構組成和空間結構等進行了描述, 豐富了該基因遺傳多樣性數(shù)據(jù)庫, 也為進一步揭示纖毛蟲Adss基因的功能及作用機制奠定了基礎。