基于微衛(wèi)星分析的長豐鰱種質(zhì)資源遺傳監(jiān)測

羅相忠 覃維敏 梁宏偉 沙 航 鄒桂偉

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 武漢 430223)

鰱(Hypophthalmichthys molitrix)是我國重要的特有經(jīng)濟魚類, 具食物鏈短、易飼養(yǎng)、成本低、調(diào)節(jié)水質(zhì)等特性和功效。其以水體中浮游植物為主要餌料, 屬濾食性魚類, 為典型的碳匯漁業(yè)養(yǎng)殖對象[1]。鰱的營養(yǎng)價值較高, 必需氨基酸含量均略高于鯉(Cyprinus carpio); 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量高于鳙(Aristichthys nobilis); 一直深受廣大養(yǎng)殖戶和消費者所青睞。鰱在大部分池塘、湖泊和水庫中均有養(yǎng)殖或增殖, 是淡水養(yǎng)殖的當家品種之一。我國鰱養(yǎng)殖產(chǎn)量僅次于草魚(Ctenopharyngodon idellus), 位居淡水養(yǎng)殖種類的第二位[2]。長豐鰱(Changfeng silver carp)(CF)是中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所選育而成的鰱新品種(證書: GS-01-001-2010), 也是我國“四大家魚”的第一個人工培育新品種, 具有生長快、遺傳純合度高、出肉率高和較耐低氧等優(yōu)良特點, 其推廣應(yīng)用提高了我國鰱的良種覆蓋率[3]。

長豐鰱自通過審定, 已連續(xù)繁育了3代, 即長豐鰱子一代(CF1)、長豐鰱子二代(CF2)和長豐鰱子三代(CF3)。其大多數(shù)親本均由長豐鰱良種場和繁育基地連續(xù)繁育, 就此系統(tǒng)開展長豐鰱種質(zhì)資源遺傳監(jiān)測和評估, 對其優(yōu)良性狀的保持具有重要意義。微衛(wèi)星(SSR)因其穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、位點分布廣及分析成本低等特點被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)種質(zhì)資源的遺傳監(jiān)測。唐首杰等[4]通過微衛(wèi)星對團頭魴(Megalobrama amblycephala)3個選育群體進行的遺傳純度檢測, 為純化育種群體和監(jiān)測種質(zhì)質(zhì)量提供了理論依據(jù)。李耀國等[5]采用微衛(wèi)星對三亞海域卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)的養(yǎng)殖群體與野生群體進行了遺傳多態(tài)性分析, 及基因型與性狀的關(guān)聯(lián)分析, 證實野生群體遺傳多樣性較養(yǎng)殖群體高; 微衛(wèi)星位點中存在全長、體寬、體高和體質(zhì)量的優(yōu)勢基因型。王豐等[6]用12個微衛(wèi)星標記對長江4個野生青魚(Mylopharyngodon piceus)群體和1個養(yǎng)殖群體進行了遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)分析, 5個群體均具有較高遺傳多樣性, 其中4個野生群體之間遺傳距離較近, 且均與養(yǎng)殖群體之間遺傳距離較遠。此外, 還有對大口黑鱸(Micropterus salmoides)[7]、唇?(Hemibarbus labeo)[8]、大瀧六線魚(Hexagrammos otakii)[9]、團頭魴[10]、鯉[11]和大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[12]等選育群體遺傳監(jiān)測的研究報道, 為評估相關(guān)選育群體的育種潛力和培育新品種(系)提供了支撐。本研究旨在利用微衛(wèi)星標記分析長豐鰱連續(xù)不同世代群體的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu), 為其優(yōu)良性狀延續(xù)保持技術(shù)的建立與品種的持續(xù)升級換代提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CF1親本群體采集于河南省南陽市宛城區(qū)白河橋漁場長豐鰱良種繁育基地, 共采集21尾; 而CF2、CF3和L群體采集于湖北省浠水縣長豐鰱良種場, 分別采集30尾。采集樣本置于95%的乙醇中固定,-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。樣本基本信息見?1。

表1 長豐鰱各齡體長及體質(zhì)量組成Tab. 1 Body length and body mass in each age group of Changfeng silver carp

1.2 DNA提取

采用高鹽法進行樣本基因組DNA提取, 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用無菌雙蒸水調(diào)整濃度為50 ng/μL, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星引物

采用本團隊自主開發(fā)的18對鰱微衛(wèi)星引物進行分析, 熒光引物由武漢天一輝遠生物公司合成,引物序列及退火溫度如表 2所示。

表2 鰱衛(wèi)星分子標記及其引物序列Tab. 2 Microsatellite markers and their primers sequences in silver carp

1.4 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系為20 μL, 其中模板DNA 1 μL (50 ng),上下游引物各0.5 μL, PCR mix 18 μL; PCR擴增程序為: 94℃預(yù)變性3min; 94℃變性30s, 退火(44—60℃)30s, 72℃延伸30s, 30個循環(huán); 72℃延伸5min;4℃保存。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用熒光引物對4個群體樣本進行擴增, 其產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行毛細管電泳;采用Popgene1.3.1軟件分析等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合度(He)和觀測雜合度(Ho)及子代間的遺傳相似性系數(shù)、遺傳距離等遺傳參數(shù); 利用Cervus 3.0軟件計算多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC); 近交系數(shù)(Fis)和群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)及哈代-溫伯格平衡由Arlequin 3.1.1分析軟件統(tǒng)計獲得; 群體間聚類分析圖采用MEGA 5.0軟件中UPGMA方法構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 鰱與長豐鰱各子代的遺傳多樣性分析

18個鰱微衛(wèi)星位點在L、CF1、CF2和CF3群體中檢測到等位基因數(shù)分別為130、103、93和91個(表 3)。L、CF1、CF2和CF3的平均等位基因數(shù)(Na)分別為7.2222、5.7222、5.1667和5.0556, 平均有效等位基因數(shù)(Ne)分別為4.3122、3.2551、3.2274和3.1461(表 3); 鰱平均等位基因數(shù)和平均有效等位基因數(shù)均比長豐鰱后代高, 其在長豐鰱后代中呈逐代下降趨勢。各微衛(wèi)星位點Na和Ne見表 3, 在鰱L群體中Na和Ne最高的是位點BL5; 在長豐鰱子一代(CF1)群體中Na和Ne最高的分別是位點BL109和位點BL5; 在長豐鰱子二代(CF2)群體中Na最高的是位點BL5和位點BL109, 而Ne最高的是位點BL5; 在長豐鰱子三代(CF3)群體中Na最高的是位點BL5、BL55和BL109,Ne最高的是位點BL5。

2.2 群體的雜合度

鰱觀測雜合度為0.2667—1.0000, 平均觀測雜合度為0.7190, 期望雜合度為0.2350—0.8994, 平均期望雜合度為0.7260; 長豐鰱子一代(CF1)平均觀測雜合度為0.6975, 平均期望雜合度為0.6422; 長豐鰱子二代(CF2)平均觀測雜合度為0.6111, 平均期望雜合度為0.6353; 長豐鰱子三代(CF3)平均觀測雜合度為0.5407, 平均期望雜合度為0.6235(表 3)。4個群體中平均觀測雜合度和期望雜合度： 鰱＞長豐鰱子一代＞長豐鰱子二代＞長豐鰱子三代; 鰱雜合度較長豐鰱高, 不同群體在同一位點雜合度也有所不同, 同一位點在同一種群中觀測雜合度和期望雜合度相差較大, 如位點S92和位點H121; 可能是該位點上的無效等位基因所致; 若無效等位基因不被識別, PCR擴增時會導(dǎo)致純合子過?；螂s合子缺失,從而導(dǎo)致Ho和He出現(xiàn)偏差。

2.3 多態(tài)信息含量(PIC)

4個群體多態(tài)信息含量(PIC)為0.0320—0.8730(表 3), 鰱的平均多態(tài)信息含量(PIC)高于長豐鰱三個子代, 而長豐鰱各子代間平均PIC呈現(xiàn)逐代下降趨勢。4個群體多態(tài)信息含量由高到低依次為: 鰱(0.6748)＞長豐鰱子一代(0.5784)＞長豐鰱子二代(0.5730)＞長豐鰱子三代(0.5609); 鰱群體中PIC最高位點是BL109, 長豐鰱各子代群體中PIC最高位點都是BL5。

2.4 Hardy-Weinberg平衡分析

如表 4所示, 位點H121和BL55的d值在4個群體中均為負值, 表明4個群體在這2個基因位點上可能存在雜合子缺失。在鰱群體中有8個位點的d值為負數(shù), 而在長豐鰱子一代、子二代和子三代中d值為負數(shù)的位點數(shù)量分別為5、11和13個。4個群體平均d值分別為0.0044、0.0681、-0.0345、-0.1178,其中鰱和長豐鰱子一代的d值為正數(shù), 長豐鰱子二代與子三代2個群體的d值為負數(shù)。這說明后2個群體都可能存在雜合子缺失情況, 且長豐鰱子三代雜合子缺失最為嚴重。如表 3所示, 位點H121、H129和S78在4個群體中都偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＜0.05)。4個群體平均Hardy-Weinberg平衡P值分別為0.3096、0.4230、0.2844和0.1635,P值均大于0.05, 4個群體都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表3 18個位點在鰱和長豐鰱4個群體中的遺傳多樣性Tab. 3 Genetic diversity of four populations of silver carp and Changfeng silver carp based on 18 polymorphic microsatellite loci

續(xù)表3

表4 Hardy-Weinberg平衡檢測d值及P值Tab. 4 The d and P value of each locus by Hardy-Weinberg test

2.5 固定指數(shù)

鰱與長豐鰱子一代、子二代和子三代平均近交系數(shù)Fis分別為-0.057、-0.0017和0.0372(表 5);鰱與長豐鰱后代間遺傳分化系數(shù)Fst分別為0.0319、0.0301和0.0352(表 6); 4個群體間Fst最大的是鰱與長豐鰱子三代, 為3.52%(表 6)。在長豐鰱后代中,CF1與CF2間遺傳分化指數(shù)值0.0164, CF1與CF3間遺傳分化指數(shù)值0.0286, CF2與CF3間遺傳分化指數(shù)值0.0176; 其中CF1與CF2間遺傳分化指數(shù)最小, 其遺傳變異主要是來自個體之間; 鰱與長豐鰱后代之間遺傳分化指數(shù)值(Fst)較高, 而長豐鰱各后代之間遺傳分化很低。

表5 鰱、長豐鰱各世代間Fis和Fst值比較Tab. 5 Comparison of Fis and Fst values among different generations of silver carp and Changfeng silver carp

長豐鰱子代群體有一定程度觀測雜合度過剩現(xiàn)象, 子一代、二代和三代群體雜合子過剩位點數(shù)分別為13、7和6個; 鰱群體中近交系數(shù)Fis最高位點是H121(0.5200; 表 7), 該位點在群體內(nèi)遺傳變異程度低, 遺傳多樣性也低; 4個群體微衛(wèi)星位點中BL55遺傳分化(Fst)值最大(0.0642), BL116值最小(0.0178); 平均值為0.0406; 遺傳分化程度較弱的位點有13個, 中等的位點 5個; 而在長豐鰱后代中遺傳分化(Fst)平均值為0.0282, 僅BL55遺傳分化程度中等, 其他位點都程度較弱, H121和BL56分化程度最低為0.0039(表 7); 長豐鰱后代在檢測的18個多態(tài)位點上都表現(xiàn)出遺傳分化不明顯, 處于低等水平。

表7 鰱、長豐鰱各世代18對微衛(wèi)星位點的F-檢驗Tab. 7 F-statistics for different generations of silver carp and Changfeng silver carp at 18 microsatellite loci

2.6 遺傳距離及遺傳相似性系數(shù)

4個群體間遺傳距離為0.0299—0.0934(表 8),鰱與長豐鰱三個世代遺傳距離最遠(0.1174), 與CF2的遺傳距離為0.1115, 與CF1的遺傳距離為0.1114, 鰱與長豐鰱子一代、子二代和子三代之間遺傳距離逐漸上升; 而在長豐鰱子代之間, 子一代與子二代之間遺傳距離為0.0392, 與子三代之間遺傳距離為0.0951; 子二代和子三代遺傳距離為0.0544, 其后代遺傳距離有上升趨勢; 鰱與長豐鰱各子代之間遺傳相似性系數(shù)為0.8892—0.8946, 群體間遺傳相似度較高, 但長豐鰱后代群體間遺傳相似性系數(shù)則更高, 其中CF1與CF2之間遺傳相似度最高(0.9616), 而CF1與CF3相對較低(0.9093)。依據(jù)4個群體間遺傳距離值, 采用UPGMA法構(gòu)建聚類圖(圖 1), 長豐鰱CF1群體最先與CF2匯成一支, 接著與CF3匯成一簇, 最后與鰱聚在一起。

圖1 鰱、長豐鰱共4個群體基于Nei氏無偏遺傳距離的UPGMA進化樹Fig. 1 An unweighted pair group method with arithmetic mean(UPGMA) dendrogram for 4 populations of silver carp and Changfeng silver carp based on Nei’s unbiased genetic distance

表8 鰱、長豐鰱共4個群體的Nei氏遺傳距離(下三角)及遺傳相似性系數(shù)(上三角)Tab. 8 Nei’s standard genetic distance (below) and genetic identity (above) between 4 populations of silver carp and Changfeng silver carp

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

生物遺傳多樣性能反映一個種群的進化、演化歷程, 是物種長期適應(yīng)環(huán)境和生存的基礎(chǔ)。遺傳多樣性的高低是衡量生物對環(huán)境適應(yīng)能力的重要指標。遺傳多樣性越高, 生物對環(huán)境的適應(yīng)性就越強; 生物越易存活下來, 適應(yīng)新環(huán)境并繁衍后代[13]。遺傳多樣性也是衡量物種遺傳潛力的重要指標。遺傳潛力與生物遺傳多樣性多呈正相關(guān); 潛力越大, 遺傳多樣性也越豐富。在本研究中鰱群體等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)均高于長豐鰱群體, 主要是因為長豐鰱由長江水系的原始親本雌性個體經(jīng)雌核發(fā)育等技術(shù)選育而來。在雌核發(fā)育的草魚和團頭魴后代中也發(fā)現(xiàn)其平均等位基因數(shù)低于普通群體[14,15]。在長豐鰱后代中, 不同子代間等位基因數(shù)(Na)和有效等位基因數(shù)(Ne)都呈逐漸下降的趨勢。隨著人工繁育世代的增加, 群體間近交程度加重, 群體中會存在等位基因丟失現(xiàn)象。與此同時,也會剔除一些非目標性狀基因, 穩(wěn)定目標性狀基因,達到相關(guān)基因進一步純合, 遺傳多樣性和育種潛力也降低。在長豐鰱后代中平均等位基因和有效等位基因均比葉香塵等[16]檢測的長豐鰱等位基因數(shù)要多, 可能是由于檢測樣本或檢測方法不同造成的。在通常情況下, 檢測等位基因數(shù)和研究樣本量的大小有關(guān)[17]。與傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳相比,基因分型技術(shù)有更高的分辨率, 可分辨出2—4 bp的等位基因[18], 極大地提高檢測的準確性和檢測效率。

雜合度是評估遺傳多樣性的重要指標之一。期望雜合度是評價群體生物多樣性的最適參數(shù), 能直接反映群體遺傳多樣性。期望雜合度He高低與生物適應(yīng)性呈正相關(guān)。一個物種的期望雜合度越高, 適應(yīng)環(huán)境能力越強, 生存機會亦越大[19]。在本研究中4個群體的觀測雜合度和期望雜合度均為鰱最高, 長豐鰱子三代最低。在長豐鰱3個群體中, 期望雜合度區(qū)間為0.6235—0.7260, 均高于葉香塵等[16]檢測的廣西養(yǎng)殖長豐鰱(0.4133), 且低于檢測的長江三峽庫區(qū)4個群體鰱(0.7500—0.7943)[20]?？傮w上, 在長豐鰱3個子代中, 期望雜合度呈逐漸下降趨勢, 這與大口黑鱸世代選育群體逐代下降變化趨勢一致[7]。在長豐鰱3個子代間, 期望雜合度相差不大, 從子一代到子三代減少了3.00%。觀測雜合度子三代較子一代減少了29.00%。與張?zhí)鞎r等[21]在中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)發(fā)現(xiàn)的觀測雜合度下降3.5%相比, 降比更大。長豐鰱隨著繁育子代的增加, 群體純合度增加。與此同時, 長豐鰱3個子代群體期望雜合度均較高, 群體尚未出現(xiàn)明顯的近交及瓶頸效應(yīng), 群體遺傳多樣性保持較好, 其具備持續(xù)選育潛力。

根據(jù)Botstein等[22]對微衛(wèi)星位點多態(tài)性的定義,當PIC＜0.25時, 該位點多態(tài)性低;PIC值在0.25—0.50, 表明其具有中度多態(tài)性;PIC＞0.50時,該位點多態(tài)性高。鰱及長豐鰱子一代、二代和三代4個群體平均PIC值分別為0.6748、0.5784、0.5730和0.5609, 表明4個群體遺傳多樣性都較高, 但長豐鰱群體間呈逐代下降趨勢?；贖ardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果, 4個群體平均d值分別為0.0044、0.0681、-0.0345和-0.1178。d值為負數(shù), 表明長豐鰱子二代和子三代群體雜合子缺失嚴重, 在中國對蝦、南方擬?(Pseudohemiculter dispar)、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、團頭魴和德國鏡鯉(Cyprinus carpioL.)等群體的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[21,23—26]。雜合子缺失可能是無效等位基因存在或在聚合酶鏈式反應(yīng)中出現(xiàn)丟失現(xiàn)象所引起, 但也可能與選育群體被高強度選擇有關(guān)[27]。或者是在人工繁殖時群體雌雄比例、配組繁殖不合理導(dǎo)致近親繁殖, 也可能因檢測樣本數(shù)太少引起。在長豐鰱后代親本培育時受人為干擾嚴重, 亦會導(dǎo)致雜合子缺失。平衡偏離會造成一些不利影響。如群體內(nèi)等位基因丟失, 導(dǎo)致純合子比例上升, 種群遺傳多樣性隨之降低,近交衰退幾率也會上升, 最終可能會導(dǎo)致整個種群衰退。在今后應(yīng)持續(xù)監(jiān)測關(guān)注群體遺傳多樣性。

3.2 群體遺傳變異分析

生物對環(huán)境適應(yīng)性改變是其生存和繁衍的基礎(chǔ), 群體遺傳變異程度是衡量一個群體存在選育潛力和種質(zhì)資源可持續(xù)利用的前提。18個鰱微衛(wèi)星位點中有10個位點近交系數(shù)Fis值為正值, 8個位點為負值, 平均Fis值0.0119。3個長豐鰱子代間存在輕度的近交現(xiàn)象, 3個群體Fis值分別為-0.0943、0.0229和0.1029, 世代間近交程度逐漸加重。今后在人工繁殖中應(yīng)盡可能擴大繁育親本群體, 制定科學(xué)合理的繁育計劃。遺傳分化指數(shù)(Fst)是衡量群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)。McConnell S等[28]認為,Fst值在0.00—0.05, 群體間遺傳分化較小; 在0.05—0.15, 存在中等程度遺傳分化; 在0.15—0.25,群體間遺傳分化較大; 在0.25以上, 群體間遺傳分化明顯。長豐鰱后代群體中各位點Fst值在0.0039—0.0610, 群體平均遺傳分化指數(shù)為0.0282, 群體遺傳分化很小。此研究結(jié)果與李镕等[7]研究大口黑鱸世代群體總遺傳分化指數(shù)為0.013相近。這表明長豐鰱后代遺傳結(jié)構(gòu)基本一致, 雖出現(xiàn)一定的遺傳分化,但分化程度較低。長豐鰱子一代與子二代Fst值最小為0.0164, 子二代與子三代Fst為0.0176, 子一代與子三代的遺傳分化指數(shù)Fst最大(0.0286)。隨著選育進程的不斷開展, 世代間遺傳分化系數(shù)在相鄰世代之間相繼減小, 亦可能會進一步增大[29]。長豐鰱不同世代間遺傳變異大部分來自群體內(nèi), 群體間遺傳分化程度很低。長豐鰱世代間遺傳距離均較小,說明其遺傳相似性變高。就目前而言, 雖然長豐鰱群體間遺傳多樣性逐代降低, 但遺傳多樣性水平還維持在較高水平, 長豐鰱不同世代間遺傳結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。