花斑裸鯉胚胎/仔魚型血紅蛋白基因家族成員鑒定與時序表達研究

王發(fā)艷 劉 丹 高 強 晁 燕 聶苗苗 楊朝杰 倪偉琳 王麗晗 祁得林

(1. 青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室, 西寧 810016; 2. 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院, 西寧 810016;3. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)系, 西寧 810016)

血紅蛋白(Hemoglobin, Hb)是承擔(dān)轉(zhuǎn)運氧氣和二氧化碳的功能的必須蛋白, 幾乎存在于所有的脊椎動物紅細胞(除南極冰魚類[1])及部分無脊椎動物組織中[2]。脊椎動物的血紅蛋白是由2個α-珠蛋白亞基和2個β-珠蛋白亞基組成的四聚體。隨著個體發(fā)育, 血紅蛋白珠蛋白亞基的組成會發(fā)生顯著的變化, 這種在特定階段表達特殊的血紅蛋白的現(xiàn)象稱為血紅蛋白的時序轉(zhuǎn)換(Hemoglobin switching)[3—5]。血紅蛋白時序轉(zhuǎn)換是一個發(fā)展的過程, 涉及多個血紅蛋白編碼基因的動態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 該過程與造血系統(tǒng)發(fā)育密不可分, 在血紅蛋白向組織輸送氧氣的過程中起著重要作用[5]。

人類血紅蛋白包括胚胎型(HbE)、胎兒型(HbF)和成年型(HbA)血紅蛋白, 在卵黃囊發(fā)育的紅系祖細胞中表達HbE血紅蛋白[6], 第1次時序轉(zhuǎn)換發(fā)生在懷孕后第12周, 胚胎型血紅蛋白HbE的表達急劇下調(diào), 直至由胎兒型血紅蛋白HbF所取代[7], 第2次血紅蛋白時序轉(zhuǎn)換發(fā)生在新生兒出生后6周左右, HbF血紅蛋白表達水平下降并由成年型血紅蛋白HbA所取代[8]。斑馬魚(Danio rerio)胚胎發(fā)育早期血紅蛋白由7個基因(hbae1、hbae3、hbbe1、hbae4、hbbe3、hbae5和hbbe2)所編碼, 稱為胚胎/仔魚型血紅蛋白[9,10]。與人類血紅蛋白轉(zhuǎn)換表達相似, 斑馬魚胚胎發(fā)育早期經(jīng)歷兩次血紅蛋白時序轉(zhuǎn)換, 即第1次由胚胎型到仔魚型血紅蛋白轉(zhuǎn)換發(fā)生在受精后24—36h, 其顯著特征是hbbe3基因表達急劇下降而基因開始表達, 仔魚期hbbe2基因表達顯著上升并伴隨hbae5基因的表達; 第2次由仔魚型到成年型的血紅蛋白轉(zhuǎn)換發(fā)生在受精后22d, 其顯著特征是hbbe1/hbae1和hbbe2基因表達持續(xù)下降, 開始表達成年型血紅蛋白, 直到受精后32d完全建立成年型血紅蛋白體系[9,10]。

研究表明, 硬骨魚類全基因組復(fù)制事件促進了硬骨魚類包括血紅蛋白基因家族在內(nèi)的多個基因家族大量擴增, 導(dǎo)致血紅蛋白基因家族的功能多樣性, 從而使基因家族成員獲得截然不同的生化功能或呈現(xiàn)特異的表達特征[11—13]。裂腹魚亞科魚類是伴隨青藏高原隆升過程進化形成的一個自然類群,被認為經(jīng)歷了第4輪全基因組復(fù)制[14], 研究其血紅蛋白家族成員的組成及血紅蛋白時序轉(zhuǎn)換具有重要意義?；ò呗沲?Gymnocypris eckloni)屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、裂腹魚亞科(Schizothoracinae)、裸鯉屬(Gymncypris)[15], 是裂腹魚亞科魚類的代表種之一, 對高原缺氧環(huán)境有極強的適應(yīng)性, 但在血紅蛋白表達調(diào)控方面并無研究報道。研究表明, 花斑裸鯉受精卵在14—16℃水溫條件下, 48h形成肌節(jié), 進入器官形成階段, 96h進入心臟跳動期, 120h開始破膜, 144h破膜結(jié)束, 432h卵黃囊消失, 魚鰭發(fā)育較為完全, 初步具備成魚的體型[16,17]。本文以花斑裸鯉為研究對象, 參照胚胎發(fā)育的關(guān)鍵時間節(jié)點采集樣本[16,17], 利用整胚原位雜交技術(shù)研究胚胎/仔魚型血紅蛋白在花斑裸鯉胚胎發(fā)育階段的時空表達轉(zhuǎn)換特征, 為進一步研究血紅蛋白時序轉(zhuǎn)換及造血系統(tǒng)發(fā)育積累科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗中花斑裸鯉胚胎樣品由青海省循化縣蘇只黃河魚類人工增殖站提供。

1.2 整胚原位雜交實驗試劑與儀器

主要試劑總RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa PrimeSscript RT reagent kit with gDNA eraser)、膠回收試劑盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)、普通PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa PremixTaqplus dye); pGEM-T載體(PROMEGA pGEM-T Easy Vector), 質(zhì)粒DNA提取試劑盒(TIAN Rapid Mini Plasmid Kit); SP6 RNA Polymerase(Roche)、T7 RNA Polymerase(Roche)、Anti-Digoxigenin-AP(Roche)、NBT/BCIP Stock Solution(Roche)、DIG RNA Labeling Mix(Roche), tRNA(Roche)。

主要儀器NanoPhotometer NP80微量核酸蛋白測定儀, NiKon SMZ25體式顯微鏡。

1.3 花斑裸鯉胚胎/ 仔魚型血紅蛋白基因CDS序列獲取

以實驗室前期測得的花斑裸鯉基因組序列構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫(國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺https://ftp.cngb.org/, ID: CNA0035945),以 NCBI 中已公布的斑馬魚胚胎/仔魚型血紅蛋白編碼基因hbae1(NM_182940)、hbae3(NM_183066)、hbae4(NM_001082834)、hbae5(NM_001326701)、hbbe1(NM_198073)、hbbe2(NM_212846)和hbbe3(NM_001015058)的CDS 序列為搜索條件(Queries), 通過 TBtools v1.098669軟件[18]獲取花斑裸鯉胚胎/仔魚型血紅蛋白基因 CDS 序列。

1.4 花斑裸鯉胚胎樣品

采樣地點位于青海省循化縣蘇只黃河魚類人工增殖站, 花斑裸鯉人工繁殖時選擇年齡4—8齡、體重400—1400 g、發(fā)育良好、無傷無病的雌、雄魚作為催產(chǎn)的親魚。對親魚進行稱重, 根據(jù)體重提前1周注射促黃體素釋放激素和多潘立酮。雌、雄魚分開養(yǎng)殖1周左右, 等待其性成熟后按照雌雄比為3∶1進行人工授精和胚胎孵化[孵化溫度為(13±1)℃]。

參照花斑裸鯉胚胎發(fā)育研究結(jié)果, 采集受精后48h 、72h 、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h、288h、312h、336h、360h、384h、408h和432h的胚胎各兩份。1份用4%多聚甲醛(PFA)固定24h后, 在-20℃保存于100%甲醇中, 用于后續(xù)整胚原位雜交實驗；1份液氮保存, 用于提取RNA。

1.5 探針載體的構(gòu)建與RNA探針制備

構(gòu)建探針載體提取花斑裸鯉胚胎樣品總RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 根據(jù)已經(jīng)獲得的血紅蛋白基因CDS序列設(shè)計特異性探針引物, 所有引物由上海生工生物合成(表 1), 以上述cDNA為模板對目的基因進行擴增, 經(jīng)切膠回收純化后, 將目的基因連接到pGEM-T載體中, 獲得對應(yīng)重組載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中, 篩選陽性克隆送至生工生物測序, 測序結(jié)果采用NCBI-Blast-2.2.28 +軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Blastn命令搜索實驗室前期構(gòu)建的花斑裸鯉基因組本地數(shù)據(jù)庫。取測序正確的質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNA作為探針合成的模板。

表1 整胚原位雜交探針引物Tab. 1 Primer information used for whole embryo in situ hybridization

體外轉(zhuǎn)錄RNA探針反應(yīng)取10 μg酶切得到的DNA,基因插入方向為正向, 則加入10×buffer B(add BSA)10 μL, Enzyme SacII 5 μL, 最后用DEPC水補充至100 μL; 基因插入方向為反向, 則加入buffer Trago(with BSA)10 μL, EnzymeSpeI 5 μL, 最后用DEPC水補充至100 μL。37℃孵育2h, 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測孵育結(jié)果, 后測定濃度以用于RNA 探針制備。

取1 μg孵育的DNA, 加入10×transcription buffer 2 μL, DIG-RNA labeling 2 μL, RNase inhibitor 1 μL, polymerase(正向為T7 polymerase, 反向為SP6 polymerase)5 μL, 用DEPC水補充至20 μL。短暫低速離心后封口膜封口, 37℃水浴2h后, 加入2 μL RNase free DNase, 37℃加熱15min, 加入適量的LiCl和預(yù)冷的無水乙醇, 將上述反應(yīng)液在-20℃保存過夜。將反應(yīng)液從-20℃取出后4℃、12000 r/min離心30min, 去除廢液, 加入1 mL冰預(yù)冷的70%乙醇, 上下顛倒混勻, 使沉淀懸浮, 離心棄廢液, 管底是一層白色沉淀, 超凈工作臺干燥后加入55℃預(yù)熱的DEPC水, 輕彈溶解, 獲得反義RNA探針, 正義探針的合成需要相反的酶。瓊脂糖凝膠電泳檢測探針質(zhì)量后保存于-80℃。

1.6 整胚原位雜交實驗

整胚原位雜交方法參考文獻[19, 20], 顯色后用70%酒精洗滌3次, 每次30min, 去除背景顏色。顯微鏡下觀察結(jié)果, 采集圖像, 更換新的70%酒精, 避光保存于-20℃。

2 結(jié)果

2.1 花斑裸鯉胚胎/仔魚型血紅蛋白基因 CDS序列

通過本地數(shù)據(jù)庫搜索, 鑒定到花斑裸鯉5個胚胎/仔魚型血紅蛋白基因, 包括3個α-珠蛋白基因:hbae1、hbae4和hbae5, CDS序列全長分別為432、426和432 bp, 分別編碼143、141和143個氨基酸;2個β-珠蛋白基因hbbe1和hbbe3, CDS序列全長分別為444和441 bp, 分別編碼147和146個氨基酸。搜索結(jié)果中沒有發(fā)現(xiàn)花斑裸鯉基因組中與斑馬魚hbae3和hbbe2基因同源的序列。將鑒定得到的花斑裸鯉胚胎/仔魚型血紅蛋白氨基酸序列與斑馬魚中對應(yīng)基因的氨基酸序列進行同源性比對, 結(jié)果顯示兩個物種α-珠蛋白hbae1、hbae4及hbae5基因的氨基酸序列同源性分別為88.11%、87.23%和79.02%, β-珠蛋白hbbe1和hbbe3基因的氨基酸序列同源性為82.99%和 79.59%。

2.2 探針的合成效果與特異性驗證

將陽性克隆測序結(jié)果與花斑裸鯉基因組的本地數(shù)據(jù)庫進行比對發(fā)現(xiàn), 擴增片段與目的片段完全一致, 提取質(zhì)粒DNA后進行酶切, 得到探針模板用于制備整胚原位雜交實驗正、反義探針。

2.3 花斑裸鯉胚胎型血紅蛋白基因在胚胎發(fā)育中的整胚原位雜交表達

hbae1與hbae4、hbae5、hbbe1和hbbe3核酸序列相似性為30.79%、28.29%、34.54%和32.38%;hbae4與hbae5、hbbe1和hbbe3核酸序列相似性為34.03%、38.65%和36.13%;hbae5與hbbe1和hbbe3核酸序列相似性為34.54%和37.9%;hbbe1和hbbe3核酸序列相似性為35.08%。

整胚原位雜交結(jié)果顯示,hbae1基因(圖 1a)在花斑裸鯉胚胎受精后120h開始表達, 雜交信號持續(xù)表達至受精后432h, 在192—288h期間雜交信號最為強烈, 后呈下降趨勢。hbae4基因 (圖 1b)與hbae5基因(圖 1c)在整個胚胎發(fā)育階段未觀察到雜交信號。hbbe1基因(圖 1d)在花斑裸鯉胚胎受精后96h開始表達, 雜交信號持續(xù)表達至受精后432h, 整體表達趨勢與hbae1基因相同。hbbe3基因(圖 1e)在受精后120—384h內(nèi)均能觀察到雜交信號, 在192—288h期間雜交信號最為強烈, 但相較于hbae1和hbbe1基因,hbbe3基因雜交信號持續(xù)時間較短。

圖1 花斑裸鯉胚胎/仔魚型血紅蛋白基因整胚原位雜交結(jié)果Fig. 1 Whole embryo in situ hybridization results of embryo/larval hemoglobin gene

雖然不同的花斑裸鯉胚胎/仔魚型基因的表達情況有所不同, 但觀察到雜交信號的hbae1、hbbe1與hbbe3基因在胚胎發(fā)育階段的表達位點基本相同。在胚胎發(fā)育的96h在胚胎肌節(jié)形成初期正中軸處出現(xiàn)雜交信號, 胚胎發(fā)育至120h雜交信號遷移至胚胎軀干中央, 發(fā)育至144h在胚胎正中軸兩側(cè)及位于腎節(jié)部位的中央細胞團部位均能觀察到雜交信號, 胚胎發(fā)育至168h、192h和216h時, 雜交信號隨著胚胎造血系統(tǒng)發(fā)育轉(zhuǎn)移至胚胎卵黃囊、背主動脈腹側(cè)區(qū)(Ventral wall of dorsal aorta,VDA)及尾部造血區(qū)(Caudal hematopoietic tissue,CHT), 240h胚胎破膜而出, 在胚胎卵黃部位可以觀察到網(wǎng)狀的雜交信號, 這種現(xiàn)象一直持續(xù)到該基因雜交信號減弱至消失。

3 討論

脊椎動物在進化早期連續(xù)發(fā)生兩次全基因組復(fù)制事件, Amores等[21]研究結(jié)果表明硬骨魚在大約320—400百萬年發(fā)生了第3次全基因組復(fù)制事件,被稱為硬骨魚特異性基因組復(fù)制。有研究表明硬骨魚類在全基因組復(fù)制事件中, 一些基因會發(fā)生重復(fù)復(fù)制和刪除, 使得胚胎/仔魚型血紅蛋白編碼基因的種類和數(shù)量在種間存在較大差異[22—24], 例如,青鳉(Oryzias latipes)基因組中擁有9個胚胎/仔魚型血紅蛋白:hbae0、hbae1、hbae2、hbae3、hbae4、hbbe1、hbbe2、hbbe3和hbbe4[25]; 斑馬魚基因組中含hbae1、hbae3、hbae4、hbae5、hbbe1、hbbe2和hbbe3共7個胚胎/仔魚型血紅蛋白[10]; 黃河裸裂尻魚(Schizopygopsis pylzovi)中共鑒定到4個胚胎/仔魚型血紅蛋白, 分別是hbae1、hbae4、hbbe1和hbbe3[26]。在本研究中, 通過花斑裸鯉基因組數(shù)據(jù)共鑒定到5個胚胎/仔魚型血紅蛋白, 分別是hbae1、hbae4、hbae5、hbbe1和hbbe3。與斑馬魚相比, 花斑裸鯉基因組缺少hbae3與hbbe2基因, 與黃河裸裂尻魚相比, 花斑裸鯉基因組中保留了hbae5基因, 因此推測花斑裸鯉在適應(yīng)高原環(huán)境的進化過程當(dāng)中丟失hbae3與hbbe2基因, 可能與裂腹魚亞科魚類第四輪全基因組復(fù)制事件后發(fā)生的小規(guī)模基因刪除事件有關(guān)。

在斑馬魚胚胎發(fā)育的第16個體節(jié)期檢測到胚胎型血紅蛋白hbbe3開始表達, 伴隨hbae1、hbae3和hbbe1的表達, 在第1次血紅蛋白時序轉(zhuǎn)換時, 胚胎型血紅蛋白轉(zhuǎn)換為仔魚型血紅蛋白,hbbe3基因表達水平下降, 而hbbe2基因表達顯著上升并伴隨hbae5珠蛋白的表達, 第2次血紅蛋白時序轉(zhuǎn)換時胚胎/仔魚型血紅蛋白表達水平下降并且轉(zhuǎn)換為成年型血紅蛋白[9]。在本研究中, 花斑裸鯉hbae1、hbbe1與hbbe3基因在胚胎器官形成階段出現(xiàn)雜交信號,表達信號從胚胎期持續(xù)至仔魚期, 且在胚胎向仔魚轉(zhuǎn)換階段雜交信號最為強烈, 這與斑馬魚胚胎/仔魚型血紅蛋白基因表達研究大致相似, 說明hbae1、hbbe1和hbbe3基因在花斑裸鯉胚胎發(fā)育早期有氧代謝方面發(fā)揮了重要作用。斑馬魚仔魚型血紅蛋白編碼基因hbae5表達量低且持續(xù)時間短[9],在Nefedochkina等[27]的研究發(fā)現(xiàn), 斑馬魚hbae4基因轉(zhuǎn)錄水平極低, 僅為hbae5轉(zhuǎn)錄水平的2%。在黃河裸裂尻魚胚胎型血紅蛋白轉(zhuǎn)換表達初步研究中, 發(fā)現(xiàn)黃河裸裂尻魚基因組丟失hbae5基因且hbae4基因表達極其微弱[26]?；ò呗沲幣咛グl(fā)育過程中并未觀察到hbae4與hbae5基因的雜交信號, 由此推測hbae4和hbae5基因可能在裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育過程中不發(fā)揮生物學(xué)功能或出現(xiàn)功能的弱化。與斑馬魚有所不同的是, 在斑馬血紅蛋白基因家族中hbbe3基因僅在胚胎發(fā)育初始階段高表達, 胚胎破膜后基因表達量下降、雜交信號微弱[9], 而花斑裸鯉胚胎破膜后仍然可以觀察到hbbe3基因的雜交信號, 而且表達信號強烈、持續(xù)時間較長, 因此, 花斑裸鯉具有與斑馬魚和黃河裸裂尻魚不同的血紅蛋白轉(zhuǎn)換表達特征, 這可能與花斑裸鯉特殊的進化歷程和高原環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)。

在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中, 原始造血有兩個起始部位: 前部側(cè)向中胚層(Anterior Lateral Mesoderm, ALM), 這里生成原始髓系細胞; 另一個起始部位時后部側(cè)向中胚層(Posterior Lateral Mesoderm, PLM), 受精后原始造血最先發(fā)生于ALM部位, 在受精后18h, PLM部位進一步發(fā)育形成中央細胞團結(jié)構(gòu), 生成紅細胞前體并進入血液循環(huán)[28]。斑馬魚定向造血起始于VDA區(qū)域, 在受精后48h, 定向造血轉(zhuǎn)移至CHT, 在受精后144h定位于生成成熟血細胞的場所腎臟[28]。在本研究中可以觀察到花斑裸鯉胚胎早期發(fā)育過程中, 雜交信號主要位于胚胎正中軸、胚胎軀干中央、卵黃囊、VDA和CHT部位, 位點與斑馬魚相同, 表明花斑裸鯉造血系統(tǒng)發(fā)育可能與斑馬魚相一致。