• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    密碼子優(yōu)化的吡喃糖氧化酶基因在畢赤酵母中的表達

    2022-06-09 08:48:10王玥高慶華董聰羅同陽王慶慶
    生物技術(shù)通報 2022年4期
    關(guān)鍵詞:畢赤密碼子氧化酶

    王玥 高慶華 董聰 羅同陽 王慶慶

    (河北省微生物研究所有限公司,保定 071051)

    吡喃糖氧化酶(pyranose oxidase,PROD,簡稱P2O)又名吡喃糖-2-氧化酶或葡萄糖-2-氧化酶(pyranose-2-oxidase,glucose-2-oxidase),是以黃素蛋白為輔酶、以六元環(huán)吡喃單糖類化合物為底物的氧化還原酶類(EC 1.1.3.10),具有多底物催化等特征[1]。序列與結(jié)構(gòu)分析比對發(fā)現(xiàn),吡喃糖氧化酶與葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、膽堿氧化酶和甲醇氧化酶一樣同屬于葡萄糖-甲醇-膽堿(glucosemethanol-choline,GMC)氧化還原酶家族[2-3]。

    研究發(fā)現(xiàn),吡喃糖氧化酶在很多方面都起到重要作用,可降解木質(zhì)纖維素[4],參與碳水化合物的生物轉(zhuǎn)化合成[5],還應(yīng)用于生物燃料電池、生物傳感器以及臨床診斷分析中[6]。尤其是在臨床診斷分析中,P2O可以用于檢測糖尿病人血糖控制的重要指標(biāo)1,5-脫水-D-葡糖醇。血清1,5-AG檢測的敏感性、特異性均較高,且不受忌、進食(餐前、餐后均可測)及性別、年齡、藥物等因素干擾,因此P2O具有更好的研究前景。

    目前,有一些編碼吡喃糖氧化酶的基因序列被克隆且成功異源表達在大腸桿菌中,如隔孢伏 革 菌 屬 Peniophora sp.[7]、 多 色 栓 菌 屬 Trametes multicolor[4,8]、 黃 孢 原 毛 平 革 菌 Phanerochaete chrysosporium[9]、 彩 絨 革 蓋 菌 Coriolus versicolor[10]等白腐真菌中的吡喃糖氧化酶,還有來源于密褐褶孔菌Gloeophyllum trabeum[11]和松口蘑菌根菌Tricholoma matsutake[12]等褐腐真菌的吡喃糖氧化酶。但是這些表達的吡喃糖氧化酶的酶活都比較低,因此提高P2O的酶活就成為研究重點。

    研究發(fā)現(xiàn),許多外源基因在大腸桿菌表達體系中高效表達時,往往不能形成有一定空間結(jié)構(gòu)的特定生物功能的蛋白質(zhì),而是以一種不可溶、無生物活性的沉淀即包涵體的形式存在于細胞內(nèi)[13-15]。包涵體形成的原因有很多。研究發(fā)現(xiàn),在表達量低時很少形成包涵體,表達量越高越容易形成包涵體[16]。原因可能是重組蛋白的合成速度太快,表達量短期內(nèi)太大,大腸桿菌無法及時分泌出蛋白后期加工所需的酶類及輔助因子,以至于蛋白不能進行折疊,二硫鍵不能正確的配對,過多的蛋白進行非特異性結(jié)合,蛋白質(zhì)無法達到足夠的溶解度等[16-17]。通常情況下,重組蛋白的氨基酸組成中含硫氨基酸越多越容易形成包涵體[17]。培養(yǎng)條件不佳,如溫度過高或胞內(nèi)pH值接近蛋白的等電點時容易形成包涵體[18-19]。另外,重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白,由于缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類及輔助因子,如折疊酶、分子伴侶等,致使中間體大量積累,容易形成包涵體沉淀[20]。

    在真核表達系統(tǒng)中,畢赤酵母分泌表達系統(tǒng)能對許多蛋白質(zhì)產(chǎn)物進行分泌,便于產(chǎn)物提純。而且畢赤酵母表達系統(tǒng)具有可誘導(dǎo)的強啟動子AOX1,啟動外源基因高效表達,還有生長迅速等優(yōu)點[21]。由于畢赤酵母對密碼子的偏愛性,為了消除稀有密碼子對蛋白表達量的影響,對目的基因密碼子序列進行改造十分必要[22]。目前研究發(fā)現(xiàn),吡喃糖氧化酶只在大腸桿菌中成功異源表達,其在畢赤酵母中表達有待研究。

    本研究以NCBI中登錄號XM_008046051.1的變色栓菌 pyranose 2-oxidase基因序列為基礎(chǔ),根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性對該基因的密碼子序列進行優(yōu)化,委托公司進行基因合成。經(jīng)過轉(zhuǎn)化子的篩選,得到了高產(chǎn)吡喃糖氧化酶的重組菌株。在10 L發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng),并對其部分酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。為吡喃糖氧化酶在真核表達系統(tǒng)中的表達提供試驗及應(yīng)用依據(jù)的同時,避免了在大腸桿菌中表達產(chǎn)生的弊端,開辟了一條全新的吡喃糖氧化酶的工業(yè)化高效生產(chǎn)途徑。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株及質(zhì)粒 吡喃糖氧化酶基因由安徽通用生物公司合成,合成的基因連接在pPIC9K表達載體上;大腸桿菌E.coli DH5α購自上海生工;酵母表達菌株GS115購于優(yōu)寶生物。

    1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒購自全式金公司;Not I-HF酶、EcoR I-HF酶和Sac I酶均購自NEB 公司;DNA Marker購自康為公司;G418購自phytotechlab公司;ABTS購自Biotopped Life Sciences公司;辣根過氧化物酶購自源葉生物公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、YPDS培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、YPCS培養(yǎng)基、BSM發(fā)酵培養(yǎng)基、PTM1微量溶液的配制均參照文獻[23]。

    1.2 方法

    1.2.1 吡喃糖氧化酶基因序列的密碼子優(yōu)化及合成 參照NCBI中登錄號為 XM_008046051.1的變色栓菌 pyranose 2-oxidase基因序列,利用密碼子優(yōu)化軟件(http://gcua.schoedl.de/)分析,發(fā)現(xiàn)吡喃糖氧化酶基因中存在多處畢赤酵母的稀有密碼子,利用密碼子優(yōu)化軟件(http://www.jcat.de/)對該基因進行密碼子優(yōu)化,在不改變氨基酸序列的基礎(chǔ)上,獲得優(yōu)化后的吡喃糖氧化酶基因序列。在序列的5′端加上EcoR I限制性酶切位點,EcoR I限制性酶切位點為GAATTC;3′端加上6個組氨酸標(biāo)簽后再加上Not I限制性酶切位點,Not I限制性酶切位點為GCGGCCGC,將優(yōu)化構(gòu)建的基因序列送安徽通用生物公司合成,合成的基因連接到pPIC9K表達載體上,得到重組表達質(zhì)粒pPIC9K-P2O。

    1.2.2 重組表達載體的驗證 安徽通用生物公司提供的質(zhì)??偭考s為 2-5 μg,用 20-50 μL 滅菌后的雙蒸水或 pH 8.0 的 1×TE 緩沖液來溶解,溶解后的質(zhì)粒濃度約為 100 ng/μL。同時提供含有目的基因的重組質(zhì)粒的穿刺菌約 500 μL 備用。拿到的穿刺菌可以看到明顯的穿刺線,挑取穿刺線上的菌接種到LB固體平板,37℃過夜培養(yǎng)。利用全式金質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性菌株的質(zhì)粒,通過EcoR I和Not I雙酶切驗證重組質(zhì)粒pPIC9K-P2O。

    1.2.3 陽性轉(zhuǎn)化子的獲得 將驗證好的重組質(zhì)粒pPIC9K-P2O利用限制性內(nèi)切酶Sac I進行線性化后,電轉(zhuǎn)表達宿主畢赤酵母Pichia pastoris GS115,構(gòu)建重組表達菌株GS115/pPIC9K-P2O,涂布在終濃度250 μg/mL G418的YPDS固體平板上,30℃培養(yǎng)3 d后獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

    1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達和SDS-PAGE檢測 將重組菌株GS115/pPIC9K-P2O挑取單菌落接種于5 mL YPCS(1%酵母提取物,2%蛋白胨,0.5%酪蛋白水解物,0.5%山梨醇)試管液體培養(yǎng)基中,14-18 h后加1%(V/V)甲醇,24 h和48 h均各加1%(V/V)甲醇誘導(dǎo),72 h收菌,常溫12 000 r/min離心5 min收集上清,檢測吡喃糖氧化酶的酶活,同時進行SDS-PAGE檢測。所有試驗均設(shè)置3個重復(fù)。

    1.2.5 吡喃糖氧化酶的酶活測定 吡喃糖氧化酶的酶活測定方法參照文獻[4,24]。在反應(yīng)總體積為1 mL的體系中,依次添加濃度為50 mmol/L、pH 6.5的磷酸鉀緩沖液580 μL,濃度為0.01 mol/L的ABTS溶液100 μL,濃度為 1 mol/L 的 D-葡萄糖溶液 100 μL,濃度為100 U/mL的辣根過氧化物酶儲液20 μL,添加200 μL酶液啟動反應(yīng),測定該反應(yīng)在吸收波長為420 nm處3 min之內(nèi)的連續(xù)變化。

    1.2.6 吡喃糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析 酶的最適作用pH和溫度以及pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,金屬離子的影響和底物特異性的測定參照文獻[24-25]。所有試驗均設(shè)置3個重復(fù)。

    1.2.7 10 L發(fā)酵罐放大表達P2O 選取試管水平上吡喃糖氧化酶活性最高的轉(zhuǎn)化子研究其發(fā)酵罐條件下的表達。挑取單克隆接種于5 mL的YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)10 h,按 3% 接種量轉(zhuǎn)接于 150 mL BMGY培養(yǎng)基至 OD600≈6接種于發(fā)酵罐中。10 L發(fā)酵罐的裝液量為5.4 L的BSM培養(yǎng)基,滅菌后以10%發(fā)酵體積接種,以濃氨水控制pH值,培養(yǎng)溫度為30℃。發(fā)酵過程分為4個階段:菌體培養(yǎng)階段、碳源飼喂階段、饑餓培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)表達階段具體內(nèi)容參照文獻[21]。具體方法詳見Invitrogen 操作手冊。每隔12 h測定表達的吡喃糖氧化酶的活性,并同時進行SDS-PAGE監(jiān)測表達量的累積。

    2 結(jié)果

    2.1 吡喃糖氧化酶基因的密碼子優(yōu)化及人工合成

    在保持氨基酸序列不變的基礎(chǔ)上,合成優(yōu)化的基因序列中共替換了421個堿基。優(yōu)化后的基因序列通過人工合成的方法獲得?;蛐蛄腥鐖D1所示,大小為1 904 bp。

    圖1 密碼子優(yōu)化后的基因序列Fig.1 Gene sequence after the optimization of codons

    2.2 重組表達載體的驗證

    挑取穿刺菌保存管中穿刺線上的菌接種到LB固體平板上,37℃ 過夜培養(yǎng)。利用全式金質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性菌株的質(zhì)粒,通過EcoR I和Not I雙酶切對重組質(zhì)粒pPIC9K-P2O進行驗證。

    由圖2可知,重組表達質(zhì)粒pPIC9K-P2O經(jīng)過EcoR I和 Not I雙酶切得到9 kb和1.9 kb左右的條帶,分別為載體片段和優(yōu)化后的目的基因片段,與預(yù)期結(jié)果一致。

    圖2 pPIC9K-P2O質(zhì)粒雙酶切驗證Fig.2 Verification of pPIC9K-P2O digested by double enzymes

    2.3 試管水平檢測吡喃糖氧化酶的表達

    將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子GS115/pPIC9K-P2O(圖3)按照上述試驗條件進行吡喃糖氧化酶在試管中的發(fā)酵。利用HRP-ABTS的方法測定吡喃糖氧化酶的酶活力。一個單位的吡喃糖氧化酶酶活(U)定義為每分鐘氧化2 μmol的ABTS所需的吡喃糖氧化酶的量。

    圖3 轉(zhuǎn)化子的獲得Fig.3 Acquirement of transformants

    首先對不同的單菌落進行了顏色篩選,反應(yīng)體系添加酶液后由無色變?yōu)榧t棕色,且顏色越深說明酶活越高。隨后選擇了20個顏色變化明顯的單菌落,測定其試管水平上的酶活。結(jié)果(圖4)顯示,有6個陽性轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)72 h后表達產(chǎn)物的酶活在18 U/mL以上,其中4號陽性轉(zhuǎn)化子的酶活較高且穩(wěn)定,最高酶活約24 U/mL。因此,選擇菌株GS115/pPIC9KP2O-4進行下一步試驗研究。

    圖4 篩選P2O高表達量的重組菌株Fig.4 Screening of recombinant P.pastoris with high-yield P2O

    將離心后的發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE蛋白電泳,結(jié)果如圖5所示,pPIC9K-P2O表達載體轉(zhuǎn)化的重組畢赤酵母在85-100 kD之間有一條條帶,且pPIC9K空載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母沒有相似條帶,說明吡喃糖氧化酶在重組畢赤酵母中實現(xiàn)了外源分泌表達。前期優(yōu)化基因序列時在3′端有6個組氨酸標(biāo)簽,上清液超濾濃縮后采用Ni2+親和層析柱親和純化蛋白,并進行SDS-PAGE蛋白電泳,結(jié)果如圖6。

    圖5 重組蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE result of recombinant protein

    圖6 重組蛋白純化結(jié)果Fig.6 Purification results of recombinant protein

    2.4 10 L發(fā)酵罐表達吡喃糖氧化酶

    將重組菌P.pastoris GS115/pPIC9K-P2O-4按照上述試驗條件進行10 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng),結(jié)果如圖7所示。初始發(fā)酵溫度控制在30℃,用濃氨水控制pH 為5.0,通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量控制溶氧。等到BSM培養(yǎng)基中的甘油耗盡,溶氧上升后,以12 mL/(h·L)的速度流加含有1.2%(V/V)PTM1的50%(W/V)甘油,待OD600長到150-180 時停止流加甘油,然后饑餓培養(yǎng)0.5-2 h,溶氧開始上升。這時,以3 mL/(h·L)的速度流加含有1.2%(V/V)PTM1 的100%甲醇,用濃氨水控制pH 為6.0,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量控制溶氧。

    隨著甲醇的添加,吡喃糖氧化酶的酶活逐漸升高,誘導(dǎo)132 h時酶活達到約220 U/mL(圖7-A)。對不同誘導(dǎo)時間的發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE 蛋白電泳,結(jié)果(圖7-B)顯示,隨著誘導(dǎo)時間的增加,在85-100 kD處的條帶變濃重,與酶活的增長趨勢相對應(yīng)。

    圖7 10 L 發(fā)酵罐高密度發(fā)酵生產(chǎn) P2OFig.7 Production of P2O by high-density fermentation in 10 L bioreactor

    2.5 重組吡喃糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

    重組吡喃糖氧化酶作用葡萄糖的最適pH為6.5(圖8-A)。在pH 5的檸檬酸鹽緩沖液和pH 9的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中,P2O表現(xiàn)出約60%的相對活力。在pH 5-9范圍內(nèi),其相對酶活高于50%。當(dāng)pH低于5或高于9時,酶活開始隨著pH的降低或升高急劇下降(圖8-A)。P2O在較廣的pH范圍內(nèi)都表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性,尤其是對堿性條件有較強的耐性。在pH 4-9的緩沖液中放置24 h,酶活仍在80%以上(圖8-B)。

    圖8 最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.8 Optimal pH and pH stability

    P2O氧化葡萄糖的最適溫度為55℃(圖9-A),曲線呈典型的“鐘罩型”。溫度高于或低于55℃都導(dǎo)致其酶活下降。在30 min內(nèi),該酶在不超過60℃條件下熱穩(wěn)定性良好(圖9-B)。當(dāng)溫度升高至80℃時,30 min內(nèi) P2O完全失活。

    圖9 最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.9 Optimal temperature and temperature stability

    不同濃度的金屬離子對吡喃糖氧化酶的酶活影響如圖10所示。金屬離子Cu2+對該酶酶活的抑制作用較大,與周亞萍報道的研究結(jié)果一致[26-27]。在金屬離子濃度為 10 mmol/L 時,Mn2+、Co2+對其有激活作用(圖10),分析其原因可能是該濃度下的這兩個金屬離子與酶結(jié)合改變了酶的空間結(jié)構(gòu)(尤其是活性部位的結(jié)構(gòu)),對酶的活性有了促進作用,但其調(diào)控機制有待進一步深入研究。P2O的底物專一性較好,以葡萄糖為最適底物(圖11),對麥芽糖也有一定活性,對其他單糖或二糖不顯示催化活性。

    圖11 P2O的底物特異性Fig.11 Substrate specificity of P2O

    3 討論

    吡喃糖氧化酶(P2O)是以黃素蛋白(FAD)為輔酶的氧化還原酶類,具有多底物催化特性,可催化葡萄糖、山梨糖、木糖等多種糖類化合物。近年來吡喃糖氧化酶越來越受到重視,該酶在降解木質(zhì)素[2,25]、食品技術(shù)[2,28]、制作生物傳感器[29]等方面有重要作用。P2O還可以用于檢測糖尿病人血糖控制的重要指標(biāo) 1,5-脫水葡萄糖醇(1,5-AG)[30]。葡萄糖氧化酶和己糖激酶只能作用于β-D-葡萄糖,而吡喃糖氧化酶能作用于α-和β-D-葡萄糖,對葡萄糖有更高的親和性,因此,吡喃糖氧化酶無需變旋即可檢測血液中或食物中的葡萄糖[31]。

    目前,P2O已經(jīng)在大腸桿菌中得到了異源表達,在真核表達系統(tǒng)中尚無報道。并且P2O在大腸桿菌中進行重組表達時容易形成包涵體,表達量低,不易分離,給工業(yè)應(yīng)用帶來一定的限制,因此,利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)吡喃糖氧化酶的大量生產(chǎn)成為了研究熱點。畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用較廣、外源蛋白表達效果較理想的表達系統(tǒng)之一[21],與原核表達系統(tǒng)相比,具有很多優(yōu)點,如生長迅速,遺傳操作簡單,有可誘導(dǎo)的強啟動子AOX1,啟動外源基因高效表達,并能正確翻譯和翻譯后加工,被廣泛用于各種具有工業(yè)用途的重組蛋白的生產(chǎn)。

    研究發(fā)現(xiàn),P2O廣泛分布于白腐真菌中,本研究選用的擔(dān)子菌綱變色栓菌(Trametes versicolor)是白腐真菌的一種,常用于實驗和科研檢測。我們在NCBI中選取了幾個含有吡喃糖氧化酶基因序列的真菌,分別對不同的基因序列進行密碼子優(yōu)化,轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中表達,通過酶活力和穩(wěn)定性的檢測發(fā)現(xiàn),本研究選用的基因序列優(yōu)化后表達的吡喃糖氧化酶的酶活力較高,且穩(wěn)定性較好。

    本研究利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達吡喃糖氧化酶,通過分析影響蛋白表達量的因素,根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性對該基因序列進行優(yōu)化,提高該酶的表達量。合成基因序列的過程中,在該基因序列的3′端加入6個組氨酸標(biāo)簽,可以采用Ni2+親和層析柱親和純化蛋白。在10 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)時,經(jīng)過132 h酶活達到了220 U/mL。畢赤酵母可通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)大量生產(chǎn)重組蛋白,同時有利于簡化純化步驟,降低生產(chǎn)成本。本實驗還對重組吡喃糖氧化酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進行了研究,為該酶的應(yīng)用和改造提供一系列必要的初始參數(shù)。尤其是在血糖檢測用酶,要求所用的酶有較高的催化效率,較窄的底物譜,同時需要有良好的熱穩(wěn)定性。

    本研究在為吡喃糖氧化酶在真核表達系統(tǒng)中的表達提供了試驗及應(yīng)用依據(jù),同時,有效避免了在大腸桿菌中表達產(chǎn)生的弊端,開辟了一條全新的吡喃糖氧化酶的工業(yè)化高效生產(chǎn)途徑。

    4 結(jié)論

    本研究利用畢赤酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)了吡喃糖氧化酶的分泌表達,根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性對pyranose 2-oxidase基因進行密碼子優(yōu)化,將優(yōu)化后的基因序列克隆到畢赤酵母中,經(jīng)過轉(zhuǎn)化子篩選,得到了高產(chǎn)P2O的重組畢赤酵母菌株。最佳培養(yǎng)條件下吡喃糖氧化酶酶活在試管水平達到24 U/mL,在10 L發(fā)酵罐中對重組畢赤酵母菌株放大培養(yǎng),甲醇誘導(dǎo)132 h吡喃糖氧化酶酶活可達220 U/mL。進一步研究了其酶學(xué)性質(zhì),pH和溫度的穩(wěn)定性良好,并且底物專一性較好。

    猜你喜歡
    畢赤密碼子氧化酶
    HPV16E6與吲哚胺2,3-二氧化酶在宮頸病變組織中的表達
    密碼子與反密碼子的本質(zhì)與拓展
    10種藏藥材ccmFN基因片段密碼子偏好性分析
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:10
    非甲醇誘導(dǎo)重組畢赤酵母表達木聚糖酶的條件優(yōu)化
    菌絲霉素NZ2114畢赤酵母工程菌高效發(fā)酵工藝的研究
    廣東飼料(2016年1期)2016-12-01 03:43:01
    離心法分離畢赤酵母活細胞和死細胞
    TTC比色法篩選高存活率的畢赤酵母突變株
    小麥多酚氧化酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究
    嗜酸熱古菌病毒STSV2密碼子偏嗜性及其對dUTPase外源表達的影響
    茶葉多酚氧化酶及其同工酶的研究進展
    茶葉通訊(2014年2期)2014-02-27 07:55:39
    日本欧美国产在线视频| 国产有黄有色有爽视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费av不卡在线播放| 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久精品国产亚洲网站| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 久久久午夜欧美精品| 一本色道久久久久久精品综合| 视频中文字幕在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国国产精品蜜臀av免费| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 两个人免费观看高清视频| 老女人水多毛片| 午夜视频国产福利| 中文字幕免费在线视频6| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产综合精华液| 国精品久久久久久国模美| 亚洲综合色网址| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲国产精品专区欧美| 99热网站在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 另类亚洲欧美激情| 婷婷色麻豆天堂久久| 日韩中文字幕视频在线看片| 午夜福利影视在线免费观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 色94色欧美一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 黄色怎么调成土黄色| 国产视频内射| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品一国产av| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产精品99久久久久久久久| 欧美精品一区二区免费开放| 国产成人免费无遮挡视频| 999精品在线视频| 尾随美女入室| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 热99久久久久精品小说推荐| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 秋霞在线观看毛片| 国产探花极品一区二区| 国产精品偷伦视频观看了| 我的老师免费观看完整版| 亚洲怡红院男人天堂| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 免费观看的影片在线观看| av黄色大香蕉| 久久99一区二区三区| 日韩中文字幕视频在线看片| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品国产av在线观看| 天天操日日干夜夜撸| xxx大片免费视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 丝袜喷水一区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久影院123| 久久人人爽人人片av| 亚洲第一av免费看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品欧美亚洲77777| 一本一本综合久久| 精品人妻在线不人妻| 欧美精品一区二区大全| 制服人妻中文乱码| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产高清不卡午夜福利| 啦啦啦在线观看免费高清www| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品一二三| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲av免费高清在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 乱人伦中国视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲av不卡在线观看| 人妻 亚洲 视频| 18+在线观看网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 永久免费av网站大全| 91久久精品电影网| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 九色成人免费人妻av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 丰满少妇做爰视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 大话2 男鬼变身卡| 91久久精品电影网| 成人国产麻豆网| 国产男人的电影天堂91| 亚洲欧洲日产国产| 高清不卡的av网站| 我要看黄色一级片免费的| a级毛色黄片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久狼人影院| 国产精品一区www在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲成人一二三区av| 日韩视频在线欧美| 久久久久国产网址| 天堂中文最新版在线下载| a级毛片在线看网站| av网站免费在线观看视频| 黄片无遮挡物在线观看| av免费在线看不卡| 成人漫画全彩无遮挡| 国产高清国产精品国产三级| 伦理电影免费视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久精品区二区三区| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 男人添女人高潮全过程视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品一区二区在线观看99| 中文欧美无线码| 国产综合精华液| 在线观看www视频免费| 秋霞伦理黄片| 美女大奶头黄色视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 少妇的逼好多水| 亚洲精品一区蜜桃| 国产淫语在线视频| 国产精品.久久久| 久久精品国产自在天天线| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 少妇精品久久久久久久| 在线精品无人区一区二区三| 91久久精品电影网| 亚洲综合色惰| 国产高清有码在线观看视频| 欧美3d第一页| 久久亚洲国产成人精品v| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久99热6这里只有精品| 国产精品不卡视频一区二区| 交换朋友夫妻互换小说| 日本wwww免费看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 青春草国产在线视频| 黄色欧美视频在线观看| 全区人妻精品视频| 哪个播放器可以免费观看大片| www.色视频.com| 黄片播放在线免费| 日韩一区二区三区影片| 一个人免费看片子| 岛国毛片在线播放| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | av有码第一页| 大香蕉97超碰在线| 国产乱人偷精品视频| 五月开心婷婷网| 欧美精品一区二区免费开放| 人人妻人人澡人人看| 欧美丝袜亚洲另类| 午夜福利视频在线观看免费| 国产成人一区二区在线| 22中文网久久字幕| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩一本色道免费dvd| 日本av手机在线免费观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品 国内视频| 天美传媒精品一区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩免费高清中文字幕av| 考比视频在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 一边摸一边做爽爽视频免费| 天堂中文最新版在线下载| 9色porny在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 搡女人真爽免费视频火全软件| 老司机亚洲免费影院| 熟女av电影| www.色视频.com| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产色婷婷99| 欧美日韩综合久久久久久| 99视频精品全部免费 在线| 最黄视频免费看| 9色porny在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 久久国内精品自在自线图片| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲欧美一区二区三区国产| 少妇熟女欧美另类| 丰满饥渴人妻一区二区三| 中文字幕亚洲精品专区| av专区在线播放| 制服丝袜香蕉在线| 国产国语露脸激情在线看| 观看美女的网站| 久久精品久久久久久久性| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲综合色惰| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品 国内视频| 美女福利国产在线| 久久av网站| 日韩大片免费观看网站| 内地一区二区视频在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 人体艺术视频欧美日本| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲第一av免费看| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 青青草视频在线视频观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 成人手机av| 免费观看的影片在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 777米奇影视久久| 香蕉精品网在线| 91久久精品电影网| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲精品美女久久av网站| 精品久久久久久久久av| tube8黄色片| 亚洲熟女精品中文字幕| 一边摸一边做爽爽视频免费| av网站免费在线观看视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产不卡av网站在线观看| 色吧在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产男人的电影天堂91| 久久久a久久爽久久v久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 熟女人妻精品中文字幕| 日本黄大片高清| 久久 成人 亚洲| 国产精品人妻久久久久久| 精品久久蜜臀av无| 亚洲少妇的诱惑av| 人人妻人人澡人人看| 久久99热6这里只有精品| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲高清免费不卡视频| 黄色一级大片看看| 黄色怎么调成土黄色| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 国国产精品蜜臀av免费| 午夜影院在线不卡| 成人国语在线视频| 亚洲人成网站在线播| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久国内精品自在自线图片| 九九在线视频观看精品| 国产精品久久久久久av不卡| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美另类一区| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 多毛熟女@视频| videos熟女内射| 欧美日韩精品成人综合77777| 一级黄片播放器| 中文欧美无线码| 成人无遮挡网站| 色5月婷婷丁香| 精品久久国产蜜桃| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩三级伦理在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜激情av网站| 国产熟女欧美一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久热久热在线精品观看| 最新的欧美精品一区二区| 在线 av 中文字幕| 在线看a的网站| 观看美女的网站| 亚洲美女搞黄在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲成人手机| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美激情国产日韩精品一区| 黄片播放在线免费| 国产成人一区二区在线| 青青草视频在线视频观看| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 久久综合国产亚洲精品| 色5月婷婷丁香| 丰满乱子伦码专区| 日韩电影二区| 日韩av免费高清视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| tube8黄色片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 最近的中文字幕免费完整| 满18在线观看网站| 婷婷色综合www| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久青草综合色| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美少妇被猛烈插入视频| 中文字幕久久专区| 久久久国产一区二区| 免费黄频网站在线观看国产| 爱豆传媒免费全集在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 22中文网久久字幕| 免费av中文字幕在线| 国产成人精品无人区| 多毛熟女@视频| 丝袜脚勾引网站| av有码第一页| 成人国语在线视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 大话2 男鬼变身卡| 国产综合精华液| 午夜福利视频在线观看免费| 两个人的视频大全免费| 成人影院久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品久久久久久久电影| 久久ye,这里只有精品| 午夜精品国产一区二区电影| 免费高清在线观看日韩| 国产亚洲欧美精品永久| 另类精品久久| 熟女电影av网| 欧美国产精品一级二级三级| 飞空精品影院首页| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产亚洲最大av| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产免费福利视频在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产熟女欧美一区二区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 免费看不卡的av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 婷婷色av中文字幕| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 五月开心婷婷网| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美 日韩 精品 国产| 人妻夜夜爽99麻豆av| 中国国产av一级| 老女人水多毛片| 日韩人妻高清精品专区| 好男人视频免费观看在线| 日韩电影二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产片特级美女逼逼视频| a级片在线免费高清观看视频| 日韩制服骚丝袜av| 99热全是精品| av.在线天堂| 一二三四中文在线观看免费高清| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品国产国语对白av| 欧美最新免费一区二区三区| 最后的刺客免费高清国语| 99国产综合亚洲精品| 一本大道久久a久久精品| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲精品,欧美精品| 性色av一级| 欧美日韩在线观看h| 晚上一个人看的免费电影| 又大又黄又爽视频免费| 午夜福利视频在线观看免费| 有码 亚洲区| 久久毛片免费看一区二区三区| 伦理电影免费视频| 亚洲在久久综合| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美最新免费一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 国产永久视频网站| 青春草国产在线视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲国产欧美在线一区| 国产不卡av网站在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久鲁丝午夜福利片| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99国产综合亚洲精品| 在现免费观看毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩制服骚丝袜av| 男人添女人高潮全过程视频| 久久影院123| 久久亚洲国产成人精品v| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲中文av在线| 一本久久精品| 22中文网久久字幕| 999精品在线视频| 亚洲欧洲国产日韩| 一级爰片在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 国产在线免费精品| av不卡在线播放| a级毛片在线看网站| 热re99久久精品国产66热6| 26uuu在线亚洲综合色| 日日啪夜夜爽| 大码成人一级视频| kizo精华| 久久韩国三级中文字幕| 黄片播放在线免费| 一级爰片在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 十八禁网站网址无遮挡| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 免费观看的影片在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品久久久久久久久免| 日日撸夜夜添| av在线老鸭窝| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 91精品三级在线观看| 一区二区三区免费毛片| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲av.av天堂| 亚洲丝袜综合中文字幕| 午夜免费鲁丝| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产精品成人在线| 老熟女久久久| 日韩av免费高清视频| 亚洲,欧美,日韩| 午夜91福利影院| 国产成人精品无人区| 久久精品久久久久久久性| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产片内射在线| 国产在线免费精品| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 大香蕉久久成人网| 国产乱人偷精品视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 在线精品无人区一区二区三| 性色avwww在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 一区二区三区免费毛片| 午夜免费观看性视频| 国产又色又爽无遮挡免| 精品久久蜜臀av无| 日本91视频免费播放| 日韩大片免费观看网站| 成年av动漫网址| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品一二三区在线看| 国产精品 国内视频| 亚洲国产色片| 国产免费福利视频在线观看| 99久国产av精品国产电影| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 成人无遮挡网站| 九九在线视频观看精品| 插阴视频在线观看视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 午夜91福利影院| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 人妻人人澡人人爽人人| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲综合精品二区| 日本免费在线观看一区| 美女cb高潮喷水在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲欧美清纯卡通| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 春色校园在线视频观看| av.在线天堂| 色婷婷久久久亚洲欧美| 高清黄色对白视频在线免费看| 青春草国产在线视频| 久久久久久伊人网av| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 午夜日本视频在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 免费黄色在线免费观看| 少妇人妻 视频| 久热这里只有精品99| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久99热6这里只有精品| 女人精品久久久久毛片| 午夜福利,免费看| 春色校园在线视频观看| 午夜av观看不卡| av在线老鸭窝| xxxhd国产人妻xxx| 欧美精品一区二区大全| 中文字幕制服av| 日韩av免费高清视频| 国产精品.久久久| 九色亚洲精品在线播放| www.色视频.com| 久久亚洲国产成人精品v| 日韩免费高清中文字幕av| 中文欧美无线码| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 国产一区有黄有色的免费视频| 天美传媒精品一区二区| 边亲边吃奶的免费视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 人妻系列 视频| 日韩大片免费观看网站| 亚洲在久久综合| 男人爽女人下面视频在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 国产av一区二区精品久久| 99九九在线精品视频| 国产极品天堂在线| 久久久a久久爽久久v久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 乱人伦中国视频| 中国国产av一级| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美另类一区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲精品456在线播放app| 国产男女内射视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久人人爽人人片av| 爱豆传媒免费全集在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 女人精品久久久久毛片| 日本黄色日本黄色录像| 最近2019中文字幕mv第一页| 我的女老师完整版在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 少妇人妻精品综合一区二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品酒店卫生间| 国产精品国产三级国产专区5o| 精品久久蜜臀av无| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产乱来视频区| 久久久国产一区二区| 久久久久久久久久人人人人人人| 成人二区视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲av不卡在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲欧美精品自产自拍| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 欧美成人精品欧美一级黄| 久久久精品94久久精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲人成网站在线播|