高劑量單寧酸對小鼠腸道屏障和腸道菌群的影響

何亞倫 曾麗榮 劉雄 張鈴 王瓊

（武漢科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，武漢 430065）

單寧酸是一種水溶性多酚類物質(zhì)，在自然界中廣泛存在，具有抗癌、抗氧化、抗誘變、捕捉自由基、抑菌等特性，具有重要的開發(fā)利用價值［1］。目前它在食品加工、果蔬加工、貯藏、化妝品、醫(yī)藥和水處理等方面應(yīng)用越來越廣泛。近年來，單寧酸被發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外多種腫瘤中都具有抗癌作用。如在體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，單寧酸可以抑制多種癌細(xì)胞株的增殖，并且誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［2-6］。在動物實(shí)驗(yàn)方面，單寧酸和相關(guān)的綠茶多酚可以抑制小鼠乳腺腫瘤病毒的啟動子［7-8］。還有研究發(fā)現(xiàn)單寧酸能抑制多環(huán)芳烴對鼠傷寒沙門氏菌和中國倉鼠V79細(xì)胞的致突變性，抑制多環(huán)芳烴和n -甲基-n -亞硝基脲對小鼠皮膚、肺和前胃的致瘤作用［9］。單寧酸還具有一定的抗誘變能力，其原因可能由于其良好的抗氧化特性可以減少反應(yīng)代謝物的產(chǎn)生，同時降低其下游的部分有害影響［9-10］。據(jù)文獻(xiàn)報道，單寧酸在藥理方面也存在有益作用，如單寧酸可以通過其抗基因毒性和抗氧化潛能對抗順鉑（CP）誘導(dǎo)瑞士白化病小鼠的腎毒性和氧化應(yīng)激［11］。

單寧酸通常被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它可以與蛋白質(zhì)、消化酶、生物堿、多糖和金屬離子結(jié)合形成沉淀，減少動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。單寧酸特別是大劑量單寧酸的急性毒性已被證實(shí)［12］。研究表明，單寧酸抑制動物腸道消化酶和營養(yǎng)物質(zhì)吸收［13］。Hervás等［14］發(fā)現(xiàn)連續(xù)飼喂高劑量濃縮單寧（3.0 g/kg體重）10 d后，綿羊胃腸道黏膜出現(xiàn)潰瘍、增厚、腫脹和大量水樣。使用含有高含量單寧的高粱喂食老鼠后，其十二指腸壁的厚度和腺管的長度略減少，胃黏膜壞死，膽囊萎縮，腸上皮細(xì)胞耗氧量下降，腸內(nèi)腔的形態(tài)和代謝有顯著改變［15-16］。這些研究均表明，大劑量單寧酸對消化系統(tǒng)的損害與腸黏膜屏障密切相關(guān)，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。

雖然單寧酸本身毒性很小，但是如果大量使用，可能會造成不可預(yù)知的后果。有研究表明，400 mg/mL縮合單寧可以抑制瘤胃內(nèi)許多細(xì)菌的生長［17］。單寧酸能抑制幽門螺桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌的生長和定植［18］。但是，大劑量單寧酸對腸道菌群的影響還不清楚。因此，本研究以正常飲食小鼠和高脂飲食誘導(dǎo)肥胖模型小鼠為研究對象，并基于16S rRNA基因測序技術(shù)，分析高濃度單寧酸（400 mg/kg體重）對正常飲食及肥胖小鼠腸道屏障及腸道菌群的影響，為單寧酸的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

單寧酸（CAS號1401-55-4，相對分子質(zhì)量為1 701.20）購買于Sigma公司；氯仿、異丙醇、甲醇、無水乙醇、二甲苯、鹽酸（分析純）購自國藥化學(xué)試劑有限公司；4%多聚甲醛固定液和脫脂奶粉購自武漢Servicebio有限公司；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（貨號：AP-GX-50）購自美國 Axygen 公司 ；QIAamp DNA Stool Mini Kit（貨號 ：51604）購自QIAGEN公司。甘油三酯（TG；貨號：A110-1-1）、總膽固醇（T-CHO；貨號：A111-1-1）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C；貨號：A112-1-1）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C；貨號：A113-1-1）購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 小鼠與飲食 所有C57BL6J雄性小鼠（15周齡）均購自南京大學(xué)模型動物研究中心。實(shí)驗(yàn)開始前飼養(yǎng)1周，單籠飼養(yǎng)，室溫（20±2）℃，相對濕度（50±10）%，光照周期為 12 h，自由飲食飲水。32只小鼠隨機(jī)分為4組：正常飲食組（ND，n=8），高脂飲食組（HFD，n=8），單寧酸正常飲食組（ND+TA，n=8），單寧酸高脂飲食組（HFD+TA，n=8）。每日上午10點(diǎn)給小鼠進(jìn)行灌胃，單寧酸正常飲食組（ND+TA）和單寧酸高脂飲食組（HFD+TA）以400 mg/kg BW的劑量灌胃單寧酸溶液（40 g/L），灌胃溶液體積為0.1 mL/10 g BW，正常對照組和肥胖對照組按0.1 mL/10 g BW的劑量灌胃生理鹽水。每天定時對小鼠體重和攝食量進(jìn)行稱量。4組動物均連續(xù)灌胃 9 d，試驗(yàn)結(jié)束時收集新鮮糞便于-80℃條件下保存，用于后續(xù)分析測定。于小鼠處死前一晚，撤去小鼠飼料，更換墊料，禁食不禁水。12 h后，采取小鼠尾尖采血法，利用羅氏微型血糖儀（Accu-Chek Softclix）檢測血糖值，記為空腹血糖。采取摘眼球法取血，4℃靜置過夜，1 684×g 離心10 min，所得上清分裝保存于-80℃冰箱。小鼠頸椎脫臼處死后并將其解剖，記錄各個臟器組織的重量。將所取組織經(jīng)液氮速凍后，儲存于-80℃冰箱。本實(shí)驗(yàn)通過武漢科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院科學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（20190000206）。

1.2.2 血脂相關(guān)指標(biāo)檢測 利用酶標(biāo)儀測量吸光度，計算出小鼠空腹血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量。

1.2.3 結(jié)腸組織學(xué)分析 取新鮮附睪脂肪和結(jié)腸組織1 cm左右于預(yù)冷的4%多聚甲醛中固定24 h后，進(jìn)行脫水，石蠟包埋切片，片厚4 μm。再將切片脫蠟至水，蘇木素染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，最后脫水封片。

1.2.4 RT-qPCR 用Trizol試劑提取組織樣本總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用SYBR熒光染料進(jìn)行熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括 10 μL SYBR 熒光染料，2 μL 引物（10 μmol/L），1 μL cDNA，7 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性，95℃，3 min；95℃變性，10 s；退火，56℃，30 s；延長，72℃，30 s，共40個循環(huán)。2-ΔΔCt相對定量分析的方法。所有用于RT-qPCR的引物均列于表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers’ sequences for RT-qPCR

1.2.5 16 S rRNA測序分析 稱取糞便樣品 200 mg，根據(jù)QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒說明書進(jìn)行總 DNA 抽提，用 515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和 926R 5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′引物對V4-V5可變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。采用Usearch（Vsesion 7.0）軟件對優(yōu)化后的序列進(jìn)行OTU聚類分析。利用Mothur（version v.1.30.1）軟件計算Alpha多樣性，反映物種多樣性和豐度。采用R語言計算PCA、PCoA和NMDS來反映各組樣品之間的差異和距離。使用R語言工具分別在門水平和屬水平分析各組不同水平的腸道菌群組成。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析采用Excel進(jìn)行，多組之間差異分析采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為基準(zhǔn)代表具有統(tǒng)計學(xué)差異。數(shù)據(jù)結(jié)果在GraphPad Prism 6.0軟件中按照Mean SEM作圖。

2 結(jié)果

2.1 口服高濃度單寧酸使體重快速降低

正常15周C57BL/6J小鼠和肥胖模型小鼠灌胃高劑量（400 mg/kg BW）單寧酸溶液，對照組灌胃等量生理鹽水。高劑量單寧酸干預(yù)9 d后，每組選取8只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。體重變化如圖所示，高劑量單寧酸可顯著降低普通小鼠及肥胖小鼠的體重，正常小鼠體重下降（3.57±0.47）g，肥胖小鼠體重下降（2.32±0.81）g（圖1-A，B）。與對照組相比，高劑量單寧酸顯著降低了正常小鼠和肥胖模型小鼠的進(jìn)食量（圖1-C）。但是小鼠體內(nèi)脂肪質(zhì)量并沒有顯著改變（圖1-D），脂滴面積明顯減少（圖2-A，B）。高劑量單寧酸短期干預(yù)后各項(xiàng)血糖血脂檢測指標(biāo)無顯著變化（結(jié)果未附）。結(jié)果表明，小鼠體重的減輕與食物攝入量降低可能有直接關(guān)系。

圖1 高劑量單寧酸對小鼠體重的影響Fig.1 Effects of high-dose tannic acid on the body weights of the mice

圖2 高劑量單寧酸對小鼠體脂的影響Fig.2 Effects of high-dose tannic acid on the body fats of the mice

2.2 高劑量單寧酸對腸道結(jié)構(gòu)的影響

如圖3-A所示，與正常小鼠相比，長期高脂飲食導(dǎo)致小鼠小腸、回腸和結(jié)腸質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），高劑量單寧酸干預(yù)9 d后小鼠腸道質(zhì)量無顯著變化。與對照組相比，口服高劑量單寧組小腸和盲腸內(nèi)容物含量有所增加，但差異不顯著，結(jié)腸內(nèi)容物含量顯著增加（P＜0.05）（圖3-B）。結(jié)腸組織組織學(xué)分析顯示（圖3-C-E），ND組小鼠結(jié)腸組織有黏膜腺體排列，有完整的隱窩和表面上皮。HFD組小鼠腸黏膜和黏膜下層均有輕微炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜腺體未對齊，杯狀細(xì)胞數(shù)量和隱窩深度均有顯著變化（P＜0.01）。與ND組相比，高劑量補(bǔ)充單寧酸后，ND+TA組結(jié)腸組織黏膜層隱窩長度明顯縮短，杯狀細(xì)胞受損2/3。與HFD組相比，HFD+TA小鼠結(jié)腸黏膜和結(jié)腸上皮層炎癥細(xì)胞浸潤較多，隱窩長度縮短至原來的1/2。組織損傷評分見圖3-F，結(jié)腸組織學(xué)分析顯示，口服高劑量單寧酸加重了高脂飲食小鼠結(jié)腸損傷的嚴(yán)重程度，降低了結(jié)腸隱窩長度，減少了杯狀細(xì)胞數(shù)量，并伴有一定程度的炎癥浸潤。

圖3 高劑量單寧酸對腸道結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of high-dose tannic acid on the intestinal structure

2.3 高劑量單寧酸對腸道屏障的影響

腸內(nèi)容物與腸上皮之間的腸黏膜屏障具有潤滑和化學(xué)屏障的雙重作用，而杯狀細(xì)胞數(shù)量的減少提示高劑量單寧酸可能會影響腸黏液的分泌。Muc2是腸道黏液的主要分泌物，通過RT-qPCR對腸道內(nèi)Muc2的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和各自的對照組ND組和HFD組相比，ND+TA和HFD+TA組Muc2 mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）（圖4-A），說明高劑量單寧酸降低了腸黏液Muc2的分泌。

腸黏膜屏障以緊密連接蛋白最為重要，它與多種腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展以及全身缺血缺氧后出現(xiàn)腸損傷、腸黏膜屏障功能受損等有著密切關(guān)系。對緊密連接蛋白進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，高脂飲食輕微下調(diào)屏障功能相關(guān)基因ZO-1、Occlucin及Claudin的相對表達(dá)量，但無顯著影響。而高濃度的單寧酸干預(yù)后，小鼠結(jié)腸中ZO-1、Occlucin及Claudin mRNA表達(dá)均顯著下降（圖4-B），說明高濃度的單寧酸對正?；蚍逝中∈蠖加衅茐哪c道屏障的作用。這些結(jié)果表明，高劑量單寧酸破壞了腸緊密連接蛋白，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損。

圖4 高劑量單寧酸對腸道屏障的影響Fig.4 Effect of high dose tannic acid on the intestinal barrier

2.4 高劑量單寧酸對小鼠腸道微生物多樣性的影響

為了研究高劑量單寧酸對小鼠腸道微生物多樣性的影響，本研究通過16S rRNA測序分析比較了小鼠腸道菌群組成的差異。Alpha多樣性包括chao指數(shù)、ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、PD_whole_tree指數(shù)等，反映了物種豐富度和多樣性。由圖5-A可知，與ND組相比，HFD組的Sobs指數(shù)和ace指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），提示長期高脂飼料可能會增加腸道菌群的豐富度；ND+TA組Sobs指數(shù)、chao指數(shù)、ace指數(shù)均顯著高于ND組（P＜0.001），HFD+TA組顯著低于HFD組（P＜0.001）。結(jié)果顯示，正常小鼠高劑量單寧酸的物種豐富度顯著增加，肥胖小鼠高劑量單寧酸的物種豐富度顯著降低。各組Shannon指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)均不顯著。與ND組相比，HFD組的PD_whole_tree指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；ND+TA 組的PD_whole_tree指數(shù)顯著高于 ND組（P＜0.001），HFD+TA組 的 PD_whole_tree指數(shù)顯著低于HFD組（P＜0.05）。說明口服高劑量單寧酸后，小鼠體內(nèi)微生物多樣性發(fā)生了變化。

為了確定不同處理組之間的相似性，采用加權(quán)UniFrac距離（β-diversity的代表標(biāo)志）的主坐標(biāo)分析（PCA、PCoA和NMDS）圖。如圖5-B所示，正常飼料組和高脂飼料組的微生物組成不同，ND和ND+TA的微生物組成相似，HFD和HFD+TA的微生物組成也相似。結(jié)果表明，高劑量單寧酸沒有明顯改變小鼠原有的腸道微生物組成。利用維恩圖可以計算出多個樣本中共同和唯一的OTU的數(shù)量，直觀的顯示出多個樣本之間群落組成的相似度和重疊度。4組共取217份，ND組獨(dú)有的OTU數(shù)為17個，ND+TA組獨(dú)有的OTU數(shù)為42個，ND+TA組與ND組共有311個，HFD組唯一的OTU數(shù)只有3個獨(dú)立的OTU，HFD+TA組與HFD組共有311個OTU（圖5-C）。門水平熱圖（圖5-D）表明，高劑量單寧酸對小鼠腸道微生物多樣性有顯著影響。

圖5 高劑量單寧酸對肥胖小鼠腸道微生物多樣性的影響Fig.5 Effects of high dose tannic acid on the intestinal microbial diversity of the obese mice

2.5 高劑量單寧酸對肥胖小鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)的影響

從圖6可以看出，與ND相比，HFD組擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度顯著降低（P＜0.001），厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）顯著升高（P＜0.01、P＜0.001），厚壁菌門與擬桿菌門的比值顯著升高（P＜0.05），提示肥胖小鼠腸道紊亂。高劑量單寧酸干預(yù)后，和ND組相比，擬桿菌門的比例在ND+TA組中降低了12%，厚壁菌門的比例在ND+TA組中增加了11%；和HFD組相比，擬桿菌門的比例在HFD+TA組中增加了3%，厚壁菌門的比例在HFD+TA組中減少了4%，但是這些趨勢均無顯著性差異。在屬的水平上（圖7），和ND組比較，普通飲食組中單寧酸的添加增加了Alistipes和Ruminococcus的含量。和HFD組相比，高脂飲食組中單寧酸的添加增加了Blautia Oscillibacter和Lachnoclostridium的含量，降低了Anaerotruncus的含量。

圖6 在門水平上的物種組成成分及組間差異分析Fig.6 Analysis of species composition and inter-group differences at the phylum level

圖7 在屬水平上的物種組成成分及組間差異分析Fig.7 Analysis of species composition and inter-group differences at the genus level

3 討論

高劑量單寧酸的干預(yù)使普通小鼠及肥胖小鼠的體重和進(jìn)食量顯著降低，脂滴面積明顯減少，但是小鼠體內(nèi)脂肪質(zhì)量并沒有顯著改變，各項(xiàng)血糖血脂檢測指標(biāo)無顯著變化。這些結(jié)果表明，小鼠體重的減輕可能與食物攝入量降低有直接關(guān)系，這與單寧酸所具有的抗?fàn)I養(yǎng)特性相關(guān)。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加一定劑量的單寧酸可以防止仔豬腹瀉、促進(jìn)仔豬生長［19］。并且單寧酸可以提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率、促進(jìn)肉雞體重的增長［20］。這些研究表明單寧酸對體重具有雙向調(diào)節(jié)作用。在飼料中添加合適的劑量單寧酸可以促進(jìn)體重增長，這可能與單寧酸的收斂作用減緩了腸道蠕動使得營養(yǎng)物質(zhì)得到更好的消化吸收有關(guān)。但是高劑量單寧酸則會起到降低體重的作用，這可能是與單寧酸所造成的食物攝入量降低相關(guān)。

高劑量單寧酸干預(yù)后小鼠各段腸道內(nèi)容物含量的增加說明高劑量單寧酸的干預(yù)使小鼠體內(nèi)的消化吸收受到抑制，進(jìn)而影響到小鼠的食欲，使食物攝入量降低。進(jìn)一步結(jié)腸組織學(xué)分析顯示，口服高劑量單寧酸降低了結(jié)腸隱窩長度，而結(jié)腸隱窩長度的減少表明腸道表面積的減少，不利于腸道吸收［21］，與上述結(jié)果中小鼠體內(nèi)各腸段中內(nèi)容物含量的增加相一致。杯狀細(xì)胞是位于黏膜柱狀上皮細(xì)胞之間的黏液分泌細(xì)胞，可以合成和分泌黏液蛋白，與消化道內(nèi)的水、無機(jī)鹽、抗菌肽共同形成黏液屏障［22-23］。本研究中，口服高劑量單寧酸減少了杯狀細(xì)胞數(shù)量，提示高水平單寧酸可能會降低腸道黏液的分泌。Muc2是腸道黏液的主要分泌物，Muc2表達(dá)量的變化會影響腸道通透性及腸黏膜免疫功能，進(jìn)而影響腸黏膜屏障［24］。而腸黏膜屏障以緊密連接蛋白最為重要，它與多種腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展以及全身缺血缺氧后出現(xiàn)腸損傷、腸黏膜屏障功能受損等有著密切關(guān)系。通過RT-qPCR對腸黏液MUC2和緊密連接蛋白進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，高劑量單寧酸降低了腸黏液MUC2的分泌和小鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白ZO-1、Occlucin及Claudin mRNA表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，高劑量單寧酸破壞腸道緊密連接蛋白，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，這在一定程度上影響了小鼠對食物的消化吸收。因此可以推測小鼠腸道屏障功能的破壞可能是高劑量單寧酸干預(yù)后小鼠體重快速下降的主要潛在原因。

此外，高劑量單寧酸明顯改變了小鼠腸道微生物的物種豐富度和多樣性。高劑量單寧酸干預(yù)正常小鼠會使其腸道菌群物種豐富度顯著增加，而干預(yù)肥胖小鼠則會使其腸道菌群物種豐富度顯著降低。高劑量單寧酸干預(yù)后，小鼠體內(nèi)微生物多樣性發(fā)生了變化，但是高劑量單寧酸沒有明顯改變小鼠原有的腸道微生物組成。在門的水平上，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是門中比較典型的兩種細(xì)菌，其比例的增加是腸道失調(diào)的標(biāo)志［25］。高劑量單寧酸雖然可以在一定程度上改變腸道菌群的組成，但是因?yàn)楦深A(yù)時間不夠久，這些改變并無顯著性差異。并且高脂組中腸道菌群的改變趨勢低于普通飼料組，說明高脂飼料可能會影響到單寧酸對腸道菌群的影響。在屬的水平上，單寧酸的添加可以促進(jìn)SCFAs菌Alistipes、Ruminococcus和Blautia的生成，可以起到預(yù)防炎癥，維持腸道穩(wěn)態(tài)的作用［26-27］。說明單寧酸的添加可能會對機(jī)體的腸道微生物組成起到正向的調(diào)節(jié)作用。據(jù)報道，Alistipes和Oscillibacter菌在發(fā)生肥胖的時候會顯著減少［28］，說明這兩種菌與肥胖的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。單寧酸的添加增加了這兩種肥胖相關(guān)菌群Alistipes和Oscillibacter的含量，因此，可以推測本研究中單寧酸造成的體重降低可能與腸道菌群的變化有一定的相關(guān)性。目前尚不清楚所觀察到的腸道微生物群變化是對單寧酸變化的直接反應(yīng)，還是通過黏膜免疫反應(yīng)的變化間接介導(dǎo)的。雖然本研究結(jié)果表明，單寧酸、結(jié)腸損傷和糞便微生物群變化之間存在聯(lián)系，但仍需要進(jìn)一步探索不同劑量單寧酸對腸道屏障和腸道菌群的影響，以更好地了解單寧酸毒性作用。

4 結(jié)論

高劑量單寧酸干預(yù)可顯著降低普通小鼠及肥胖小鼠的體重和進(jìn)食量，并且使小鼠各腸段內(nèi)容物含量有所增加，其中結(jié)腸內(nèi)容物含量得到顯著增加。高劑量單寧酸干預(yù)加重了高脂飲食小鼠結(jié)腸損傷的嚴(yán)重程度，破壞了腸緊密連接蛋白，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損。此外，高劑量單寧酸明顯改變了小鼠腸道微生物的物種豐富度和多樣性，并且可以促進(jìn)SCFAs產(chǎn)生菌Alistipes、Ruminococcus和Blautia以及肥胖負(fù)相關(guān)菌群Alistipes和Oscillibacter的含量增多。