MFG-E8作為外泌體載體蛋白的作用與功能

黎智康 劉晨雪璇 譚楚敏 熊盛，2 謝秋玲

（1.暨南大學生命科學技術學院，廣州 510632；2.基因工程藥物國家工程研究中心，廣州 510632）

外泌體（exosomes）是一種直徑在30-100 nm左右，具有脂質雙分子層結構的內源性囊泡，包含蛋白質、脂質和核酸等內容物。外泌體能被幾乎所有的細胞分泌，并存在于血液、尿液、乳汁和羊膜液等體液中［1］，在細胞通訊和疾病的診斷方面發(fā)揮著重要作用。此外，由于外泌體的生物相容性好，能夠穿透血腦屏障以及在機體循環(huán)中具有較長的半衰期［2］，因此近年來，外泌體作為藥物載體成為了外泌體領域的一個研究熱點。

外泌體可以裝載包括核酸、小分子和蛋白類藥物在內的多種物質［3-4］，其中，對于外泌體裝載蛋白質的方法有直接和間接兩種。直接裝載通過物理、化學方法將外源蛋白質載入外泌體中，該方法操作簡單，但存在裝載率低、影響蛋白質活性等缺點［5］。間接裝載將目的蛋白基因轉染供體細胞，使其在細胞內進行重組表達，蛋白在外泌體分泌過程中被包裹進去［6］。關于胞內蛋白分選進入外泌體的機制主要有兩種，即內吞體分選轉運復合體（ESCRT）依賴機制和ESCRT非依賴機制［7］。ESCRT依賴機制涉及TSG101和ALIX等蛋白的分選［8］，ESCRT非依賴機制則與四跨膜蛋白（如CD81等）的分選相關［9］，但兩種分選機制的確切情況尚未被闡明，因而間接裝載的方法難以控制蛋白質的裝載過程和裝載量［10］。所以目前在使用間接方法時，往往把目的蛋白與外泌體膜蛋白融合表達，如CD63、CD9等［11-12］，利用這些膜蛋白將目的蛋白定向帶入外泌體中。

乳脂肪球表皮生長因子Ⅷ（milk fat globule epidermal growth factor 8，MFG-E8）是最初在乳房上皮細胞中發(fā)現(xiàn)的親脂性糖蛋白［13］，是乳脂球膜（milk fat globule membrane，MFGM）中最主要的蛋白質之一。研究發(fā)現(xiàn)，人源的MFG-E8有3個結構域，即EGF-L、C1和 C2結構域［14］。MFG-E8能促進巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬作用，并在血管生成、自身免疫疾病和腫瘤中扮演著重要的角色［15］。此外，外泌體上含有MFG-E8［16］，且MFG-E8還能夠黏附在細胞膜上，具有運載目的蛋白的潛力，因此考慮將其作為載體蛋白。

本研究通過構建人源MFG-E8不同結構域組合的截短體質粒，并融合表達綠色熒光蛋白，在HEK293F細胞中表達，收集其分泌的外泌體，觀察各組分將EGFP帶入外泌體的情況。用外泌體轉染HEK293T細胞，進一步探討MFG-E8各結構域的功能，為深入了解MFG-E8作為外泌體載體蛋白提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293F細胞由南開大學惠贈、HEK293T細胞為本實驗室保存；轉染試劑PEI購自Polysciences公司；Anti-EGFP Mouse mAb和 Anti-CD9 Rabbit mAb購自Abcam公司、Anti-mouse GAPDH購自Cell signaling technology公司；熒光染料DAPI和DIL購自Beyotime公司；質粒大抽試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 構建MFG-E8及其截短體的重組質粒 以質粒pCMV為載體，構建人源MFG-E8全長及其不同截短體（圖1-A），分別為C1C2、EFG-L-C1（EC1）、EFG-L-C2（EC2）、C1、C2 和 EFG-L，MFG-E8 和系列截短體的5′端保留信號肽，在3′端加入Linker連接有熒光蛋白EGFP，以便后續(xù)對MFG-E8各結構域在細胞中的定位進行觀察。PCR擴增各截短體的基因序列，酶切，對上述MFG-E8及其截短體目的基因進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并進行測序。

1.2.2 重組質粒的表達與外泌體的提取鑒定 以1∶2的 DNA∶PEI比例和 1 μg/106的質粒濃度對HEK293F細胞進行轉染。轉染前，對細胞進行傳代，細胞數(shù)量保持每皿1×106個細胞，且細胞活率在90%以上。

采用超速離心法提取外泌體，細胞培養(yǎng)液先4℃，300×g離心10 min，棄沉淀。然后分別在2 000×g、10 000×g下各離心30 min，棄去亞細胞沉淀。最后以100 000×g離心70 min獲得外泌體沉淀，用適當PBS重懸后過0.22 μm濾膜，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

取少量外泌體，用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。同時，對提取所得的外泌體進行NTA粒徑分析。

1.2.3 納米顆粒跟蹤分析（NTA） 取少量外泌體，用 PBS將其稀釋到（1×108）-（1×109）particles/mL，用NS300儀器對外泌體進行粒徑分析。

1.2.4 Western blot檢測 轉染HEK293F細胞4 d后，離心收集細胞培養(yǎng)液的上清和沉淀。以上清液、細胞沉淀和提取的外泌體為樣品，分別加入上樣緩沖溶液，在12% SDS-PAGE膠中電泳，隨后300 mA轉膜1 h，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗anti-EGFP（1∶5 000）4℃ 孵育過夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗孵育1 h，同樣洗膜3次后在膜上滴加發(fā)光顯影液，用凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白表達與存在情況。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察截短體的細胞定位 將 pCMV-MFG-E8-EGFP、pCMV-EGF-L-EGFP、pCMV-EC1-EGFP、pCMV-C1C2-EGFP四種重組質粒瞬轉HEK293F細胞后48 h，離心收集以上4種細胞和未轉染載體的HEK293F細胞（作為空白對照），用4%多聚甲醛固定15 min，使用PBS清洗后加入0.25% TritonX-100通透液孵育15 min，再次用PBS清洗后用不同染料（DAPI：核染料、DIL：膜染料）分別孵育5 min。最后經PBS清洗、重懸細胞，放入共聚焦皿，滴加少量抗熒光淬滅劑，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 電鏡觀察外泌體中的目的蛋白 為了能更直觀地觀察外泌體上目的蛋白的存在位置，將分別含有MFG-E8-EGFP、EC1-EGFP和C1C2-EGFP的3種外泌體與偶聯(lián)EGFP抗體的膠體金顆粒4℃ 孵育過夜，之后將樣品滴在銅網(wǎng)上，風干置于電鏡下觀察。

1.2.7 外泌體轉染HEK293T細胞 將含有EGFP的外泌體等量加入HEK293T細胞培養(yǎng)液中，經過3 h孵育后，用胰酶消化，離心細胞，PBS清洗，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的位置情況。

2 結果

2.1 MFG-E8及其截短體表達載體的構建

設計不同缺失的截短體（圖1-A），構建包括全長MFG-E8在內的7種重組質粒，統(tǒng)一在5′端保留信號肽，在3′端加入Linker連接有熒光蛋白EGFP。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示與各目的基因預期大小相一致（圖1-B），測序結果也完全正確。MFG-E8及其截短體重組質粒構建成功。

圖1 MFG-E8-EGFP及截短體結構及酶切鑒定凝膠電泳圖Fig.1 Structure of MFG-E8-EGFP and its truncated forms as well as gel electrophoresis plots for identification by enzyme digestion

2.2 MFG-E8及其截短體在HEK293細胞上的表達

將構建成功的質粒轉染HEK293F細胞，2 d后用流式細胞分析儀檢測蛋白表達情況。流式結果顯示，截短體C1C2和C2的瞬轉效率較低，分別為44.43%和32.66%，其他重組質粒的瞬轉效率均超過50%，其中EGF-L的瞬轉效率最高，為76%（圖2-A）。說明EGF-L的表達最高，而C1C2和C2的表達量較低。

圖2-B顯示了WB檢測目的蛋白在胞內的表達情況，根據(jù)分子量大小，各截短體在細胞內均有表達，其中EGF-L表達量最高，C2最低。從圖2-C可以看出，在上清液中只檢測到EGF-L、C1和EC1的表達，其中EGF-L表達量遠大于C1、EC1，說明只有這3種蛋白可以分泌到胞外，其他蛋白雖然帶有信號肽卻沒有分泌到培養(yǎng)上清中。

圖2 重組質粒瞬轉效率和表達情況的檢測Fig.2 Detection of the transient efficiency and expression of the recombinant plasmids

2.3 MFG-E8蛋白各組分在細胞上的定位

為了進一步檢測表達的幾種重組蛋白所在的細胞定位，對轉染pCMV-MFG-E8-EGFP、pCMV-EGFL-EGFP、pCMV-EC1-EGFP、pCMV-C1C2-EGFP四種重組質粒的HEK293F細胞進行激光共聚焦顯微鏡觀察。結果（圖3）表明，轉染MFG-E8-EGFP和C1C2-EGFP重組質粒的細胞在膜上都有較強的綠色熒光信號，顯示目的蛋白存在于細胞膜上。轉染EC1-EGFP的細胞僅有微弱的綠色熒光，熒光呈現(xiàn)點狀圍繞細胞膜。轉染EGF-L-EGFP的細胞其綠色熒光分散地分布在細胞中，與其他組綠色熒光位置相比較，該組熒光沒有成環(huán)狀，提示EGF-L-EGFP不在細胞膜上，而是存在于細胞質當中。這與此前WB結果相一致，EGF-L既表達分布在胞內，也可以分泌到培養(yǎng)上清中，但帶有C1C2或C2的蛋白雖然也有信號肽，卻黏附于膜上，不能分泌到培養(yǎng)上清中。

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測MFG-E8及其截短體在細胞中的定位Fig.3 Location detection of MFG-E8 and its truncated proteins in HEK293 cells by laser confocal microscopy

2.4 外泌體的提取鑒定

利用超速離心法得到轉染了重組質粒的HEK293F細胞分泌的外泌體。電鏡觀察結果如圖4-A，可以見到杯狀或球狀的半透明囊泡樣結構，該結構具有與細胞膜相同的雙層膜結構。NTA粒徑分析結果表明所提取的顆粒大小在80-150 nm之間，屬于外泌體的粒徑范圍內（圖4-B）。據(jù)此，可以推斷超速離心所得沉淀大部分為外泌體。

圖4 外泌體的電鏡結構和粒徑分析Fig.4 Transmission electron micrograph and size distributions of exosomes

2.5 MFG-E8及其各組分在外泌體中的定位

對轉染了7種重組質粒的細胞進行外泌體提取，以CD9為外泌體的標志物，使用EGFP抗體，WB檢測MFG-E8和各截短體在外泌體中的存在情況。如圖5-A所示，在外泌體中僅有MFG-E8-EGFP、C1C2-EGFP和EC1-EGFP被檢測到，而且MFG-E8-EGFP的表達量高于后兩者，其他截短體則沒有在外泌體中發(fā)現(xiàn)。此結果表明，MFG-E8、C1C2、EC1能將EGFP攜帶到外泌體中，但攜帶效率不盡相同，而其他幾種蛋白難以有效攜帶目的蛋白進入外泌體中。

將外泌體與偶聯(lián)了EGFP抗體的金顆粒孵育，利用電鏡進一步觀察上述3種外泌體上EGFP的存在情況（圖5-B），發(fā)現(xiàn)3種外泌體上均可以觀測到目的蛋白的存在。由于偶聯(lián)了EGFP抗體的金顆粒無法進入外泌體內部，表明熒光蛋白EGFP位于外泌體的外層膜上。3種外泌體中，MFG-E8-EGFP結合的金顆粒較EC1-EGFP和C1C2-EGFP多，說明全長MFG-E8所攜帶的目的蛋白最多，該結果與之前WB結果相符合。

圖5 EGFP在外泌體中存在情況的鑒定Fig.5 Identification of EGFP in exosomes

2.6 外泌體轉染293T細胞

將含有MFG-E8-EGFP、EC1-EGFP和C1C2-EGFP的3種外泌體轉染HEK293T細胞后，用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)3種外泌體轉染HEK293T細胞后，轉染細胞均有觀測到綠色熒光信號（圖6），說明3種外泌體都可以將目的蛋白帶入受體細胞，外泌體可以很好地起到載藥功能。其中裝載MFG-E8-EGFP外泌體轉染后的細胞的熒光強度最高，另外兩組細胞的熒光強度較弱，與此前檢測外泌體中EGFP含量結果一致。

圖6 熒光顯微鏡觀察外泌體轉染效果Fig.6 Fluorescence images showing the effect of exosomes transfection

3 討論

MFG-E8作為乳脂球膜上一種重要的親脂性糖蛋白，能夠通過增強凋亡細胞的吞噬調節(jié)炎癥和自身免疫，缺乏MFG-E8的小鼠會引起自身免疫疾病的出現(xiàn)［17-19］。人源MFG-E8由3個結構域組成，其中的EGF-L結構域含有的RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列能夠與整合素 αvβ3/αvβ5靶向結合介導細胞間的黏附［20-22］，因此，MFG-E8具有一定的靶向潛能。MFG-E8羧基端的盤狀結構域C1C2則能通過磷脂酰絲氨酸（PS）與細胞建立聯(lián)系。另外，MFG-E8被發(fā)現(xiàn)存在于細胞外囊泡中，已有研究報導，通過MFG-E8的C1C2結構域與外源蛋白融合表達，從而實現(xiàn)外泌體對外源蛋白的裝載［23］。

雖然C1C2已被用來作為導向外泌體的載體蛋白，但MFG-E8各結構域對外泌體包載其融合表達目的蛋白效率是否有影響還有待研究，因此本研究構建了連接有信號肽的MFG-E8全長和不同截短體與EGFP融合表達的重組質粒，在真核細胞里表達，檢測目的蛋白在細胞及其分泌的外泌體上的表達情況和所在位置。

研究發(fā)現(xiàn)，MFG-E8及其各組分均存在細胞中，其中EGF-L的表達量最高，C2的表達量最低，而上清中僅檢測到EGF-L、C1和EC1的存在。這說明具有C1C2，尤其是C2的存在，對蛋白在膜上的黏附作用具有重要影響。同時，激光共聚焦顯微鏡觀察到MFG-E8、C1C2和EC1定位在細胞膜上，而EGF-L的熒光分散在細胞質內。這與之前有關C1、C2結構域的功能的研究相一致，有文獻報道C2結構域內的莖環(huán)結構可能與膜連接［24］，而且單獨的C2結構域與全長的MFG-E8對于磷脂酰絲氨酸有相近的親和力［25］，而C1結構域能夠加強C2結構域與磷脂酰絲氨酸的連接作用［26-27］。

而外泌體中只有MFG-E8、C1C2和EC1三種蛋白被檢測到，其表達量為MFG-E8＞EC1＞C1C2，這說明MFG-E8各結構域作為載體將目的蛋白帶入外泌體必須有C1或者C2的存在，因為C1、C2結構域是與膜連接的部分，這與文獻中的報導相符［28］，而EGF-L結構域的存在可以促進融合蛋白表達量的增加，C1C2或C2連接的蛋白融合表達量都很低，從而也會影響到其攜帶入外泌體的量。我們的實驗還發(fā)現(xiàn)MFG-E8、C1C2和EC1所攜帶的蛋白是位于外泌體膜外的，因而可以利用其作為載體蛋白，攜帶需與細胞膜上受體結合的蛋白質，或者攜帶抗原蛋白，打造有潛力的蛋白疫苗。

4 結論

本研究通過構建MFG-E8及其不同的截短體，對MFG-E8各結構域將蛋白載入外泌體的作用進行探究。MFG-E8在細胞中表達后能黏附在細胞膜上，C1C2結構域在此過程中發(fā)揮錨定細胞膜作用，可將目的蛋白帶到外泌體上，而EGF-L結構域可提高蛋白表達，進而影響外泌體中目的蛋白的含量。