阿爾茨海默病患者血液中外泌體miR-223及NLRP3表達(dá)水平及臨床意義

師俊亮　郝豫萍　夏源　戴恩云

［摘要］ 目的 探討血清中外泌體miR-223及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）表達(dá)水平與阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）發(fā)生及進(jìn)展的關(guān)系。方法 選取2018年3月—2019年12月于我院老年醫(yī)學(xué)科就診的老年AD患者65例作為研究組，分為輕度認(rèn)知功能障礙（MCI）亞組（41例）和癡呆（DAT）亞組（24例）；另外納入同時(shí)期神經(jīng)功能正常的老年人60例作為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)受檢者血清中外泌體miR-223及NLRP3表達(dá)水平。采用Pearson及Spearman檢驗(yàn)分析受檢者血清中外泌體miR-223及NLRP3與簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）評(píng)分的關(guān)系。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計(jì)算血清中外泌體miR-223及NLRP3用于AD患者M(jìn)CI診斷或者DAT鑒別診斷的曲線下面積（AUC）。結(jié)果 與對(duì)照組相比較，研究組受試者血清中外泌體miR-223的表達(dá)水平顯著降低，NLRP3表達(dá)水平顯著升高（t=6.623，Z=－9.451，P<0.05）；與MCI亞組相比，DAT亞組受試者血清中外泌體miR-223表達(dá)水平顯著降低，NLRP3表達(dá)水平顯著升高（t=3.190，Z=－5.288，P<0.05）。研究組受試者血清中外泌體miR-223表達(dá)水平與NLRP3表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=－0.859，P<0.001），與MMSE評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.790，P<0.001），研究組受試者血清中NLRP3表達(dá)水平與MMSE評(píng)分則呈負(fù)相關(guān)（r=－0.776，P<0.001）。血清中外泌體miR-223聯(lián)合NLRP3診斷AD患者M(jìn)CI的AUC為0.91（95%CI=0.86～0.97），靈敏度為89.0%，特異度為76.5%；其鑒別診斷DAT的AUC為0.81（95%CI=0.75～0.88），靈敏度為70.0%，特異度為85.0%。結(jié)論 miR-223/NLRP3信號(hào)通路可能參與AD的發(fā)生和發(fā)展，血清中外泌體miR-223和NLRP3的檢測(cè)對(duì)AD患者M(jìn)CI和DAT的診斷或鑒別診斷具有一定價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。

［關(guān)鍵詞］ 阿爾茨海默?。徽J(rèn)知功能障礙；微RNAs；NLR家族，熱蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白3；外泌體；曲線下面積；診斷；老年人

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R749.16

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

EXPRESSION OF BLOOD EXOSOMAL miR-223 AND NUCLEOTIDE-BINDING OLIGOMERIZATION DOMAIN-LIKE RECEPTOR PROTEIN 3 IN PATIENTS WITH ALZHEIMERS DISEASE AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCE＼ SHI Junliang， HAO Yuping， XIA Yuan， DAI Enyun （Department of Geriatrics， Henan Workers Hospital， Zhengzhou 450003， China）

［ABSTRACT］ Objective To investigate the expression levels of serum exosomal miR-223 and nucleotide-binding oligome-rization domain-like receptor protein 3 （NLRP3） in patients with Alzheimers disease （AD） and their association with the development and progression of AD. Methods A total of 65 elderly patients with AD who attended Department of Geriatrics in our hospital from March 2018 to December 2019 were enrolled as study group and were divided into mild cognitive impairment （MCI） subgroup with 41 patients and dementia of Alzheimer type （DAT） subgroup with 24 patients， and 60 elderly individuals with normal neurological function were enrolled as control group. Quantitative real-time PCR and ELISA were used to measure the expression levels of serum exosomal miR-223 and NLRP3. The Pearson and Spearman tests were used to analyze the correlation of serum exosomal miR-223 and NLRP3 with Mini-Mental State Examination （MMSE） score. The receiver operating characteristic （ROC） curve was plotted to calculate the area under the ROC curve （AUC） of serum exosomal miR-223 and NLRP3 in the diagnosis of MCI in AD patients or the differential diagnosis of DAT. Results Compared with the control group， the study group had a significantly lower expression level of serum exosomal miR-223 and a significantly higher expression level of NLRP3 （t=6.623，Z=-9.451，P<0.05）， and compared with the MCI subgroup， the DAT subgroup had a significantly lower expression level of serum exosomal miR-223 and a significantly higher expression level of NLRP3 （t=3.190，Z=-5.288，P<0.05）. In the study group， the expression level of serum exosomal miR-223 was negatively correlated with that of NLRP3 （r=-0.859，P<0.001） and was positively correlated with MMSE score （r=0.790，P<0.001）， while the expression level of serum NLRP3 was negatively correlated with MMSE score （r=-0.776，P<0.001）. Serum exosomal miR-223 combined with NLRP3 had an AUC of 0.91 （95%CI=0.86-0.97）， a sensitivity of 89.0%， and a specificity of 76.5% in the diagnosis of MCI in AD patients， while it had an AUC of 0.81 （95%CI=0.75-0.88）， a sensitivity of 70.0%， and a specifi-city of 85.0% in the differential diagnosis of DAT. ConclusionThe miR-223/NLRP3 signaling pathway might be involved in the development and progression of AD， and measurement of serum exosomal miR-223 and NLRP3 has a certain value in the diagnosis of MCI or the differential diagnosis of DAT in AD patients， which requires further studies in the future.

［KEY WORDS］ Alzheimer disease; Cognitive dysfunction; MicroRNAs; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein; Exosomes; Area under curve; Diagnosis; Aged

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）屬于一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病，以認(rèn)知功能障礙和進(jìn)行性癡呆為主要特征^[1]。美國(guó)國(guó)立老化研究所和阿爾茨海默病協(xié)會(huì)（NIA-AA）提出的最新AD研究框架指出，AD是包括輕度認(rèn)知功能障礙（MCI）和癡呆（DAT）在內(nèi)的連續(xù)病程，在AD核心臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)綜合考慮AD病理生理變化證據(jù)，并強(qiáng)調(diào)生物學(xué)標(biāo)志物可以用于AD的早期診斷^[2]。NOD樣受體蛋白（NLRs）屬于細(xì)胞質(zhì)模式識(shí)別受體，可以被部分病原微生物或者受損細(xì)胞釋放的非微生物危險(xiǎn)信號(hào)激活，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥小體依賴(lài)性天然免疫反應(yīng)^[3]。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，降低AD小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）的表達(dá)，可以明顯改善AD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶的能力^[4]，由此可以推測(cè)miR-223/NLRP3信號(hào)通路可能參與AD的發(fā)生機(jī)制。本研究以我院老年醫(yī)學(xué)科就診的65例老年AD患者作為研究的對(duì)象，旨在探討miR-223/NLRP3信號(hào)通路在AD的發(fā)生及發(fā)展中的作用，為血清中外泌體miR-223及NLRP3作為AD診斷和進(jìn)展判斷的血清學(xué)指標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年3月—2019年12月于我院老年醫(yī)學(xué)科就診的老年AD患者作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①初診者；②癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查、簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）評(píng)分^[2]、腦部CT及MRI等檢查結(jié)果符合NIA-AA提出的AD核心臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)^[5]；③MMSE評(píng)分≤26分，日常生活能力保留者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他疾病者，包括患有心肌梗死、惡性腫瘤、帕金森病、顱腦外傷、多發(fā)性硬化癥等可能引起miR-223表達(dá)異常者；②存在其他類(lèi)型癡呆（如血管性癡呆、額顳葉癡呆）者。依據(jù)MMSE量表，按認(rèn)知功能障礙進(jìn)展程度將研究組受試者分為MCI亞組和DAT亞組。另外選擇60例神經(jīng)功能正常的老年人作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)期自愿接受血樣采集和MMSE問(wèn)卷調(diào)查的同一社區(qū)人群；②年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)疾病、受教育程度等基本資料與研究組受試者匹配者；③一般認(rèn)知功能及記憶正常，無(wú)癡呆臨床癥狀及其他精神系統(tǒng)疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)同研究組。

研究組受試者共65例，其中MCI亞組41例，DAT亞組24例。研究組與對(duì)照組受試者的年齡、性別、BMI、基礎(chǔ)疾病、受教育程度等基本資料比較無(wú)顯著差異（P＞0.05），兩組受試者具有可比性。研究組受試者的MMSE評(píng)分和日常生活能力量表（ADL）評(píng)分顯著低于對(duì)照組（t=13.981～18.371，P<0.001）。見(jiàn)表1。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 每位受試者禁食12 h后采集外周靜脈血，室溫下3 000 r/min離心10 min，后4 ℃下12 000 r/min離心5 min。將采集的血清樣本保存在－80 ℃冰箱備用。

1.2.2 血清中外泌體提取及鑒定 取出凍存?zhèn)溆脴颖?，于?5±3）℃室溫下放置20 min復(fù)溶，使用外泌體分離試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）按照說(shuō)明書(shū)步驟分離血清中外泌體。用HT7700透射電子顯微鏡（日本日立公司）觀察外泌體形態(tài)及顆粒大小，用納米粒徑追蹤技術(shù)分析粒徑分布。采用蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定外泌體特征蛋白熱休克蛋白70（Hsp70）、溶酶體相關(guān)膜蛋白-3（CD63）以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特征蛋白Calnexin的表達(dá)水平。

1.2.3 血清中外泌體miR-223表達(dá)水平測(cè)定 利用miRNA分離試劑盒提取上述外泌體中總RNA，選取microRNA First Strand cDNA合成試劑盒（大連寶生生物公司）在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。以cDNA為模板，U6 mRNA為內(nèi)源對(duì)照，采用MicroRNAs Quantization PCR Kit（上海Sangon公司）和LightCycler 480實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（德國(guó)Roche applied science公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)進(jìn)行條件為：95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，59.5 ℃ 30 s，36個(gè)循環(huán)。miR-223正向引物為5′-CCACGCTCCGTGT-ATTTGAC-3′，反向引物為5′-CCGCACTTGGGGTATTTGAC-3′，使用公式2^-ΔΔCT計(jì)算miR-223相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果選取3次試驗(yàn)的平均值。

1.2.4 血清中NLRP3表達(dá)水平測(cè)定 取出凍存?zhèn)溆脴颖?，于?5±3）℃室溫下放置20 min復(fù)溶，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（加拿大MyBioSource公司），按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清中NLRP3水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

利用SPSS 17.0和Graphpad prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用x?±s或M（P₂₅，P₇₅）表示，組間相關(guān)指標(biāo)的比較采用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)；分類(lèi)變量以例（率）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Pearson檢驗(yàn)或Spearman檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC）、診斷靈敏度和特異度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中外泌體提取及鑒定結(jié)果

透射電子顯微鏡觀察顯示，分離出形狀、大小不一的囊泡，具有典型的胞外體形態(tài)和雙層膜結(jié)構(gòu)（圖1A）；粒徑平均分布范圍為50.00～200.00 nm，平均粒徑為（158.52±18.71）nm，稀釋后調(diào)整粒子濃度為2.86×10⁹個(gè)/L（圖1B）。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特征蛋白Calnexin蛋白表達(dá)陰性，而外泌體特征蛋白Hsp70以及溶酶體相關(guān)膜蛋白CD63則呈特異性高表達(dá)（圖1C）。

2.2 兩組受試者血清中外泌體miR-223及NLRP3表達(dá)水平比較

研究組和對(duì)照組受試者血清中外泌體miR-223表達(dá)水平分別為0.67±0.34、1.00±0.19，NLRP3水平分別為12.31（7.82，19.44）、4.45（2.45，9.58），兩組間上述兩指標(biāo)比較差異具有顯著意義（t=6.623，Z=－9.451，P<0.05）。在研究組中，DAT亞組和MCI亞組受試者血清中外泌體miR-223表達(dá)水平分別為0.52±0.26、0.76±0.31，NLRP3水平分別為20.78（14.45，28.52）、8.87（6.11，12.63），兩亞組當(dāng)中上述兩指標(biāo)相比較差異具有顯著意義（t=3.190，Z=－5.288，P<0.05）。

2.3 研究組受試者血清中外泌體miR-223、NLRP3表達(dá)水平及MMSE評(píng)分間的相關(guān)性

Pearson及Spearman檢驗(yàn)示，研究組受試者血清中外泌體miR-223與NLRP3表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=－0.859，P<0.001），與MMSE評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.790，P<0.001）；血清中NLRP3表達(dá)水平與MMSE評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=－0.776，P<0.001）。

2.4 血清中外泌體miR-223、NLRP3的測(cè)定對(duì)AD患者M(jìn)CI的診斷價(jià)值

將對(duì)照組受試者作為對(duì)照，繪制ROC曲線。血清中外泌體miR-223以及NLRP3診斷AD患者M(jìn)CI的AUC分別為0.85（95%CI=0.76～0.91）和0.84（95%CI=0.75～0.89），最佳截?cái)嘀禐?.74和8.15。該最佳截?cái)嘀迪拢逯型饷隗wmiR-223和NLRP3診斷AD患者M(jìn)CI的靈敏度分別為89.4%和81.7%，特異度分別為76.1%以及70.9%。另外，血清中外泌體miR-223聯(lián)合NLRP3診斷AD患者M(jìn)CI的AUC為0.91（95%CI=0.86～0.97），靈敏度和特異度分別為89.0%和76.5%。見(jiàn)圖2。

2.5 血清中外泌體miR-223、NLRP3水平測(cè)定對(duì)DAT的鑒別診斷價(jià)值

將MCI亞組受試者作為對(duì)照，繪制ROC曲線。血清中外泌體miR-223和NLRP3鑒別診斷DAT的AUC分別為0.70（95%CI=50.64～0.78）和0.79（95%CI=0.71～0.85），最佳截?cái)嘀捣謩e為0.61和15.42。該最佳截?cái)嘀迪?，血清中外泌體miR-223和NLRP3鑒別診斷DAT的靈敏度分別為85.0%和72.8%，特異度分別為76.1%和57.5%。血清中外泌體miR-223聯(lián)合NLRP3鑒別診斷DAT的AUC為0.81（95%CI=0.75～0.88），靈敏度和特異度分別為70.0%和85.0%。見(jiàn)圖3。

3 討論

AD屬于一種不可逆轉(zhuǎn)的認(rèn)知功能進(jìn)行性障礙綜合征，受人口老齡化影響，近年來(lái)我國(guó)AD發(fā)病率明顯上升^[6]。大量研究表明，異常miRNAs在多種人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，研究組受試者的血清中外泌體miR-223表達(dá)水平普遍降低，同時(shí)伴有血清中NLRP3水平升高；且與MCI亞組相比，DAT亞組受試者也存在上述變化。上述結(jié)果說(shuō)明miR-223/NLRP3信號(hào)通路可能參與了AD的發(fā)生以及進(jìn)展過(guò)程。

miRNAs是神經(jīng)系統(tǒng)當(dāng)中大量存在的一種非編碼小分子RNA，是神經(jīng)元細(xì)胞的重要功能調(diào)節(jié)因子^[7-8]。眾多研究在AD大腦組織和腦脊液中觀察到了異常miRNAs表達(dá)，這表明不同miRNAs參與調(diào)節(jié)神經(jīng)退行性變相關(guān)基因表達(dá)，可能是AD的發(fā)病機(jī)制之一^[9]。miRNAs不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)過(guò)程，也存在于外周血外泌體中，在內(nèi)分泌模式下調(diào)節(jié)其他細(xì)胞中的靶mRNA^[10]。例如WEI等^[11]研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體miR-223通過(guò)磷酸酶張力蛋白同源物-磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路保護(hù)神經(jīng)元免于凋亡，并為AD治療提供了一種潛在的靶點(diǎn)。在本研究中，研究組受試者血清中外泌體中miR-223表達(dá)水平較對(duì)照組下調(diào)，且DAT亞組受試者血清中外泌體miR-223表達(dá)水平低于MCI亞組，這可能是因?yàn)閙iR-223下調(diào)可能會(huì)干擾與神經(jīng)元細(xì)胞周期相關(guān)的信號(hào)通路，從而導(dǎo)致與AD進(jìn)展相關(guān)的神經(jīng)元凋亡。另外，本研究的ROC曲線提示血清中外泌體miR-223用于AD患者M(jìn)CI的早期診斷以及DAT的鑒別診斷，其靈敏度和特異度均較高。這些結(jié)果均證實(shí)了血清中外泌體miR-223作為AD診斷生物標(biāo)志物的有效性。此外，血清樣本相較于腦脊液樣本較為簡(jiǎn)單易得，隨著二代基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，血清miRNAs檢測(cè)也愈發(fā)方便準(zhǔn)確。

神經(jīng)退行性疾病與遺傳易感性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常、線粒體功能障礙以及氧化應(yīng)激失衡等密切相關(guān)，β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積并激活小膠質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)腦神經(jīng)炎癥是AD主要的病理基礎(chǔ)^[12]。本研究結(jié)果顯示，研究組血清中NLRP3表達(dá)水平普遍升高，且DAT亞組血清中NLRP3水平高于MCI亞組，這說(shuō)明NLRP3是參與AD發(fā)生和進(jìn)展的重要分子，對(duì)AD的識(shí)別和治療具有一定指導(dǎo)意義。神經(jīng)炎癥是AD進(jìn)行性神經(jīng)病變的重要基礎(chǔ)，腦組織中NLRP3在認(rèn)知功能障礙早期即被激活，現(xiàn)有研究成果推測(cè)NLRP3炎癥小體可能在AD的發(fā)生發(fā)展中起作用，這可能與其在小膠質(zhì)細(xì)胞中被Aβ激活會(huì)引發(fā)神經(jīng)炎癥有關(guān)^[13-15]。Aβ聚集蛋白的積累以及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活是AD的典型病理特征，后者可促進(jìn)炎癥分子的釋放，上述過(guò)程都會(huì)損害神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致偶發(fā)性記憶缺陷和認(rèn)知功能障礙^[16]。NLRP3炎癥小體被認(rèn)為是AD關(guān)鍵及常見(jiàn)的先天免疫應(yīng)答物，NLRP3炎癥小體的激活是在小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬原纖維Aβ后開(kāi)始的，該過(guò)程導(dǎo)致溶酶體損傷，組織蛋白酶B釋放、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶1激活和一氧化氮的釋放，進(jìn)而促進(jìn)AD病理的發(fā)展^[17]。HENEKA等^[18]發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體被Aβ激活是白細(xì)胞介素-1β成熟及隨后炎性事件的基礎(chǔ)，并且推測(cè)抑制NLRP3炎癥小體有望成為AD治療的新型手段之一。

既往研究表明，NLRP3為miR-223的重要靶點(diǎn)，但miR-223并不會(huì)立即觸發(fā)負(fù)反饋機(jī)制，而是通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子，到達(dá)啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng)所需的“炎癥水平”，從而導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的激活^[19]。本研究中，研究組受試者的血清中外泌體miR-223與NLRP3表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，這也進(jìn)一步提示了miR-223/NLRP3信號(hào)通路在AD中的作用機(jī)制。此外，ROC曲線評(píng)估外泌體miR-233聯(lián)合NLRP3診斷AD源性MCI的AUC為0.91，靈敏度及特異度分別為89.0%和76.5%，二者聯(lián)合鑒別診斷AD患者DAT的AUC為0.81，靈敏度以及特異度分別為70.0%和85.0%，上述結(jié)果均表明miR-233聯(lián)合NLRP3對(duì)AD具有良好的診斷效能，且對(duì)評(píng)估該病進(jìn)展具有一定意義。

綜上所述，miR-223/NLRP3信號(hào)通路可能參與AD的發(fā)生和發(fā)展，檢測(cè)血清中外泌體miR-223和NLRP3表達(dá)水平對(duì)于AD患者的早期MCI以及DAT進(jìn)展具有一定的判斷價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。同時(shí)本文仍存在一定的局限性，如miR-223與NLRP3之間的靶向調(diào)控關(guān)系，以及兩者在AD發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，仍需要在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)酥链髽颖九R床研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)河南省職工醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)L2019015）。所有試驗(yàn)過(guò)程均遵照《涉及人的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

作者聲明：師俊亮、郝豫萍參與了研究設(shè)計(jì)；夏源、師俊亮、戴恩云參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

［參考文獻(xiàn)］

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（本文編輯 范睿心 厲建強(qiáng)）