• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    TRV介導(dǎo)的小報(bào)春基因沉默技術(shù)體系的建立

    2022-06-09 08:48:12付偲僮司未佳劉穎程堂仁王佳張啟翔潘會(huì)堂
    生物技術(shù)通報(bào) 2022年4期
    關(guān)鍵詞:報(bào)春白化菌液

    付偲僮 司未佳 劉穎 程堂仁 王佳 張啟翔 潘會(huì)堂

    (北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 國家花卉工程技術(shù)研究中心 花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

    基因功能驗(yàn)證常用的方法有轉(zhuǎn)基因、RNA干擾、基因敲除和酵母雜交等,但大部分基因驗(yàn)證方法都依賴于穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建步驟繁瑣、耗時(shí),且依賴傳統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化體系的基因功能驗(yàn)證不適用于無穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的物種。因此在無遺傳轉(zhuǎn)化體系的物種中,基因沉默(gene silencing)驗(yàn)證則需要另辟蹊徑。

    基因沉默是真核生物細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的一種重要手段,是植物自身防御病毒入侵的一種自然機(jī)制。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是利用病毒載體攜帶植物目的基因片段,通過各種方式侵染植物,重組病毒在植物中復(fù)制產(chǎn)生雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA),在植物自身防衛(wèi)反應(yīng)轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)的機(jī)制作用下,dsRNA進(jìn)一步產(chǎn)生siRNA(small interference RNA,siRNA),該產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)與其具有同源性的植物內(nèi)源目的基因mRNA的降解,根據(jù)表型變異來進(jìn)行基因功能分析,實(shí)現(xiàn)植物基因功能的快速鑒定[1]。相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù),VIGS技術(shù)具有沉默效率高、周期短、操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn),并且不需要事先知道并克隆基因全長,也無需建立遺傳轉(zhuǎn)化體系,只需要一段300-500 bp的基因片段就能快速獲得表型,進(jìn)行基因功能的驗(yàn)證[2]。目前,已經(jīng)成為植物基因功能研究領(lǐng)域最具有吸引力的技術(shù)之一。煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)具有基因組較小,可以侵染植物生長點(diǎn),不產(chǎn)生典型病毒性狀,便于改造等優(yōu)點(diǎn),是目前在植物中應(yīng)用最廣泛、效果最好的 VIGS 病毒載體[3],對包括番茄[4]、煙草[5]、辣椒[6]等在內(nèi)的植物有良好的侵染效果。

    花柱異型現(xiàn)象能夠促進(jìn)異花授粉,是植物界經(jīng)典的適應(yīng)性范例,是被子植物多樣性形成的核心因素之一[7]。小報(bào)春作為典型的花柱二型植物,是研究花柱二型形成機(jī)制的理想材料。但是報(bào)春花屬植物的體外再生非常困難,關(guān)于報(bào)春花屬植物的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究較少。前人以歐報(bào)春葉片為外植體得到了愈傷組織[8],Hayta等[9]報(bào)道了兩種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的歐報(bào)春遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),一種是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透幼苗,能夠?qū)崿F(xiàn)在歐報(bào)春中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化;一種是根癌農(nóng)桿菌感染的花梗外植體,平均轉(zhuǎn)化率為4.6%,具有穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因整合和轉(zhuǎn)化到下一代的能力,但這一方法轉(zhuǎn)化效率低,難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的基因功能分析。因此,建立小報(bào)春VIGS基因沉默體系成為基因功能驗(yàn)證亟待解決的關(guān)鍵問題。

    PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的限制酶,參與植物類胡蘿卜素的合成累積。PDS基因沉默會(huì)影響植物番茄紅色的積累,番茄植株的綠色部分(葉子和綠色果實(shí))因?yàn)槿狈υ撁付鴮?dǎo)致葉綠體對光極度敏感,出現(xiàn)典型光漂白表型,因此變成白色[3]。由于植物不同部位均出現(xiàn)容易觀察的沉默表型,PDS在VIGS體系建立過程中得到廣泛應(yīng)用。

    近年來,VIGS技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于番茄[4]、蘋果[10]、玉米[11]、棉花[12]、葡萄[13]等作物中,但尚沒有在小報(bào)春中建立VIGS體系的報(bào)道。

    本研究以實(shí)驗(yàn)室培育的小報(bào)春新品種‘紅星’為試驗(yàn)材料,利用小報(bào)春的PDS(八氫番茄紅素脫氫酶)基因作為標(biāo)記基因,構(gòu)建TRV2-PfPDS重組載體,以期構(gòu)建小報(bào)春VIGS體系,為小報(bào)春的基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料 將小報(bào)春種子播種在穴盤中,置于北京林大林業(yè)科技有限公司的人工氣候室中,培養(yǎng)條件為光照時(shí)間16 h,溫度22℃,黑暗時(shí)間8 h,溫度18℃,相對濕度60%。約2個(gè)月后將小報(bào)春的種苗移植到直徑10 cm的花盆里,一周后有新葉長出時(shí)用于侵染。另外,在濕潤的濾紙上播種小報(bào)春種子,分別培養(yǎng)至白色胚軸剛剛伸出和長出子葉2種發(fā)育階段,用于真空侵染。

    1.1.2 病毒載體和菌株 TRV病毒載體pTRV1和pTRV2由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)傅達(dá)奇教授惠贈(zèng),載體圖譜如圖1所示,所選用大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)為DH5α(CD201-02,全式金,北京),農(nóng)桿菌感受態(tài)為GV3101(BC304-01,博邁德,北京)。

    圖1 TRV1和TRV2載體圖譜Fig.1 Vector map of TRV1 and TRV2

    1.2 方法

    1.2.1 報(bào)告基因擴(kuò)增 從小報(bào)春轉(zhuǎn)錄組中篩選出小報(bào)春PDS基因(PfPDS)序列,在其ORF框內(nèi)選取302 bp長度的片段。參考In-fusion引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物(上游引物為5′-TTAAGGTTACCGAATTCAT ACCGGCTTGTGAC-3′,下游引物為 5′-GCTCGGTACC GGATCCGCAAATCGATGCACT-3′),由上海生工生物有限公司合成。反應(yīng)體系為cDNA 2 μL(80 ng/μL)、上游引物 2 μL(100 μmol/L)、下游引物 2 μL(100 μmol/L)、2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL 和 ddH2O 19 μL。離心混勻后按以下反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 5 min ;94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,將正確的條帶切下后進(jìn)行回收。

    1.2.2 重組載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對TRV2質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為TRV2 質(zhì) 粒 1μg、BamH I 0.7 μL(10 U)、EcoR I 0.7 μL(10 U)、10×K Buffer 5 μL,ddH2O 補(bǔ) 至 50 μL。37℃酶切3-4 h后膠回收。將1.2.1得到的基因片段與線性TRV2載體通過In-fusion連接法,50℃15 min,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,篩選陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定陽性重組子。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將含有目的條帶的菌液送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

    1.2.3 菌液制備及侵染 取5 μL測序正確的重組質(zhì)粒TRV2-PfPDS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101,28℃培養(yǎng)2 d,挑取外形圓潤的單個(gè)菌斑于1 mL含有50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL慶大霉素、25 μg/mL利福平的液體LB培養(yǎng)基中28℃搖菌(150 r/min)培養(yǎng)。

    以菌液∶誘導(dǎo)LB=1∶20的比例,將搖好的菌液轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)LB中(其中卡那霉素工作濃度為50 μg/mL,慶大霉素工作濃度為50 μg/mL,利福平工作濃度為25 μg/mL,MES工作濃度為10 mmol/L,AS工作濃度為20 μmol/L),在28℃下震蕩培養(yǎng)12-16 h(150 r/min)。

    將培養(yǎng)好的誘導(dǎo)LB菌液以5 000 r/min離心5 min后,棄上清,用侵染液重懸菌體。將菌液調(diào)至所需濃度(OD600)后室溫下靜置3-4 h。最后將含有TRV1的菌液與含有TRV2-PfPDS的菌液按體積比1∶1混合,待用。

    1.2.4 沉默體系的構(gòu)建 侵染方式:在同樣的OD600和侵染液配方的條件下,研究葉背注射、葉柄注射、真空滲透侵染剛露白種子或長出子葉的種苗4種方式的侵染效率。具體方法如下:將OD600調(diào)至1.0,侵染液為無菌水中含有10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2和 200 μmol/L AS。(1)葉背注射法 :用 5 mL一次性注射器吸取侵染液并拔掉針頭,將注射器對準(zhǔn)葉片的背面,避開葉脈,用食指隔著葉片抵住注射口,將侵染液注入葉片中,以觀察到葉片呈現(xiàn)浸漬狀為宜。對每片葉進(jìn)行注射,確保侵染液進(jìn)入植株內(nèi)部。(2)葉柄注射法:用5 mL一次性注射器吸取侵染液后,用針頭輕輕劃傷葉柄(不能將葉柄折斷),在傷口處注射少量侵染液。為保證侵染液進(jìn)入植株內(nèi)部,對每個(gè)葉柄進(jìn)行注射。2種侵染方式各處理10株小報(bào)春。(3)真空滲透侵染剛露白種子或長出子葉的種苗:將分別培養(yǎng)至種子剛露白和長出子葉的小報(bào)春用于真空滲透侵染,設(shè)置3種壓強(qiáng)(-25、-50和-75 kpa)及3種侵染時(shí)間(30 s、2 min和5 min),每組處理20粒種子。葉背注射、葉柄注射、真空滲透4種侵染方式均設(shè)置相應(yīng)的空載組和對照組。所有植株在侵染后遮光處理24 h,之后在人工氣候室(光照時(shí)間16 h,溫度22℃,黑暗時(shí)間8 h,溫度18℃,濕度60%)中培養(yǎng)。

    菌液濃度與侵染液配方:設(shè)置4種侵染液配方及菌液OD600(表1),合計(jì)16組處理,每組處理設(shè)置對應(yīng)的空載組和對照組,采用葉背注射法侵染5株小報(bào)春,所得數(shù)據(jù)使用SPSS和Excel軟件進(jìn)行分析。

    表1 侵染液菌液濃度及配方Table 1 OD600 value and combinations of infiltration liquid

    提取出現(xiàn)白化表型植株不同部位的RNA,同時(shí)提取空載組和對照組的RNA,分別反轉(zhuǎn)為用于載體檢測和表達(dá)量檢測的2種cDNA,用于載體檢測的cDNA使用TIANScript RT Kit(KR104,天根,北京)反轉(zhuǎn)錄試劑盒,用于表達(dá)量檢測的cDNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser(RR-047A,TaKaRa,日本)反轉(zhuǎn)錄試劑盒,具體操作見試劑盒說明書,引物詳細(xì)信息見表2。

    表2 病毒載體檢測及表達(dá)量檢測引物Table 2 Primers for viral vector detection and gene expression level detection

    2 結(jié)果

    2.1 小報(bào)春VIGS體系的最佳侵染方式

    比較葉背注射、葉柄注射、真空滲透種子和真空滲透具有兩片子葉的幼苗4種侵染方式的侵染效率,OD600均為1.0,侵染液均為無菌水中加入200 μmol/L AS+10 mmol/L MgCl2+10 mmol/L MES。侵染后第16天首次觀察到白化現(xiàn)象,白化現(xiàn)象均出現(xiàn)在新生的葉片上,侵染40 d后不再有新的植株出現(xiàn)白化現(xiàn)象(圖2),白化植株表型持續(xù)變化,一直到開花,白化現(xiàn)象在葉片、花葶、花梗、花萼等部位均能出現(xiàn)(圖3)。通過葉背注射法侵染小報(bào)春的效率達(dá)60%,而葉柄注射法的侵染效率為30%。真空滲透侵染法無論是侵染剛露白的種子還是帶兩片子葉的幼苗,白化現(xiàn)象均不如注射法侵染的植株表現(xiàn)明顯,僅在葉脈處出現(xiàn)白化現(xiàn)象(圖4),利用這兩種方法首次觀察到白化現(xiàn)象是在侵染37 d后。兩種方法中,帶兩片子葉的幼苗要比剛伸出胚軸的種子侵染效率高。對于剛剛伸出胚軸的種子,壓強(qiáng)為-25 kpa時(shí)侵染效率最高,且侵染時(shí)間越長效率越高,而對于兩片子葉的幼苗,壓強(qiáng)為-75 kpa時(shí)侵染效率最高,侵染效率與侵染時(shí)間長短無關(guān)(表3)。綜上所述,小報(bào)春最佳的侵染方式為葉背注射法。

    表3 真空滲透法侵染小報(bào)春萌發(fā)種子和帶子葉幼苗的效果Table 3 Infection efficiency on P.forbesii when seeds with hypocotyl and cotyledons infected by vacuum infiltration

    圖3 PfPDS沉默后小報(bào)春的白化現(xiàn)象Fig.3 Whole plant albino after PfPDS gene silenced in P.forbessii

    圖4 真空滲透法侵染小報(bào)春后PDS基因的沉默效果Fig.4 Silencing effect of PDS gene in P.forbesii infected by vacuum infiltration method

    2.2 小報(bào)春VIGS體系的最佳菌液濃度與侵染液配方

    以葉背注射法侵染葉片,在侵染16 d后開始出現(xiàn)白化現(xiàn)象,在侵染20 d后不再出現(xiàn)新的白化植株,最高侵染效率為40%,空載組和對照組無明顯變化(圖2)。從16組處理結(jié)果來看(表4),侵染效率沒有表現(xiàn)出與OD600或侵染液配方具有明顯的相關(guān)性。結(jié)合2.1的結(jié)果,綜合考慮節(jié)約藥品與操作的方便性,選擇OD600為1.0,侵染液配方為無菌水中加入200 μmol/L AS+10 mmol/L MgCl2+10 mmol/L MES 作為最佳的菌液濃度和侵染液配方。

    表4 不同OD600與侵染液配方侵染小報(bào)春的效率Table 4 Infection efficiency of different OD600 values and different formula of infiltration liquid on P.forbesii

    圖2 注射法侵染小報(bào)春后PDS基因沉默效果Fig.2 Silencing effect of PDS gene infection in P.forbesii

    2.3 病毒載體檢測與表達(dá)量檢測

    利用TRV病毒載體上的引物(表2)進(jìn)行PCR,在出現(xiàn)白化現(xiàn)象的植株和空載組中均檢測到了TRV1和TRV2病毒載體,對照組中沒有檢測到2種病毒載體(圖5),說明不同的侵染方式都能使攜帶有病毒載體的菌液進(jìn)入植株內(nèi)部,并且病毒載體能夠轉(zhuǎn)移到新生器官中,出現(xiàn)白化現(xiàn)象的植株P(guān)fPDS表達(dá)量顯著低于空載組和對照組。而真空滲透法侵染的植株P(guān)fPDS下調(diào)不明顯,沉默效率低,表型變化小(圖6)。比較基因沉默后小報(bào)春不同部位PDS基因表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)葉片、花梗、萼片中PfPDS TRV2植株P(guān)DS基因表達(dá)量均顯著低于空載組和對照組(圖7)。

    圖5 基因沉默后小報(bào)春植株病毒載體檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of virus vector in P.forbessii after gene silencing

    圖6 使用不同方法基因沉默后小報(bào)春PDS基因的表達(dá)量檢測Fig.6 Detection results of PDS gene expression after gene silencing by different methods

    圖7 基因沉默后小報(bào)春植株不同部位PDS基因的表達(dá)量檢測Fig.7 Detection of PDS gene expression in different parts of P.forbessii after gene silencing

    3 討論

    小報(bào)春是報(bào)春花科報(bào)春花屬的典型花柱異型植物,本研究構(gòu)建的小報(bào)春VIGS體系能夠使白化植株表型持續(xù)變化,一直到開花,白化現(xiàn)象在葉片、花葶、花梗、花萼等部位均能出現(xiàn)。說明病毒載體能夠在植株內(nèi)部轉(zhuǎn)移并且在花部器官能夠表達(dá),該體系能夠用于研究花柱異型以及其它性狀如花香、耐熱等科學(xué)問題。

    確保帶有重組載體的菌液進(jìn)入植株體內(nèi),是VIGS技術(shù)成功與否的決定性因素。不同植物有各自最適的侵染方式,本研究所用的注射侵染法適用于肉質(zhì)、柔軟的葉片,如番茄的子葉、煙草的幼嫩真葉,該類葉片組織結(jié)構(gòu)松軟,注射器造成較小的傷口后即可利用壓力將侵染液快速的浸潤到整個(gè)葉片從而完成侵染;該方法不適合葉片比較薄而脆、葉脈較多的植物,如大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)和小麥(Triticum aestivum)等。這類植物葉片較窄、偏紙質(zhì),用真空滲透侵染法侵染種子具有較好效果。Zhang等[14]利用抽真空方式使帶有PDS基因的病毒載體進(jìn)入發(fā)芽的小麥和劃傷的玉米種子中,最終獲得全株白化的苗子。許多木本植物葉片與草本植物相比偏革質(zhì)或蠟質(zhì),較難侵染。利用幼嫩的扦插苗或組培苗則會(huì)更容易侵染,在月季(Rosa chinensis)和觀賞海棠(Malus spectabilis)的研究中有采用真空滲透侵染法侵染組培苗的報(bào)道[15-16]。針對具體物種構(gòu)建最適的體系是十分必要的。

    八氫番茄紅素去飽和酶(phytoene desaturase,PDS)是類胡蘿卜素合成途徑中的限制酶,參與植物類胡蘿卜素的合成累積。PDS基因沉默會(huì)影響植物番茄紅色的積累,番茄植株的綠色部分(葉子和綠色果實(shí))因?yàn)槿狈υ撁付鴮?dǎo)致葉綠體對光極度敏感,出現(xiàn)典型光漂白表型,綠色的植物葉片因此變成白色[8]。由于植物不同部位均出現(xiàn)容易觀察的沉默表型,PDS在VIGS體系建立過程中得到廣泛應(yīng)用,但其最大缺點(diǎn)是破壞了葉綠體而影響植物的正常生長發(fā)育。通常研究植物的葉片表型時(shí)建議使用PDS基因,如要研究果實(shí)表型,則以番茄紅素合成酶基因PSY1為佳,因?yàn)樵摶虺聊笾粫?huì)導(dǎo)致紅色的果實(shí)變成黃色,不會(huì)導(dǎo)致植物綠色部分發(fā)生顏色變化[17]。

    Fu等[18]利用多種侵染方式對番茄果實(shí)中控制果實(shí)成熟相關(guān)的基因進(jìn)行沉默后,發(fā)現(xiàn)同一個(gè)果實(shí)上會(huì)同時(shí)出現(xiàn)綠色未成熟和紅色成熟的兩種狀態(tài),但出現(xiàn)表型的部位僅在侵染的部位,不會(huì)出現(xiàn)在未侵染的部位。本研究中,幼苗期侵染葉片后,在整個(gè)植株的各個(gè)部位均有白化現(xiàn)象出現(xiàn),說明病毒會(huì)在植株內(nèi)轉(zhuǎn)移,這種轉(zhuǎn)移的能力可能與侵染的部位和時(shí)期有關(guān),病毒更傾向于向新生部位轉(zhuǎn)移。王旭等[19]將含有pTRV2-PDS菌液注射到刺萼龍葵葉背和幼根處,光漂白現(xiàn)象不僅在葉片上出現(xiàn),在部分花瓣上也出現(xiàn)了白化現(xiàn)象。

    VIGS是一種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù),由于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化基因沒有結(jié)合到染色體上,所以VIGS基因沉默是不穩(wěn)定的,侵染一段時(shí)間后沉默效果會(huì)有所衰減,表型也會(huì)恢復(fù)[20]。大部分研究所報(bào)道的VIGS表型持續(xù)時(shí)間較短,從3周到3個(gè)月不等[21-23]。小報(bào)春作為一種二年生植物,開花結(jié)實(shí)后會(huì)自然死亡。但在長日照條件下,延長小報(bào)春營養(yǎng)生長時(shí)間便可延長其整個(gè)生命周期。一些植株從幼苗期侵染至結(jié)實(shí)后衰老死亡整個(gè)過程中都持續(xù)表現(xiàn)白化現(xiàn)象,說明病毒載體能在小報(bào)春體內(nèi)存活較長的時(shí)間,可達(dá)12個(gè)月左右。由于沉默效果持續(xù)較長,大大提高了VIGS技術(shù)在小報(bào)春相關(guān)研究中的實(shí)用性,有望在小報(bào)春基因功能研究中發(fā)揮積極作用。

    4 結(jié)論

    構(gòu)建了PfPDS-TRV2載體,探索了最佳侵染部位、侵染液配方、菌液濃度和侵染方式,用含有200 μmol/L乙酰丁香酮(AS)、10 mmol/L MgCl2和10 mmol/L乙磺酸緩沖液(MES)的侵染液,將菌液OD600分別調(diào)至1.0,混合后通過葉背注射方式侵染小報(bào)春能夠有效地沉默基因,侵染效率達(dá)60%,沉默表型可持續(xù)12個(gè)月,并能在小報(bào)春植株的各部位(從葉片到萼片)均起到沉默作用。

    猜你喜歡
    報(bào)春白化菌液
    嶺上報(bào)春第一枝
    北極光(2022年1期)2022-02-23 12:15:32
    多糖微生物菌液對油菜吸收養(yǎng)分和土壤氮磷淋失的影響
    《蠟梅報(bào)春》
    軍工文化(2021年2期)2021-03-30 08:35:34
    報(bào)春圖
    白化黃喉擬水龜人工培育研究①
    Bonfire Night
    最嚴(yán)重白化
    鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)中通過吸光度值測定菌液濃度的方法研究
    金“雞”報(bào)春來
    航空模型(2017年2期)2017-05-22 18:23:39
    復(fù)合微生物菌液對黃瓜生長和抗病蟲性效應(yīng)研究
    上海蔬菜(2015年2期)2015-12-26 05:03:40
    99热6这里只有精品| 欧美+日韩+精品| 亚洲在久久综合| a级毛色黄片| 一区二区三区免费毛片| 欧美性感艳星| 天堂√8在线中文| 国产男人的电影天堂91| 国产精品免费一区二区三区在线| 日韩av不卡免费在线播放| 日本免费一区二区三区高清不卡| av.在线天堂| 大香蕉久久网| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲图色成人| 欧美3d第一页| 韩国av在线不卡| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人a∨麻豆精品| 黄色视频,在线免费观看| 国产成人福利小说| 免费av毛片视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 小说图片视频综合网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 免费无遮挡裸体视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 联通29元200g的流量卡| 国产精品永久免费网站| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产真实乱freesex| 中国美女看黄片| 一个人免费在线观看电影| 久久久久久大精品| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美性感艳星| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩强制内射视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 日韩中字成人| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产老妇女一区| 国产精品久久久久久久电影| 伊人久久精品亚洲午夜| 在线国产一区二区在线| 欧美变态另类bdsm刘玥| kizo精华| 亚洲av二区三区四区| 国产探花极品一区二区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久久精品大字幕| 国产v大片淫在线免费观看| 99在线视频只有这里精品首页| 夜夜爽天天搞| 欧美成人a在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久综合国产亚洲精品| 听说在线观看完整版免费高清| 国产一区二区激情短视频| 亚洲自偷自拍三级| 久久久久久大精品| 国产av不卡久久| 免费观看在线日韩| 黄色日韩在线| 99视频精品全部免费 在线| 婷婷亚洲欧美| 岛国毛片在线播放| 网址你懂的国产日韩在线| 婷婷亚洲欧美| 成人亚洲欧美一区二区av| 99久久九九国产精品国产免费| 搞女人的毛片| 91狼人影院| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 寂寞人妻少妇视频99o| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 免费在线观看成人毛片| 成人av在线播放网站| 午夜爱爱视频在线播放| 久久精品夜色国产| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 免费看日本二区| 99久久人妻综合| 一本精品99久久精品77| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 热99在线观看视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 夫妻性生交免费视频一级片| 在线a可以看的网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产成人精品久久久久久| 午夜福利在线在线| 哪个播放器可以免费观看大片| www日本黄色视频网| 热99在线观看视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产男人的电影天堂91| a级毛片免费高清观看在线播放| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产黄片视频在线免费观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 麻豆国产av国片精品| 国产乱人偷精品视频| 久久久欧美国产精品| av.在线天堂| 黄片无遮挡物在线观看| 热99在线观看视频| АⅤ资源中文在线天堂| 一级毛片电影观看 | 国产三级中文精品| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品一区二区免费观看| 五月玫瑰六月丁香| 久久久精品94久久精品| 99九九线精品视频在线观看视频| 两个人视频免费观看高清| 午夜老司机福利剧场| 亚洲最大成人手机在线| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品蜜桃在线观看 | 一个人看视频在线观看www免费| 色5月婷婷丁香| 久久久久国产网址| 欧美三级亚洲精品| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久精品国产自在天天线| 在线免费观看的www视频| 有码 亚洲区| 欧美一区二区亚洲| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 性色avwww在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 秋霞在线观看毛片| 99久久人妻综合| 麻豆一二三区av精品| www.av在线官网国产| 成年女人看的毛片在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日本色播在线视频| 色吧在线观看| 床上黄色一级片| 免费观看人在逋| 嫩草影院入口| 午夜激情欧美在线| 中出人妻视频一区二区| 观看免费一级毛片| av在线亚洲专区| 我的老师免费观看完整版| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 成人欧美大片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 我的老师免费观看完整版| 国产精品无大码| 日本-黄色视频高清免费观看| 小说图片视频综合网站| 九九在线视频观看精品| 亚洲精品自拍成人| 婷婷六月久久综合丁香| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品久久视频播放| 麻豆乱淫一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产伦理片在线播放av一区 | 少妇被粗大猛烈的视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 男插女下体视频免费在线播放| 91精品国产九色| 美女被艹到高潮喷水动态| www.av在线官网国产| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美bdsm另类| 久久久久久国产a免费观看| 一个人免费在线观看电影| 精品欧美国产一区二区三| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 乱码一卡2卡4卡精品| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 网址你懂的国产日韩在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美bdsm另类| 久久久精品欧美日韩精品| 高清毛片免费观看视频网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 特大巨黑吊av在线直播| 成人综合一区亚洲| 国产毛片a区久久久久| 成人毛片60女人毛片免费| www日本黄色视频网| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲五月天丁香| 国产精品一区www在线观看| 国产乱人偷精品视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品无大码| 91麻豆精品激情在线观看国产| 色哟哟·www| 69av精品久久久久久| 毛片女人毛片| 久久99热6这里只有精品| 国产精品永久免费网站| 日韩一区二区视频免费看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产午夜精品论理片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 免费看a级黄色片| 美女国产视频在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 天美传媒精品一区二区| 99久国产av精品国产电影| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲无线观看免费| 高清午夜精品一区二区三区 | 日韩av在线大香蕉| 国产精品一区www在线观看| 亚洲图色成人| 国产成人一区二区在线| 亚洲第一区二区三区不卡| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 99九九线精品视频在线观看视频| 午夜老司机福利剧场| 欧美丝袜亚洲另类| 日本在线视频免费播放| 18+在线观看网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 22中文网久久字幕| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久久久久国产a免费观看| 天天躁日日操中文字幕| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成年av动漫网址| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品国产高清国产av| 日本免费一区二区三区高清不卡| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 午夜福利在线在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 91久久精品国产一区二区成人| 国产人妻一区二区三区在| 特大巨黑吊av在线直播| 成人一区二区视频在线观看| 波野结衣二区三区在线| av天堂在线播放| 久久人人爽人人爽人人片va| 男女视频在线观看网站免费| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲国产精品国产精品| 欧美+日韩+精品| 国产爱豆传媒在线观看| 国产成人91sexporn| 一夜夜www| 国产精品一区www在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 在线观看av片永久免费下载| 黑人高潮一二区| 午夜福利在线观看吧| 久久久久久久久久久丰满| 国产成人一区二区在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲国产欧美人成| 日本欧美国产在线视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| www.av在线官网国产| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产视频首页在线观看| 国产美女午夜福利| 国产久久久一区二区三区| 日韩欧美国产在线观看| 麻豆成人av视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| www.色视频.com| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 老女人水多毛片| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 男人的好看免费观看在线视频| 日韩欧美国产在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品女同一区二区软件| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 人人妻人人看人人澡| 身体一侧抽搐| 精品午夜福利在线看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 午夜久久久久精精品| 成人亚洲欧美一区二区av| av免费在线看不卡| 国产精品久久视频播放| 国产久久久一区二区三区| 免费看光身美女| 日本色播在线视频| 乱人视频在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 看黄色毛片网站| 午夜福利高清视频| 色综合站精品国产| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产精品国产高清国产av| 日韩欧美精品v在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产69精品久久久久777片| 搞女人的毛片| 日韩制服骚丝袜av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲国产精品久久男人天堂| 女同久久另类99精品国产91| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜爱爱视频在线播放| 久久久久免费精品人妻一区二区| 黄片无遮挡物在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲综合色惰| 成人av在线播放网站| 97超碰精品成人国产| 精华霜和精华液先用哪个| 夜夜爽天天搞| 日韩欧美国产在线观看| 免费观看在线日韩| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品一二三区在线看| 91狼人影院| 成人国产麻豆网| 一区二区三区免费毛片| av在线老鸭窝| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品精品国产色婷婷| 中出人妻视频一区二区| 国产精品.久久久| 日韩三级伦理在线观看| 三级毛片av免费| 亚洲性久久影院| 国产高清激情床上av| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产成人精品一,二区 | 国产淫片久久久久久久久| 赤兔流量卡办理| 国产真实伦视频高清在线观看| 美女内射精品一级片tv| 国产成人a区在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本免费a在线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 网址你懂的国产日韩在线| 美女黄网站色视频| 简卡轻食公司| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美bdsm另类| 插阴视频在线观看视频| 国产激情偷乱视频一区二区| av在线观看视频网站免费| 成人午夜高清在线视频| 天堂影院成人在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲最大成人av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲人成网站在线播| 精品熟女少妇av免费看| 色综合站精品国产| 国产精品蜜桃在线观看 | 最新中文字幕久久久久| 免费观看的影片在线观看| 午夜视频国产福利| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 夜夜爽天天搞| av专区在线播放| 久久人人精品亚洲av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 天堂网av新在线| 日韩一本色道免费dvd| 一级毛片久久久久久久久女| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 女同久久另类99精品国产91| 麻豆国产97在线/欧美| 午夜激情福利司机影院| 欧美区成人在线视频| 黑人高潮一二区| 午夜a级毛片| 一级毛片我不卡| 99久久精品一区二区三区| 久久99精品国语久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲av中文av极速乱| 一区二区三区四区激情视频 | 深夜a级毛片| 免费观看的影片在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日本一二三区视频观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美人与善性xxx| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产人妻一区二区三区在| 天天一区二区日本电影三级| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 人妻系列 视频| 国语自产精品视频在线第100页| 99在线人妻在线中文字幕| 成人鲁丝片一二三区免费| 熟女电影av网| 欧美性感艳星| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产极品天堂在线| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美一级a爱片免费观看看| 只有这里有精品99| 午夜免费激情av| 久久久久久久久久成人| 美女大奶头视频| 国产人妻一区二区三区在| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美精品国产亚洲| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲色图av天堂| 久久精品综合一区二区三区| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美最新免费一区二区三区| 少妇的逼好多水| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 悠悠久久av| 精品免费久久久久久久清纯| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日日啪夜夜撸| 丝袜美腿在线中文| 99热精品在线国产| 少妇丰满av| 久久久久网色| 国产精品.久久久| 哪里可以看免费的av片| 极品教师在线视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产 一区 欧美 日韩| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲欧美成人精品一区二区| 免费av毛片视频| 欧美丝袜亚洲另类| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 午夜精品在线福利| 国内精品一区二区在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 晚上一个人看的免费电影| 成人毛片60女人毛片免费| 69av精品久久久久久| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产高清激情床上av| 亚洲一区高清亚洲精品| 中文亚洲av片在线观看爽| 两个人视频免费观看高清| 久久久久久久久中文| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久精品国产亚洲网站| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 哪里可以看免费的av片| 精品久久久久久久久久久久久| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产美女午夜福利| 天堂中文最新版在线下载 | 搡女人真爽免费视频火全软件| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产久久久一区二区三区| av天堂在线播放| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美高清成人免费视频www| 久久精品国产自在天天线| 国产精品久久视频播放| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久久国产网址| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品99久久久久久久久| 五月玫瑰六月丁香| 精品人妻一区二区三区麻豆| 少妇被粗大猛烈的视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 中文字幕av成人在线电影| 久久久色成人| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产精品不卡视频一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 国产日韩欧美在线精品| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日本在线视频免费播放| 日韩精品有码人妻一区| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲最大成人手机在线| 婷婷精品国产亚洲av| 最近中文字幕高清免费大全6| 波多野结衣巨乳人妻| 哪里可以看免费的av片| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产精品永久免费网站| 国产高清激情床上av| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美日本亚洲视频在线播放| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 可以在线观看的亚洲视频| 国产极品精品免费视频能看的| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 成人特级黄色片久久久久久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 国产真实乱freesex| 在线天堂最新版资源| 午夜老司机福利剧场| 精品不卡国产一区二区三区| av视频在线观看入口| 日韩成人伦理影院| 成人特级av手机在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 天堂√8在线中文| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品,欧美在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 草草在线视频免费看| 欧美高清性xxxxhd video| 深夜a级毛片| 成年免费大片在线观看| 此物有八面人人有两片| 精品人妻熟女av久视频| 欧美精品一区二区大全| 亚洲四区av| 精品熟女少妇av免费看| 六月丁香七月| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产久久久一区二区三区| 我的老师免费观看完整版| 两个人视频免费观看高清| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 精品久久国产蜜桃| 少妇的逼水好多| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 久久久久久大精品| 免费av观看视频| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品不卡视频一区二区| 91久久精品国产一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 激情 狠狠 欧美| 国产伦一二天堂av在线观看| 观看美女的网站| 岛国毛片在线播放| 久久韩国三级中文字幕| 国产黄片美女视频| 欧美成人a在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产成人精品久久久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产极品天堂在线| 久久精品久久久久久久性| 婷婷色综合大香蕉| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品av视频在线免费观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲av免费在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 有码 亚洲区| 久久久欧美国产精品| 搡老妇女老女人老熟妇| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久午夜福利片| 天堂中文最新版在线下载 | 91久久精品国产一区二区成人| 小说图片视频综合网站| 午夜福利视频1000在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 国产成人aa在线观看| 此物有八面人人有两片| 青春草国产在线视频 | 深爱激情五月婷婷| 看免费成人av毛片| 午夜老司机福利剧场| 国产高潮美女av| 桃色一区二区三区在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 别揉我奶头 嗯啊视频| 五月玫瑰六月丁香| 日韩欧美在线乱码| av在线播放精品| 日本成人三级电影网站|