基因編輯的“前世今生”

李 琳，朱學(xué)明，鮑堅(jiān)東，王教瑜，林福呈，2，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 2.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058)

“我們從哪里來？要到哪里去？”是關(guān)于生命本源的哲學(xué)追問，生命科學(xué)的發(fā)展讓人們有了找到回答這一問題的可能。長期以來，人們從未停止對(duì)生命的探索。1865年，孟德爾提出的基因分離定律和基因自由組合定律，揭示了遺傳最基本的規(guī)律。1909年，摩爾根發(fā)現(xiàn)遺傳連鎖定律，更加豐富了人們對(duì)遺傳規(guī)律的認(rèn)識(shí)。Mccarty等通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)有活性的遺傳物質(zhì)是脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)；1952年，Hershey等通過放射性同位素標(biāo)記的T2噬菌體增殖試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了DNA是生物的遺傳物質(zhì)；1953年，沃森和克里克提出的DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模式，使人們對(duì)生命的認(rèn)識(shí)進(jìn)入到了分子水平。此時(shí)，人們已經(jīng)充分認(rèn)識(shí)到DNA對(duì)生物性狀的決定性作用，DNA序列的改變，如堿基缺失、替換、插入等可能會(huì)引起表型的變化，或引發(fā)疾病。生物在自然情況下突變的概率極低，通過人為改造的方法可以提高突變率。因此，科學(xué)家提出是否可以人為改變或修飾DNA序列中特定位置的堿基以達(dá)到改良性狀或治療疾病的目的?；谏鲜稣J(rèn)識(shí)，早期人們通過同源重組來提高突變率，經(jīng)過不斷的探索和努力，又發(fā)現(xiàn)了歸巢核酸內(nèi)切酶(meganuclease)和鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)等，這些技術(shù)能人為地改變基因，但仍然存在很多弊端和局限。直到CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)使基因編輯技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的發(fā)展階段。本文擬通過對(duì)基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程、技術(shù)原理和應(yīng)用進(jìn)行綜述，針對(duì)該技術(shù)目前存在的問題與面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行展望，為人們科學(xué)認(rèn)識(shí)并利用該技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 基因編輯技術(shù)的演進(jìn)

1.1 同源重組的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)70年代，科學(xué)家在研究細(xì)菌如何防御噬菌體過程中發(fā)現(xiàn)，限制性內(nèi)切酶可以保護(hù)細(xì)菌免受噬菌體的侵害，這個(gè)發(fā)現(xiàn)具有里程碑式的意義，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)可以對(duì)基因組進(jìn)行編輯。20世紀(jì)80年代，Smithies等和Capecchi發(fā)現(xiàn)，可以通過同源重組將外源DNA整合到哺乳動(dòng)物的基因組中；但這種方法有很大的局限性，不僅整合效率極低(整合效率取決于細(xì)胞的狀態(tài)和類型)，而且容易脫靶。

1.2 歸巢核酸內(nèi)切酶

20世紀(jì)80年代末期，Rudin等和Rouet等發(fā)現(xiàn)，在靶標(biāo)位置引入雙鏈斷裂的DNA(double-strand break，DSB)會(huì)顯著提高目的基因的整合效率。研究人員最早通過歸巢核酸內(nèi)切酶(也稱大范圍核酸內(nèi)切酶)在基因組中引入特定的雙鏈斷裂DNA。歸巢核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別14～40 bp的DNA片段，識(shí)別之后絕大部分通過非同源末端連接修復(fù)(non-homologous end joining，NHEJ)(圖1-A和圖1-D)。人們?cè)谧匀唤缰幸呀?jīng)找到數(shù)百種歸巢核酸內(nèi)切酶，使用最廣泛的主要有3種：Ⅰ-Ⅰ[Plessis等在啤酒酵母()的線粒體中發(fā)現(xiàn)]、Ⅰ-Ⅰ[Dürrenberger等在衣藻()的葉綠體中發(fā)現(xiàn)]和Ⅰ-Ⅰ[Silva等在超嗜熱古菌()中發(fā)現(xiàn)]。然而，通過歸巢核酸內(nèi)切酶進(jìn)行基因編輯存在很大的制約性：(1)盡管有數(shù)百種的歸巢核酸內(nèi)切酶，每個(gè)都有自己獨(dú)特的識(shí)別序列，但要找到適合靶向特定基因序列的歸巢核酸內(nèi)切酶的概率極低；(2)由于DNA雙鏈斷裂主要通過非同源末端連接修復(fù)，該修復(fù)機(jī)制不能引入外源的DNA模板，并且會(huì)在斷裂位點(diǎn)隨機(jī)刪除或者插入DNA片段。

1.3 鋅指核酸酶

Klug等發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白能夠特異性識(shí)別3 bp的DNA序列，多個(gè)鋅指蛋白可以組裝成大復(fù)合物。Kim等發(fā)現(xiàn)，限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ具有獨(dú)特的DNA識(shí)別域和切割域，在靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行同源二聚化以切割目的DNA片段。研究人員將Ⅰ的DNA識(shí)別域去除，將其切割域與鋅指模塊融合，命名為鋅指核酸酶。鋅指核酸酶技術(shù)被稱為第一代基因編輯技術(shù)，利用該技術(shù)進(jìn)行基因編輯時(shí)，需要設(shè)計(jì)2個(gè)單獨(dú)的鋅指模塊(分別結(jié)合DNA的2條鏈)，針對(duì)DNA序列上相鄰的2個(gè)位點(diǎn)(5-7 bp)，通過Ⅰ同源二聚化導(dǎo)致DNA靶標(biāo)位點(diǎn)的DNA雙鏈斷裂，DNA損傷后通過非同源末端連接修復(fù)或同源定向修復(fù)(homology directed repair，HDR)，從而達(dá)到基因編輯的目的(圖1-B和圖1-D)。此外，還可以通過加工改造鋅指模塊，靶向不同的DNA序列進(jìn)行特異性切割。然而該技術(shù)也有局限性：(1)可編輯的靶基因位點(diǎn)有限，有限的鋅指蛋白類別只可識(shí)別有限的DNA序列；(2)ZFNs基因編輯的效率低，只有30%左右；(3)操作復(fù)雜，成本高，容易脫靶。科研人員一直在不斷改進(jìn)ZFNs技術(shù)，Miller等和Doyon等發(fā)現(xiàn)，可以通過電荷之間的相互排斥形成異二聚體的ZFN結(jié)構(gòu)，從而阻止Ⅰ在非靶標(biāo)位置進(jìn)行二聚化并切割DNA序列。Guo等發(fā)現(xiàn)，通過蛋白質(zhì)工程的方法可以提高Ⅰ的切割效率。2014年，Tebas等通過ZFNs編輯艾滋病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者自體CD4 T細(xì)胞中的艾滋病毒入侵輔助受體CCR5來治療艾滋病。

1.4 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶

類轉(zhuǎn)錄激活因子(transcription activator-like effector，TALE)是植物病原菌黃單孢菌中的一種效應(yīng)因子。2009年，Boch等和Moscou等發(fā)現(xiàn)，類轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白可以識(shí)別DNA序列。2011年，第二代基因編輯技術(shù)——類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶TALENs誕生。與ZFNs一樣，TALENs在形式和功能上也是模塊化的，由Ⅰ切割結(jié)構(gòu)域和TALE蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合組成。TALENs識(shí)別模塊一般由34個(gè)氨基酸組成，其中第12和13位的氨基酸稱為可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidues，RVDs)，RVDs特異性識(shí)別DNA上核苷酸的種類。RVDs的識(shí)別密碼為NI(Asn Ile)識(shí)別腺嘌呤(A)，HD(His Asp)識(shí)別胞嘧啶(C)，NN(AsnAsn)識(shí)別鳥嘌呤(G)，NG(AsnGly)識(shí)別胸腺嘧啶(T)。TALENs的DNA結(jié)合域通常由1.5～33.5個(gè)重復(fù)的TALEN單體組成。如需進(jìn)行基因編輯，如靶基因的敲除，將1對(duì)TALENs共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，2個(gè)Ⅰ形成二聚體后在靶標(biāo)位點(diǎn)剪切DNA，使DNA雙鏈斷裂，細(xì)胞通過非同源末端連接或同源定向修復(fù)DNA(圖1-C和圖1-D)，在修復(fù)過程中插入或刪除部分堿基，造成移碼突變，導(dǎo)致下游一系列密碼子改變，相當(dāng)于敲除目的基因。在實(shí)際操作中，Mussolino等發(fā)現(xiàn)，1對(duì)TALFNs的識(shí)別位點(diǎn)要間隔17個(gè)堿基左右。與ZFNs相比，TALENs技術(shù)具有設(shè)計(jì)簡單、特異性高的優(yōu)勢(shì)，是科研人員研究基因功能和潛在基因治療的工具；但該技術(shù)仍存在模塊組裝過程繁瑣、具有一定的細(xì)胞毒性等缺點(diǎn)。

A，歸巢核酸內(nèi)切酶可識(shí)別長段DNA序列，沒有明顯的結(jié)合和切割結(jié)構(gòu)域；B，鋅指核酸酶，每個(gè)鋅指核酸酶識(shí)別3個(gè)堿基。C，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶，每個(gè)TALE識(shí)別單個(gè)堿基；D，以上3種酶都會(huì)導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，可以通過容易出錯(cuò)的非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(fù)(HDR)來修復(fù)。NHEJ會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)位點(diǎn)的隨機(jī)插入缺失和基因破壞，HDR可以在目標(biāo)位點(diǎn)插入特定的DNA模板(單鏈或雙鏈)以進(jìn)行精確的基因編輯。

1.5 CRISPR-Cas系統(tǒng)

ZFNs和TALENs技術(shù)提高了基因敲除效率，但是針對(duì)基因組中的不同位點(diǎn)都需要重新設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)，操作繁瑣，技術(shù)門檻高，限制了應(yīng)用和推廣。經(jīng)過科學(xué)家的不懈努力， CRISPER技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它的出現(xiàn)徹底彌補(bǔ)了以上各種基因編輯技術(shù)的缺陷，因其系統(tǒng)簡單、精準(zhǔn)、快速，極大降低了技術(shù)門檻，一出現(xiàn)就風(fēng)靡整個(gè)生物界。CRISPR(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列)原本只是原核生物中一種比較特殊的DNA重復(fù)元件。1987年，Ishino等最早在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)CRISPR，當(dāng)時(shí)還沒有將這些重復(fù)的序列命名。2002年，Jansen等將這些重復(fù)的序列正式被命名為CRISPR。CRISPR重復(fù)序列簇中間隔著非重復(fù)DNA序列，非重復(fù)DNA序列間隔區(qū)來自于病毒或者其他可移動(dòng)的遺傳元件，并且CRISPR與保守的Cas(CRISPR-associated)基因相鄰。Barrangou等發(fā)現(xiàn)，在病毒攻擊嗜熱鏈球菌后，嗜熱鏈球菌會(huì)將噬菌體基因組序列整合到新間隔區(qū)，這段新間隔區(qū)決定了Cas酶的靶向特異性，鑄建了對(duì)噬菌體的防御系統(tǒng)。

PAMs(protospacer-adjacent motifs，原始間隔區(qū)相鄰基序)的發(fā)現(xiàn)為CRISPR的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。Deveau等發(fā)現(xiàn)，CRISPR的間隔序列與PAMs高度相似，并且PAMs對(duì)CRISPR系統(tǒng)的運(yùn)行極其重要。隨后Garneau等發(fā)現(xiàn)，Cas9是嗜熱鏈球菌中唯一具有DNA催化活性的蛋白。Jinek等和Gasiunas等發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌的CRISPR基因座能夠重建對(duì)大腸埃希菌的干擾，此外Cas9酶可以重新編程以靶向細(xì)菌中目的DNA序列，該發(fā)現(xiàn)是CRISPR作為一種生物技術(shù)工具的標(biāo)志。Cas9發(fā)揮作用時(shí)需要2種短RNA，即crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)。成熟的crRNA和反式激活的crRNA的發(fā)現(xiàn)簡化了CRISPR的操作。crRNA由作為引導(dǎo)序列的部分和與tracrRNA堿基配對(duì)的另一部分組成。crRNA、tracrRNA和Cas9形成Cas9-RNA復(fù)合物在靶標(biāo)位置通過DNA雙鏈斷裂切割DNA。sgRNA(single guide RNA)的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步簡化了該技術(shù)，Jinek等發(fā)現(xiàn)，CRISPR-Cas9可以被sgRNA引導(dǎo)，sgRNA由tracrRNA和crRNA融合形成(圖2)。至此以后，研究人員只需設(shè)計(jì)一個(gè)簡單的sgRNA，就可以輕松引導(dǎo)CRISPR-Cas9識(shí)別基因組中的準(zhǔn)確位置并進(jìn)行基因編輯，CRISPR-Cas9技術(shù)被視為第三代基因編輯技術(shù)。

Cas9核酸酶靶向切割與單鏈向?qū)NA (sgRNA)互補(bǔ)的DNA序列，該序列位于原始間隔區(qū)相鄰基序(PAM)的上游。

Koonin等從廣義上將CRISPR分為2大類，第一類包括在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR系統(tǒng)；第二類包括Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ型CRISPR系統(tǒng)。目前使用最廣泛的是來自釀膿鏈球菌()的Ⅱ型CRISPR-Cas9系統(tǒng)，因?yàn)槠銷GGPAM序列很簡單。不過研究人員仍然在積極探索不同的CRISPR系統(tǒng)，主要側(cè)重于3個(gè)方面：(1)減少Cas9核酸酶的分子量；(2)提高其保真性；(3)擴(kuò)大Cas9的靶向范圍。研究人員在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上，發(fā)明了第二代CRISPR基因編輯技術(shù)。第二代技術(shù)可以精準(zhǔn)地將單個(gè)堿基轉(zhuǎn)變?yōu)橄胍膲A基(將堿基直接變成T、A或者G)，并且不會(huì)引起DNA的雙鏈斷裂。目前主要有胞嘧啶剪輯編輯器(cytidine base editing，CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editing，ABE)這兩類DNA堿基編輯器。CBE是將C-G堿基對(duì)轉(zhuǎn)換為T-A堿基對(duì)，ABE將A-T堿基對(duì)轉(zhuǎn)換為G-C堿基對(duì)。這些新穎的單堿基編輯方法擴(kuò)大了基因組靶向的范圍。dCas9蛋白是Cas9蛋白的突變體，Chen等利用dCas9調(diào)節(jié)基因表達(dá)。dCas9技術(shù)的進(jìn)步大大提高了活細(xì)胞成像的效率和活細(xì)胞染色質(zhì)成像的基因組靶向范圍。

除了Cas9蛋白，Cas12、Cas13、Cas14蛋白也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。Teng等發(fā)現(xiàn)，Cas12擅長識(shí)別雙鏈DNA，在識(shí)別DNA序列中的單堿基時(shí)，發(fā)現(xiàn)有匹配不好的堿基，會(huì)繼續(xù)尋找直至識(shí)別到正確的序列，然后結(jié)合形成封閉的R-環(huán)。Cox等發(fā)現(xiàn)，Cas13擅長識(shí)別單鏈RNA，即靶向RNA進(jìn)行基因編輯。Cas13專注靶向RNA的功能補(bǔ)充了靶向DNA的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d這4種亞型。各種亞型中，Cas13d具有蛋白體積最小、載體構(gòu)建方便、易于向細(xì)胞內(nèi)輸送等明顯優(yōu)勢(shì)。Harrington等發(fā)現(xiàn)，Cas14擅長識(shí)別單鏈DNA，剪切時(shí)不依賴PAM序列，它比Cas9蛋白小，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的功能性CRISPR系統(tǒng)。

2 基因編輯的應(yīng)用

2.1 基因編輯在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用

（2）將航拍影響拼接為正射影響，該影像為geotiff格式，包含rgba三個(gè)通道；將LiDAR數(shù)據(jù)提取為DEM，并以單通道的geotiff格式保存。

2.1.1 提高產(chǎn)量品質(zhì)

提高農(nóng)作物的產(chǎn)量是育種最重要的目的之一。在水稻育種方面，Wang等利用CRISPR技術(shù)獲得了株高降低且有增產(chǎn)潛力的水稻材料。Lv等利用CRISPR技術(shù)敲除水稻中5基因后，水稻籽粒顯著增多，產(chǎn)量顯著提高。Miao等研究表明，通過靶向水稻中一個(gè)調(diào)節(jié)粒型和株高的基因396，使之突變，突變體植株的籽粒變大、穗長增加，且在低氮條件下表現(xiàn)出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。在小麥育種方面，Wang等利用CRISPR技術(shù)敲除小麥籽粒重基因2后，突變株的籽粒大小和千粒重明顯提高。為保證水稻的蒸煮品質(zhì)，Zeng等、Xu等和Huang等利用基因編輯技術(shù)，通過靶向調(diào)控基因，培育出口感優(yōu)良的水稻品種。香稻品種的米飯有獨(dú)特香味和口感，其香味和口感受2基因的調(diào)節(jié)，Ashokkumar等和Tang等利用CRISPR技術(shù)編輯該基因后增強(qiáng)了米飯的香味。

2.1.2 增強(qiáng)抗性

植物病蟲害等生物脅迫對(duì)糧食安全造成了嚴(yán)重的威脅。Wang等利用基因編輯技術(shù)敲除調(diào)控稻瘟病菌的抗性基因922后，培育出抗稻瘟病的純合突變株系。Oliva等通過編輯基因啟動(dòng)子區(qū)域培育出對(duì)百葉枯病具有廣譜抗性的水稻品種。Wang等通過TALENs和CRISPR-Cas9技術(shù)修飾六倍體小麥中MLO蛋白的多個(gè)等位基因后，小麥對(duì)白粉病的抗性增強(qiáng)。

干旱、高溫、寒冷、重金屬污染等非生物脅迫對(duì)作物生長發(fā)育和產(chǎn)量有嚴(yán)重影響，通過基因編輯技術(shù)增強(qiáng)農(nóng)作物對(duì)非生物脅迫的耐受性是亟待解決的問題。鎘是一種對(duì)人體有害的重金屬，鎘超標(biāo)的大米是飲食上鎘攝入的主要來源。Clemens等、Ishikawa等和Tang等通過基因編輯鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，篩選出耐鎘的水稻品種。Shi等通過CRISPR技術(shù)編輯玉米中8基因，增強(qiáng)玉米對(duì)干旱的抗性。Zhang等通過改良的基因編輯技術(shù)敲除水稻相關(guān)調(diào)控基因166，增強(qiáng)水稻的抗旱性。

2.1.3 基因編輯作物的監(jiān)管現(xiàn)狀

2.2 基因編輯在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

2.2.1 藥物靶標(biāo)基因的篩選

基于全基因組的CRISPR技術(shù)敲除篩選可用于功能基因組學(xué)研究，通過該技術(shù)能夠檢測(cè)細(xì)胞耐藥性的基因組位點(diǎn)，明確細(xì)胞如何誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)，闡明某些病毒如何誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。利用基因編輯技術(shù)發(fā)現(xiàn)的功能性非元件為研究人類基因組的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化、藥物靶標(biāo)的篩選提供了一種新的手段。

2.2.2 疾病建模和生產(chǎn)器官供體

基因編輯技術(shù)的成熟加速了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出現(xiàn)，如轉(zhuǎn)基因斑馬魚、轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)基因大鼠、轉(zhuǎn)基因猴子和轉(zhuǎn)基因豬，這些轉(zhuǎn)基因生物加速了人類疾病的建模，為發(fā)現(xiàn)新的治療方法奠定基礎(chǔ)。

CRISPR技術(shù)還可以解決外來移植器官的免疫排斥反應(yīng)。豬被認(rèn)為是人外來器官的首選動(dòng)物。2020年12月，美國食品藥品管理局批準(zhǔn)了敲除-半乳糖的轉(zhuǎn)基因豬GalSafe上市，它既可以為半乳糖過敏者提供安全肉類食物，又可以提取肝素等生產(chǎn)藥物。2021年9月25日，美國研究人員將一頭轉(zhuǎn)基因豬的腎移植入腦死亡的志愿者體內(nèi)，移植后腎臟工作了54 h，未見身體出現(xiàn)排斥反應(yīng)，這一“變革時(shí)刻”的醫(yī)學(xué)進(jìn)步可能為成千上萬需要器官移植的患者帶來希望；該項(xiàng)研究的論文還沒有經(jīng)過同行評(píng)議正式發(fā)表，并且此項(xiàng)研究只是獲得初期的成功，移植后的1個(gè)月乃至10 a后會(huì)發(fā)生什么還是未知數(shù)。

2.2.3 基因治療

基因編輯可以精準(zhǔn)改造人類基因，在治療遺傳性疾病方面有巨大潛力。目前來說，比較成功的案例是Tebas等利用ZFNs技術(shù)破壞HIV共受體CCR5，已經(jīng)在臨床Ⅰ期試驗(yàn)成功。Tabebordbar等和Nelson等利用基因編輯技術(shù)恢復(fù)了肌營養(yǎng)不良蛋白基因的表達(dá)，拯救了杜氏肌營養(yǎng)不良癥模型小鼠的肌肉功能。在模型小鼠中，Yin等利用基因編輯技術(shù)治療人類遺傳性酪氨酸血癥。最近，Stadtmauer等研究表明，CRISPR編輯細(xì)胞在單次注射后可以長時(shí)間保持抗腫瘤功能。2021年6月26日，首個(gè)人體基因編輯臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)刊登在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上，Gillmore等利用CRISPR-Cas9剔除編碼甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣變性的基因，這將開啟一針治療人類遺傳病的時(shí)代。CRISPR技術(shù)可以靶向人類病毒如HIV-1、皰疹病毒、乙型肝炎病毒等。Hu等利用CRISPR特異性識(shí)別宿主細(xì)胞，對(duì)病毒相關(guān)基因進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，從而抑制病毒的表達(dá)和復(fù)制。

2.2.4 人類胚胎基因編輯

人類胚胎的基因編輯工作一直是輿論關(guān)注和爭論的焦點(diǎn)。2015年4月，Liang等利用CRISPR-Cas9技術(shù)同源修復(fù)了人類胚胎中引起地中海貧血基因的突變。2016年，Kang等利用CRISPR編輯受精卵中的5，結(jié)果由于脫靶產(chǎn)生了嵌合式的受精卵。

目前關(guān)于人類胚胎基因編輯存在較多問題和爭論：(1)安全性問題，目前人們對(duì)胚胎編輯的安全性無法做出有效評(píng)估，CRISPR技術(shù)存在脫靶效應(yīng)的報(bào)道屢見不鮮。Haapaniemi等研究認(rèn)為，CRISPR編輯可能增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。(2)權(quán)利問題，任何人是否有權(quán)利決定采取胚胎基因編輯技術(shù)對(duì)患者進(jìn)行治療；此外，如何平衡個(gè)人與整體利益也亟待解決。(3)公平問題，如果基因編輯技術(shù)已經(jīng)很成功，誰可以享受該技術(shù)？

2.3 基因編輯在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用

優(yōu)質(zhì)的微生物菌種對(duì)提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的品質(zhì)與產(chǎn)量有重要意義。基因編輯技術(shù)可以對(duì)菌種進(jìn)行定向遺傳改良。放線菌是工業(yè)生產(chǎn)次生代謝物的最重要來源之一。Tong等通過基因編輯，使放線菌中某些基因失活，從而提高代謝物的產(chǎn)量，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，僅在極少數(shù)工業(yè)微生物中建立了基因編輯系統(tǒng)，如釀酒酵母、稻瘟病菌、產(chǎn)甘油假絲酵母等。因此，利用基因編輯技術(shù)開發(fā)和改造兼容性的核酸酶，并建立多種微生物成熟的應(yīng)用體系，對(duì)創(chuàng)造工業(yè)微生物菌株有重要意義。

3 基因編輯技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)

基因編輯技術(shù)在疾病治療、動(dòng)植物品種改良、抗病育種、醫(yī)藥生產(chǎn)、工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域取得了不同程度的進(jìn)展，但是基因編輯技術(shù)本身及其應(yīng)用也呈現(xiàn)出了復(fù)雜性和不確定性的特征，這給傳統(tǒng)倫理學(xué)與相關(guān)倫理準(zhǔn)則的制定帶來了巨大的沖擊與挑戰(zhàn)。

3.1 基因編輯在工農(nóng)業(yè)應(yīng)用上的局限

基因編輯在技術(shù)上的局限性：(1)CRISPR技術(shù)中PAM序列的限制。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，PAM序列只識(shí)別NGG，對(duì)于特定靶位點(diǎn)的選擇存在一定限制。(2)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的限制。植物中主要通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化3種方式，這3種方法都有局限性。(3)脫靶現(xiàn)象。脫靶現(xiàn)象是沒有找到要編輯的位置，而去隨機(jī)切割替換的非目的位點(diǎn)，從而造成意想不到的嚴(yán)重后果；科研人員不斷改進(jìn)CRISPR技術(shù)，減少了脫靶幾率，但是脫靶現(xiàn)象仍然存在，無法根除。(4)廣泛應(yīng)用問題?；蚓庉嬜魑锸欠衲軌蚴袌龌€存在較大的爭議。人類可食用植物經(jīng)過了選擇性培育，選擇方向非常明確，第一是提高營養(yǎng)成分含量，第二是降低原來的毒性，很多野生植物已經(jīng)充分馴化，成為了主要食物。目前基因編輯的食物還未經(jīng)歷長時(shí)間的自然選擇和試驗(yàn)，是否存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)短時(shí)間難以判斷，這加劇了大眾對(duì)于基因編輯食品的不認(rèn)可、排斥和擔(dān)憂。

3.2 基因編輯在醫(yī)學(xué)上的弊端

基因編輯在醫(yī)學(xué)上的研究很多，但仍然是初步階段，目前存在四大問題：(1)有效性。基因編輯成功的效率比較低，有效性不高。(2)遞送的方式。CRISPR/Cas9在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因編輯作用的形式分別是Cas9蛋白和sgRNA，而Cas9進(jìn)入細(xì)胞的形式有3種：DNA、RNA或蛋白，sgRNA進(jìn)入細(xì)胞的形式有2種：DNA或RNA，由于缺乏理想的遞送系統(tǒng)，限制了CRISPR/Cas9技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。(3)脫靶問題。sgRNA可能結(jié)合到與靶基因相似的序列上，從而在非靶標(biāo)基因處切割DNA，從而造成脫靶。Cas9也可能會(huì)識(shí)別非標(biāo)準(zhǔn)的PAM，導(dǎo)致不同程度的脫靶效應(yīng)。Cas9蛋白的持續(xù)表達(dá)也是引起脫靶現(xiàn)象的重要原因。如果在編輯人類細(xì)胞過程中造成脫靶現(xiàn)象，對(duì)于個(gè)體的影響將是致命的。(4)倫理安全問題?；蚓庉嫾夹g(shù)發(fā)展到現(xiàn)在還不足10 a，人類從基因的角度研究生命也才60多年，我們還沒有完全了解每個(gè)基因的功能，而且人是一個(gè)復(fù)雜的有機(jī)體，對(duì)人類基因功能的研究需要上升到時(shí)間、空間、環(huán)境等，甚至四維、五維的認(rèn)知高度。人類的大多數(shù)疾病是由多種因素決定的，不僅僅是通過編輯一個(gè)基因就能達(dá)到治病的效果，被編輯的基因也可能潛在影響身體的其他性能。

4 展望

基因編輯技術(shù)經(jīng)過近十年長足的發(fā)展，形成四大技術(shù)，極大地推動(dòng)其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。基因編輯技術(shù)也面對(duì)巨大的風(fēng)險(xiǎn)和挑戰(zhàn)，基因編輯能否高效靶向治療疾病還需要長時(shí)間的研究和臨床試驗(yàn)，技術(shù)發(fā)展背后的倫理、公平正義、文明等問題不斷激增?；蚓庉嫶嬖?個(gè)倫理上的困惑：(1)如何認(rèn)定基因編輯有利于人類的繁衍和健康？(2)如何判別倫理上允許和不允許的界限？即什么樣的基因編輯可以被允許或不被允許？(3)如果被允許的基因編輯所想要達(dá)到的目的可以通過諸如環(huán)境、后天的教育等達(dá)到同樣的效果，那么允許這些基因編輯行為是否還值得提倡和發(fā)展？

要充分客觀評(píng)價(jià)基因編輯技術(shù)并解決其帶來的負(fù)面問題，將技術(shù)不斷完善改進(jìn)的同時(shí)也要加強(qiáng)立法監(jiān)督管理。應(yīng)該摸著倫理底線的石頭過河，在生命倫理的框架中穩(wěn)步健全地對(duì)生命進(jìn)行無盡的探索，只有對(duì)個(gè)人和社會(huì)都有益時(shí)基因編輯技術(shù)才能大放異彩。在追求基因編輯技術(shù)進(jìn)步的同時(shí)，也要大力發(fā)展遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，提高轉(zhuǎn)化效率。如花粉管導(dǎo)入技術(shù)，其能夠與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，操作簡單，經(jīng)濟(jì)適用，是一種改變作物遺傳性、培育優(yōu)良品種的好方法，利用花粉管導(dǎo)入技術(shù)將玉米的基因?qū)胨局挟a(chǎn)生玉米稻，玉米稻是遠(yuǎn)緣雜交的結(jié)果，打破了生殖隔離，提高了抗性，實(shí)現(xiàn)了品種的高產(chǎn)。將基因編輯技術(shù)與花粉管導(dǎo)入技術(shù)相結(jié)合，或許可以達(dá)到良好的基因編輯效果。要保證多種優(yōu)良技術(shù)齊頭并進(jìn)的發(fā)展模式，為人類和環(huán)境的健康發(fā)展做出貢獻(xiàn)。