野生玫瑰多態(tài)性cpDNA和ITS引物的篩選與驗證

許建軍，馬 燕，吳其超，王寶盛，臧德奎

(黃河下游國家林業(yè)局林業(yè)重點實驗室，山東農(nóng)業(yè)大學 林學院，山東 泰安 271018)

玫瑰()為薔薇科(Rosaceae)著名的香料和觀賞植物，玫瑰的野生種群(野生玫瑰)是觀賞和食用玫瑰育種的重要種質(zhì)。野生玫瑰除了具有極高觀賞價值、經(jīng)濟價值以及重要的藥用價值，它還作為一種優(yōu)良的海岸防風固沙植物，對維持濱海生態(tài)環(huán)境具有重要意義，同時其獨特的分布模式對研究植物區(qū)系具有重要作用。但是這個極具研究和開發(fā)利用價值的物種，由于其濱海自然分布特點的適生環(huán)境受經(jīng)濟開發(fā)利用的嚴重影響，早在1992年野生玫瑰就被作為國家二級珍稀瀕危植物編入《中國植物紅皮書》。目前分布區(qū)域逐年縮小，呈現(xiàn)片段化，甚至部分區(qū)域已經(jīng)消失不見，急需得到保護。

葉綠體基因具有受到的選擇壓力小、單親遺傳、無重組等優(yōu)點，是研究譜系地理學的理想標記，在種內(nèi)和種間研究中應(yīng)用較多。核基因ITS具有雙親遺傳、引物通用性強、堿基變異速率快等優(yōu)點，作為對cpDNA的完善和補充，其在譜系地理學研究中的應(yīng)用也逐步增多。二者結(jié)合在個體和群體水平上對物種祖先群體的探討、生物冰期避難所及冰期后物種重新擴散等多個方面取得了重大發(fā)現(xiàn)。例如，利用葉綠體序列和核基因ITS序列聯(lián)合分析研究中國紅豆杉、文冠果、舟山新木姜子等植物的譜系地理。

近年來，國內(nèi)對于野生玫瑰的研究主要側(cè)重于栽培品種的開發(fā)應(yīng)用，對野生資源遺傳多樣性和保護利用逐漸涉及，然而針對野生玫瑰的譜系地理和系統(tǒng)發(fā)育的研究尚未開展。本研究以野生玫瑰8個種群的157個個體為試材，通過PCR擴增和PCR產(chǎn)物測序，從12對葉綠體基因組引物和4對核基因組ITS引物中篩選高多態(tài)性引物，分析了野生玫瑰種群的遺傳多樣性，并以此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對所篩選引物進行有效性驗證。為進一步研究瀕危植物野生玫瑰的譜系地理和系統(tǒng)發(fā)育奠定基礎(chǔ)，為該珍稀瀕危物種的種群恢復(fù)及保護利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究材料采自野生玫瑰自然分布區(qū)煙臺、威海、遼寧、吉林4個地區(qū)，采集生長良好、無病斑幼嫩葉片，用變色硅膠迅速脫水干燥，共8個野生種群的材料(表1)，帶回實驗室整理后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 野生玫瑰各種群的采樣信息

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測

采用改良的CTAB法(增加水浴時間至1h，調(diào)整氯仿異戊醇的抽提次數(shù))提取野生玫瑰全基因組DNA。用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，拍照查看DNA的質(zhì)量。同時用核酸蛋白檢測儀檢測DNA的濃度與純度，按照儀器使用說明進行。最后將原液DNA稀釋到40 ng·μL，放入冰箱-20 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增、測序及引物篩選

通過查閱文獻，將已經(jīng)發(fā)表的比較適合種內(nèi)水平的12對cpDNA引物(psbA-trnH、trnL-trnF、trnS-trnG、accD-psal、ndhF-rpl32、rpl20-rps12、atpF-atpH、rpl16、rbcl、psbJ-petA、psbD-trnT、trnV-trnW)(表2)和4對核基因ITS序列引物(ITS1、ITS2、ITS4、ITS5)(表2)交由擎科生物有限公司合成。用上述引物對24個DNA樣品進行擴增和測序，PCR反應(yīng)體系25 μL，包括1.1×T3 Super PCR MIX 22 μL、50 ng·μL模板DNA 1 μL、10 μmol·LForward Primer和10 μmol·LReverse Primer各1 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，退火10 s(退火溫度根據(jù)文獻確定)，72 ℃延伸(延伸時間根據(jù)10 kb·s計算)，35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，篩選出條帶清晰明亮、無雜帶、僅一條特異性擴增的PCR擴增產(chǎn)物，送到北京六合華大基因有限公司純化測序。

表2 cpDNA和ITS通用引物序列

將測序數(shù)據(jù)利用Chromas2.3軟件對所得堿基序列和原始峰圖進行查看、比對和人工校正，然后將處理好的測序數(shù)據(jù)導(dǎo)入DNAMan軟件中，通過序列對比，記錄包括堿基的插入、缺失、倒置和替換等變異位點。

分別求出每對引物序列對應(yīng)樣品的核苷酸多態(tài)性(Π)和核苷酸差異平均數(shù)(K)，以此來判斷所選引物是否具有高變異率。

1.2.3 遺傳多樣性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過Permut軟件獲得野生玫瑰總體遺傳多樣性(Ht)和種群內(nèi)平均遺傳多樣性(Hs)；將調(diào)整好的測序數(shù)據(jù)分別輸入到Notepad軟件處理保存成fasta文件，導(dǎo)入launch DNASP6軟件中，運行DNA Polymorphism程序獲得各種群的單倍型多態(tài)性Hd，即各種群的遺傳多樣性。

將處理好的測序數(shù)據(jù)保存為mega格式的文件，輸入MEGA7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。首先運行Select Taxa and Groups程序?qū)?57個擴增序列進行8個種群分組，然后運行Compute Net Between Group Mean Distances程序計算8個種群間的遺傳距離，最后利用Neighbor-Joining Tree程序進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，DNA條帶清晰無拖尾，點樣孔無亮條，說明未產(chǎn)生DNA降解和含有雜質(zhì)的現(xiàn)象；核酸蛋白檢測儀檢測結(jié)果表明，所提DNA濃度在1 542～3 880 ng·μL，/在1.7～1.9，/在1.8以上，均符合后續(xù)試驗條件。

2.2 PCR擴增及引物篩選

PCR擴增結(jié)果顯示，trnL-trnF、trnS-trnG、rpl20-rps12、rpl16、rbcl五對葉綠體引物和ITS1、ITS2兩對核基因引物條帶清晰、單一，可作為候選引物，其余7對葉綠體引物和2對核基因ITS引物擴增結(jié)果存在未出帶、非特異性擴增的現(xiàn)象，不符合實驗要求。測序數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，trnS-trnG引物序列和ITS2引物擴增產(chǎn)物序列中存在大量套峰；在通過DNAMAN軟件序列比對后，發(fā)現(xiàn)rpl16引物擴增產(chǎn)物序列中無變異位點，不具有多態(tài)性；trnL-trnF、rpl20-rps12、rbcl、ITS1四對引物擴增產(chǎn)物序列中具有不同程度的變異位點(表3)，有較高的多態(tài)性，能夠進行野生玫瑰遺傳分化和譜系地理的研究。

表3 四對篩選序列在野生玫瑰群體中的變異位點分布

根據(jù)launch DNASP6軟件DNA Polymorphism程序?qū)С龅暮塑账岫鄳B(tài)性(Π)、核苷酸差異平均數(shù)(K)，繪制柱狀圖(圖1)進行比較。發(fā)現(xiàn)篩選出的3對變異豐富的cpDNA引物，按照擴增產(chǎn)物核苷酸多態(tài)性(Π)值由高到低依次為rpl20-rps12、trnL-trnF、rbcl；按照擴增產(chǎn)物核苷酸差異平均數(shù)(K)值高低依次為rpl20-rps12、rbcl、trnL-trnF。ITS1引物擴增產(chǎn)物核苷酸多態(tài)性(Π)值為0.17，核苷酸差異平均數(shù)(K)值為0.43。

圖1 四對野生玫瑰引物擴增產(chǎn)物的Π值和K值

2.3 遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用Dna SPv6軟件計算得到野生玫瑰整體遺傳多樣型較低，Ht=0.435，種群內(nèi)平均遺傳多樣性(Hs)為0.343。單倍型多態(tài)性(Hd)數(shù)值范圍結(jié)果所示：成山鎮(zhèn)(CSZ)種群多態(tài)性最高，遺傳多樣性最高；吉林九沙坪(JSP)、煙臺牟平高爾夫(GEF)、酒館村(JGC)、石城島(SCD)、威海大偉廣場(DWGC)種群遺傳多樣性次之，吉林沙丘公園(SQGY)、遼寧莊河花園口(HYK)多態(tài)性最低，種群遺傳多樣性最低。

在0.177～0.733。各種群的單倍型多態(tài)性如圖2

圖2 八個種群內(nèi)的單倍型多態(tài)性

基于3對葉綠體引物trnL-trnF、rpl20-rps12、rbcl擴增測序聯(lián)合分析的結(jié)果，利用8個種群間的遺傳距離構(gòu)建野生玫瑰系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示：野生玫瑰8個種群明顯分為2大支，吉林沙丘公園(SQGY)種群、九沙坪(JSP)種群為一支；遼寧莊河花園口(HYK)種群、石城島(SCD)種群、煙臺牟平高爾夫(GEF)、酒館村(JGC)、威海大偉廣場(DWGC)、成山鎮(zhèn)(CSZ)6個種群為另外一支。

橫線上方數(shù)字代表遺傳距離。

3 討論與結(jié)論

實驗表明，在已發(fā)表的葉綠體DNA通用引物中，較少的引物適用于野生玫瑰譜系地理研究，這可能與物種的不同有關(guān)。有待獲得充足的野生玫瑰葉綠體基因組數(shù)據(jù)，尋找高多態(tài)性的片段，自主設(shè)計引物序列，更全面地用于野生玫瑰系統(tǒng)發(fā)育和譜系地理的研究。ITS(internal transcribed spacer)由內(nèi)間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)1、5.8S以及內(nèi)間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)2序列片段組成，總長度在660 bp左右，我們在野生玫瑰引物篩選實驗的測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，ITS1序列片段存在堿基突變與多態(tài)性位點，5.8S基因具有高度的保守性，序列沒有差異變化，而ITS2序列片段存在大量的堿基重復(fù)與高級結(jié)構(gòu)，無法進行正常的序列堿基讀取，最終選取ITS1(長度在285 bp)作為核基因引物序列，適合研究野生玫瑰的譜系地理。

實驗發(fā)現(xiàn)，野生玫瑰的種群變異率較低，意味著種群遺傳多樣性較低，這可能與葉綠體基因組自身進化速率以及變異率相對較低而導(dǎo)致遺傳多樣性較低；同時野生玫瑰成熟果實的種子在經(jīng)過鳥類吞食消化以及長時間、長距離的飛行，即使能夠傳播也很難存活并生長成植株，加上有性生殖能力差的繁殖特點使得遠距離種群間基因交流變得困難，造成種群遺傳分化程度升高，遺傳多樣性降低；另外與野生玫瑰分布區(qū)域范圍狹窄，相對集中，且呈片段化的分布特點有關(guān)，種群經(jīng)過長時間的遺傳漂變造成等位基因丟失，遺傳多樣性不斷降低。

基于遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果來看，8個野生玫瑰種群明顯分為2支，種群間的親緣關(guān)系與其地理位置的遠近相關(guān)，地理距離較近的種群通常聚為一支，如煙臺酒館村(JGC)種群、高爾夫(GEF)種群、威海大偉廣場(DWGC)種群以及成山鎮(zhèn) (CSZ)種群地理距離較近，顯示其親緣關(guān)系較近；吉林琿春九沙坪(JSP)種群、吉林沙丘公園(SQGY)種群和煙臺、威海種群地理距離較遠，限制了種子的傳播，阻斷了基因流，沒有聚為一支，其親緣關(guān)系較遠。對于遼寧莊河市花園口(HYK)種群、石城島(SCD)種群和煙臺威海種群聚在一支的情況，馮立國等根據(jù)實驗結(jié)果推測野生玫瑰起源于山東東部沿海，后向北發(fā)展演化形成遼寧南部種群；Jiang等通過保守DNA衍生多態(tài)性(CDDP)分子標記實驗研究不同種源的野生玫瑰遺傳分化，聚類分析將遼寧種群與煙臺威海種群聚在一起，均與本實驗得出的結(jié)論一致。同時在歷史上遼東半島與山東半島同屬膠遼古大陸，植物屬于同一區(qū)系，在后來的燕山事件和地殼運動影響下，現(xiàn)今的渤海陸地開始下沉，海水進入，遼東半島和山東半島才逐漸分開，另外由于物種的演化和變異是一個久遠漫長的過程，種群之間基因變異較小，故親緣關(guān)系較近。

本研究共篩選出3對多態(tài)性較好的cpDNA引物(trnL-trnF、rpl20-rps12、rbcl)和1對核基因ITS引物(ITS1)，適用于研究野生玫瑰種內(nèi)的遺傳分化、系統(tǒng)發(fā)育和譜系地理結(jié)構(gòu)，能夠進一步探究瀕危物種野生玫瑰的譜系地理。