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    金銀花綠原酸磷脂復合物制備及其透皮性能研究

    2022-05-30 07:47:28曾川何源芳劉佳偉王琪王領
    中國化妝品 2022年10期
    關鍵詞:綠原酸

    曾川 何源芳 劉佳偉 王琪 王領

    金銀花中綠原酸為天然多酚類物質,具有極強的抗氧化活性,能抵御紫外線對人體皮膚的傷害,保護膠原蛋白免受自由基攻擊,具有較高的美容開發(fā)價值,但由于綠原酸的脂溶性差,不易透過人體角質層,極大地限制了其應用。為更好的利用金銀花,發(fā)掘金銀花綠原酸的新功效及其靶點,為金銀花綠原酸的護膚美容提供理論支持和現(xiàn)代科學依據(jù)。本研究以無水乙醇為溶劑,利用超聲提取法制備金銀花綠原酸磷脂復合物,使用離體小鼠皮膚模擬人體皮膚,在 Franz 擴散池進行體外透皮吸收實驗,分別測定吸收池溶液的綠原酸含量及綠原酸磷脂復合物含量,比較分析透皮吸收率。結果顯示,0-10h 綠原酸溶液體外透皮吸收率大于該復合物,而10h 之后透皮率則明顯小于該復合物,表明綠原酸磷脂復合物可以提高綠原酸的生物利用率,為綠原酸后續(xù)研究及開發(fā)利用提供了新的方向。

    關鍵詞:綠原酸;磷脂復合物;體外透皮吸收

    金銀花(honeysuckle) 又名忍冬花,屬忍冬科植物,為干燥花蕾或帶初開的花,是中國傳統(tǒng)的藥用品種,最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。金銀花富含揮發(fā)油、萜類、環(huán)烯醚萜苷類、三萜皂苷類、黃酮類、有機酸類、無機元素等多種化學成分[1],具有較高的藥用價值。近代對于金銀花化學成分的研究以綠原酸為主,綠原酸是金銀花中典型的抗氧化功效成分,有著很強的藥理活性[2]。藥理學研究表明,綠原酸具有抑制葡萄糖-6-磷酸酶活性、降血脂、改善血液流動情況、免疫調(diào)節(jié)、抗病菌病毒、抗炎等功效[3-6]。在皮膚美容功效方面,綠原酸的活性羥基可以形成具有抗氧化作用的氫自由基,可保護膠原蛋白不受活性氧等自由基傷害,有效防止紫外線對人體皮膚產(chǎn)生的傷害[7,8],還能抑制酪氨酸酶和過氧化氫酶活性來清除細胞中的活性氧[9],羅磊等人發(fā)現(xiàn),綠原酸對于 DPPH 有較高的抑制率,抗氧化能力是抗壞血酸近3倍[10-11]。

    綠原酸屬于多酚類化合物,脂溶性較差,不易透過皮膚角質層或滯留于皮膚表面難以發(fā)揮其功效,因此大大影響了綠原酸在化妝品中的實際應用,如果采用脂質體技術將其包埋,將更有利于其透皮吸收而發(fā)揮功效。脂質體是藥劑學中的一類常規(guī)釋藥系統(tǒng),常常用作為難溶性藥物的給藥劑型,來提高其生物利用率。區(qū)別于傳統(tǒng)脂質體,復合磷脂脂質體是通過與磷脂雙分子層進行排列作為外相來形成球型藥物載體,包裹著作為內(nèi)相的活性成分藥物,具有更好穩(wěn)定性,克服了傳統(tǒng)脂質體包合率低和藥量偏低的問題,更有效的提高活性成分的吸收與利用程度[12-13]。

    根據(jù)范明輝等[14]人的研究,在脂質體的制備中,膽固醇對脂質體的物化性質影響不大,所以在本次實驗中采用了磷脂復合的制備工藝,使用大豆卵磷脂對綠原酸進行包裹,參考趙安權等[15]人的實驗方法,采用超聲提取的方式進行復合物的制備并利用復合物極易溶于三氯甲烷,而綠原酸不溶于三氯甲烷的特性,將復合物分離。同時,本實驗采用了正交試驗方法,確定復合率較高的工藝,通過該工藝制備的綠原酸磷脂復合物再經(jīng)過 Franz 擴散池的體外透皮吸收實驗來進行研究,以期提高生物利用率。

    1 實驗材料與儀器

    1.1 實驗材料

    綠原酸(分析純),西安首禾生物科技有限公司;無水乙醇,天津大貿(mào)化學試劑廠;大豆卵磷脂,日本富士和光株式會社;小鼠,山東中醫(yī)藥大學;三氯甲烷(分析純),天津市科密歐化學試劑有限公司;生理鹽水(注射級) 上海長征富民藥業(yè)有限公司。

    1.2儀器

    SK5200H 高頻超聲波清洗儀,上??茖С晝x器有限公司; SHZ- DIII 循環(huán)水式多用真空泵,?;ゼ褍x器設備有限公司;Franz 擴散池,上海玉研科學儀器有限公司;佑科 UV1810S 紫外可見分光光度計,上海精學科學儀器有限公司;上海亞榮 RE-5220旋轉蒸發(fā)器,上海壘固儀器有限公司;德國 IKA 艾卡 EUROSTAR 20頂置式攪拌器,艾卡(廣州)儀器設備有限公司;DHP-9082BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;德國 IKA 艾卡 T25/T18 digital 數(shù)顯分散機,艾卡(廣州)儀器設備有限公司;AB265-S/FACT 型電子天平,上海梅特勒托利多儀器有限公司;上海盧湘儀 TG16-WS 臺式高速離心機,上海坤權生物科技有限公司。

    0 2 實驗方法

    2.1 綠原酸磷脂復合物制備

    將一定量的大豆卵磷脂溶于300mL 無水乙醇之中,常溫攪拌1h,v=450r/min。攪拌溶解之后用濾餅抽濾除去不溶物,收集濾液放入燒杯備用。燒杯中加入1.0g 綠原酸,超聲提取后得到綠原酸、大豆卵磷脂和綠原酸磷脂復合物混合物。將所得溶液加入圓底燒瓶進行減壓旋蒸,除去全部乙醇。加入三氯甲烷溶解混合物,反復洗滌三次用濾紙過濾除去綠原酸。再次減壓濃縮除去溶劑,放入恒溫箱中繼續(xù)揮發(fā)剩余三氯甲烷即得綠原酸磷脂復合物。

    2.2標準曲線測定

    精密稱量綠原酸0.0150g,加入無水乙醇溶解后轉移至250mL 容量瓶中,并加入無水乙醇定容至刻度線,搖晃均勻得到0.06mg/mL 綠原酸溶液。分別精密取出綠原酸溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 加入25mL 量筒中,加入無水乙醇至20mL 刻度線后搖晃均勻,分別得到濃度為0.003mg/mL、0.006mg/mL 、0.009mg/mL、0.012mg/ mL、0.015mg/mL 綠原酸溶液。分別于330nm 處測量吸光度,以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標進行線性回歸,作得標準曲線。

    2.3復合率計算

    精密稱量實驗所得復合物0.1000g,加入50mL 乙醇溶解,以250mL 容量瓶定容,震蕩均勻后精密量取1.00mL 加入燒杯中,再加入50mL 去離子水進行充分均質,均質條件為8000r/min,t=10min,吸取溶液3mL 進行離心,離心條件為4000r/min,t=30min,強制分離綠原酸和卵磷脂。后取下清液于330nm 處測量吸光度,帶入標準曲線計算即得復合率。

    2.4單因素考察

    2.4.1反應物質量濃度的影響

    以無水乙醇為反應溶劑、綠原酸與磷脂投料比為1∶1、反應溫度20℃、反應時間2h,使用4.0、6.0、8.0、10mg/ mL 的綠原酸乳液進行磷脂復合物制備,得到不同綠原酸濃度下的復合率,考察綠原酸濃度對復合率的影響。

    2.4.2投料比的影響

    以無水乙醇為反應溶劑、反應溫度20℃、反應時間2h、綠原酸8mg/mL,使用投料比為1∶0.8、1∶1、1∶2、1∶3的綠原酸與磷脂進行磷脂復合物制備,得到不同投料比下的復合率,考察綠原酸與磷脂的投料比對復合率的影響。

    2.4.3反應時間的影響

    以無水乙醇為反應溶劑、綠原酸與磷脂投料比為1∶1、反應溫度20℃、綠原酸8mg/mL,反應1、1.5、2、3 h 后,得到不同反應時間下的復合率,考察反應時間對復合率的影響。

    2.4.4反應溫度的影響

    以無水乙醇為反應溶劑、綠原酸與磷脂投料比為1∶1、反應時間2h、綠原酸8mg/mL,在20、30、40、50℃時進行磷脂復合物制備,得到不同反應溫度下的復合率,考察反應溫度對復合率的影響。

    2.5正交試驗

    根據(jù)單因素考察的實驗結果以反應物的質量濃度(A)、投料比(B)、反應時間(C)和反應溫度(D)為影響因素。以復合率為指標,每個因素取3個水平,采用 L9(34)表進行正交試驗進一步優(yōu)化這4個因素的最佳水平。

    2.6皮膚樣品處理

    用脫毛膏脫去小鼠腹部毛發(fā)后,脫頸致死,快速剝離腹部皮膚,取適宜大小鼠皮,小心剔除皮下脂肪,以生理鹽水反復浸泡沖洗至干凈無粘連物,并用濾紙吸干小鼠皮膚表面的生理鹽水,將清洗之后的小鼠皮膚切成1cm×1cm 小片,浸泡于生理鹽水中并放置于冰箱備用。

    2.7體外透皮吸收實驗

    分別以無水乙醇配置濃度為0.1mg/mL 綠原酸溶液和磷脂復合物(以綠原酸計) 溶液備用。樣品池注水并排除氣泡,調(diào)整實驗條件,保持接收池內(nèi)溫度為37.0℃。擴散池注滿生理鹽水,設置磁子攪拌轉速為200r/min。取兩塊小鼠皮分別固定于樣品池與接收池之間,角質層面向樣品池。對照組加入綠原酸溶液,實驗組加入復合物溶液,分別于0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、10h、20h、24h 吸取反應溶液1mL,后用生理鹽水補足至刻度線。將吸取溶液稀釋5倍后測量吸光度。按照下式計算透過率。

    (μg ·mL-1);Ci 為第i (i≤ n -1)個取樣點測得的藥物質

    量濃度(μg ·mL-1);A 為擴散池的有效透皮滲透面積;V 為接收液體積;Vi 為取樣體積。

    3 結果與討論

    3.1標準曲線

    以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標進行線性回歸后,得到回歸線性方程 y=62.83x+0.0009(R2=0.9991),結果顯示,綠原酸0.003~0.015mg/mL 與吸光度呈良好線性關系。

    3.2復合率

    3.2.1綠原酸濃度對復合率的影響

    綠原酸為4.0、6.0、8.0、10mg/mL 時,復合率分別為73.8%、79.3%、86.2%、82%( n=3),復合率隨著綠原酸濃度的增加而提高,但當綠原酸濃度大于8mg/mL 時,隨著綠原酸濃度的增加,復合率卻有所下降,因此綠原酸濃度不宜過高。

    3.2.2綠原酸與磷脂的投料比對復合率的影響

    綠原酸與磷脂的投料比為1:0.8、1:1、1:2、1:3時的復合率分別為71.3%、86.4%、74.8%、73%( n =3);在投藥比為1∶1時,復合率達到最高。

    3.2.3反應時間的影響

    反應1、1.5、2、3 h 后,復合率分別為77%、81.1%、85%、85.8%( n =3)。隨反應時間的延長,復合率提高,但是在2h 后復合率的提高并不明顯。

    3.2.4反應溫度對復合率的影響

    20、30、40、50℃時綠原酸與磷脂的復合率分別為87.5%、86.4%、83.5%、78.5%( n =3),隨著反應溫度的升高,復合率逐漸下降,可能是由于綠原酸對熱不穩(wěn)定。

    3.3正交試驗

    根據(jù)極差分析可知,表明各因素對綜合指標影響大小為 B > D >A > C,即投料比影響最大,其次是反應溫度,再次是反應物質量濃度,最后是反應時間。以 A3B1C2D1為最佳,最終確定工藝為綠原酸和磷脂投料比為1:1,反應溫度為20℃,反應時間為2h,反應物質量濃度為8mg/mL。

    采用最佳工藝進行驗證試驗,重復3次,結果見表3。驗證試驗與正交試驗的結果一致,所得復合物的復合率不低于84.5%,說明此優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行。

    3.4體外透皮吸收

    實驗數(shù)據(jù)顯示,大約在10h 之前,綠原酸磷脂復合物的透皮率低于綠原酸溶液的透皮率,而在10h 之后綠原酸的透皮率則顯著小于其復合物。這可能是由于綠原酸的分子量較小,而復合物的分子量較大,而且和皮膚親和力較好,所以減緩了復合物的釋放,因此前期綠原酸溶液透皮率更高。而10h 之后,復合物透過速率明顯高于綠原酸溶液,可能是因為皮膚開始釋放復合物,故速率增大。同時,隨著時間的增長,綠原酸溶液的透過速率有所減慢,可能是小鼠皮對于綠原酸的吸收方式主要通過滲透壓進行,隨著壓差的降低,透過速率減慢,而透過速率減慢導致滲透的溶液比用來測量時吸取的溶液少,所以20h 后體外透皮吸收濃度下降。

    鑒于綠原酸溶液與綠原酸磷脂復合物在透皮吸收時間上的差異性,在護膚品領域應用中,可充分利用時間差異性對配方進行調(diào)整,采用合適的添加比例,最大程度的發(fā)揮綠原酸溶液和綠原酸磷脂復合物在抗菌抗氧化、清除自由基、抗衰老方面的協(xié)同作用。

    4 結論

    本實驗采用超聲提取的方式制備了綠原酸和卵磷得到了復合率較高的磷脂復合制備工藝,再經(jīng)過體外透皮吸收實驗進行研究。研究結果表明,0~10h 綠原酸溶液體外透皮吸收率大于該復合物,而10h 之后透皮率則明顯小于該復合物,綠原酸的脂溶性得到了顯著提高。以磷脂復合物為載體能增強綠原酸的透皮率,可以提高綠原酸的生物利用度,為綠原酸進一步的開發(fā)利用提供了更多的可能性。

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