蜘蛛香中綠原酸及總酚酸的含量測(cè)定

劉開(kāi)萍+楊軍+羅喜榮+趙開(kāi)坤+尹航+劉興賦

摘要：試驗(yàn)建立了蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）中綠原酸和總酚酸的含量測(cè)定方法。利用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定蜘蛛香中綠原酸的含量，色譜柱為Dikma C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液（12∶88），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，柱溫30 ℃；以綠原酸為對(duì)照品，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV）在327 nm波長(zhǎng)處測(cè)定蜘蛛香中總酚酸的含量。結(jié)果表明，綠原酸在2～20 μg/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好，r=0.999 6，加樣回收率為97.95%，RSD為1.37%；總酚酸在5～20 μg/mL范圍內(nèi)濃度與吸光度線性關(guān)系良好，r=0.999 8，加樣回收率為100.31%，RSD為1.34%。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于蜘蛛香中綠原酸和總酚酸的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）；綠原酸；總酚酸

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949.781.4+7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）02-0288-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.02.021

蜘蛛香又名馬蹄香、老虎七、心葉纈草等，系敗醬科（Valerianaceae）纈草屬（Valeriana L.）植物蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）的干燥根莖及根，在中醫(yī)里具有理氣止痛、消食止瀉、祛風(fēng)除濕、鎮(zhèn)靜安神等功效，主治脘腹脹痛、食積不化、腹瀉痢疾、風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、失眠等癥，主要含有揮發(fā)油、纈草三酯類(lèi)、黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)等成分[1-8]。蜘蛛香藥材的質(zhì)量控制目前尚不完善，為此，試驗(yàn)分別采用高效液相色譜法（HPLC）和紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV），首次測(cè)定了蜘蛛香植株中綠原酸及總酚酸的含量，旨在為蜘蛛香藥材資源的合理開(kāi)發(fā)利用以及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 蜘蛛香植株分別采自貴州省貴陽(yáng)市、江口縣、松桃苗族自治縣、岑鞏縣、石阡縣，自然陰干后，粉碎過(guò)60目篩，備用。綠原酸對(duì)照品來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110753-201314；乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 主要有Agilent 1100 DAD高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；UV-1750紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；EL204電子天平（梅特勒-托利儀器上海有限公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）。

1.2 溶液的配制

1.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取適量綠原酸對(duì)照品，用50%甲醇配成200 μg/mL的貯備液。分別取不同體積的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液于10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 供試品溶液 準(zhǔn)確稱(chēng)取各地0.5 g蜘蛛香樣品，用石油醚回流脫脂至提取液無(wú)色，殘?jiān)鼡]干石油醚后置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱(chēng)定質(zhì)量；超聲提取40 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量；過(guò)濾，取續(xù)濾液0.2 mL，加50%甲醇稀釋、定容至10 mL，即得。

1.3 綠原酸的測(cè)定

色譜柱為Dikma C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液（12∶88），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積定性、定量測(cè)定樣品中的綠原酸含量。

1.4 總酚酸的測(cè)定

以50%甲醇作空白，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的吸光度，繪制工作曲線，以相同條件測(cè)定樣品液的吸光度，計(jì)算樣品中的總酚酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸測(cè)定

2.1.1 色譜分析 綠原酸對(duì)照品和供試品色譜結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，在上述色譜條件下，綠原酸可有效分離，峰型對(duì)稱(chēng)，無(wú)雜峰干擾。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密移取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液 0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，按上述色譜條件依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸擬合，得回歸方程y=9.513 4x-0.380 5，r=0.999 6，表明綠原酸在2～20 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得綠原酸峰面積RSD為0.92%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得綠原酸峰面積RSD為1.43%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（貴陽(yáng)市樣品）蜘蛛香樣品6份，先按上述方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)得綠原酸平均含量為20.53 mg/g，RSD為1.26%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知綠原酸含量的蜘蛛香樣品6份，準(zhǔn)確加入等量的對(duì)照品，按上述方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果平均回收率為97.95%，RSD為1.37%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 總酚酸測(cè)定

2.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2表明，對(duì)照品溶液及供試品溶液均在327 nm處有最大吸收，故選擇總酚酸測(cè)定波長(zhǎng)為327 nm。

2.2.2 工作曲線 精密移取總酚酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液 0.25、0.40、0.55、0.70、0.85、1.00 mL分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，在327 nm處測(cè)定吸光度。以總酚酸濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=41.867x-0.020 8，r=0.999 8，表明在5～20 μg/mL范圍內(nèi)總酚酸濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液在327 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果RSD為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h在327 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為1.04%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（貴陽(yáng)市樣品）蜘蛛香樣品6份，按上述方法制備供試品溶液，在327 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)得總酚酸平均含量為37.12 mg/g，RSD為1.15%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知總酚酸含量的蜘蛛香樣品6份，準(zhǔn)確加入等量的對(duì)照品，按上述方法制備供試品溶液，在327 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果平均回收率為100.31%，RSD為1.34%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地的蜘蛛香樣品，按上述方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中的綠原酸含量；在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的327 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中的總酚酸含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

蜘蛛香是惟一被2015年版《中國(guó)藥典》收錄的纈草類(lèi)生藥，是一味中醫(yī)臨床長(zhǎng)期應(yīng)用療效較好的中藥，具有抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)、保肝、抗氧化、抗菌、抗病毒等藥理作用[9]。試驗(yàn)建立了蜘蛛香中綠原酸及總酚酸含量的檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)單、快捷、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠，可用于蜘蛛香藥材的質(zhì)量控制及定量分析，為蜘蛛香藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升打下了基礎(chǔ)。

綠原酸廣泛分布于植物中，但含量較高的植物不多。試驗(yàn)測(cè)定了黔產(chǎn)蜘蛛香中綠原酸及總酚酸的含量。結(jié)果表明，酚酸類(lèi)化合物是蜘蛛香中含量較高的一類(lèi)物質(zhì)，是其發(fā)揮臨床療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有較高的研究和開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.368-369.

[2] 楊 軍，龍慶德，羅喜榮，等.超臨界二氧化碳萃取蜘蛛香油工藝的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（1）：157-158.

[3] 田弋夫，龍慶德，羅喜榮，等.蜘蛛香油化學(xué)成分的氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（4）：924-926.

[4] 羅喜榮，羅 俊，楊 軍，等.蜘蛛香不同部位中總纈草三酯含量測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（16）：8884，9106.

[5] 羅喜榮，苑天紅，楊 軍，等.超臨界CO2萃取蜘蛛香中總纈草三酯的工藝研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（16）：119-121.

[6] 羅喜榮，苑天紅，楊 軍，等.超臨界CO2萃取蜘蛛香中纈草素工藝優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（8）：1901-1902，1912.

[7] 李 蓉，李小平，吳 瑩.紫外分光光度法測(cè)定蜘蛛香中總黃酮的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10（12）：149-150.

[8] 傅 亮，楚清脆，黃寶康，等.毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定蜘蛛香中多元酚類(lèi)化合物[J].分析化學(xué)，2005，33（2）：161-164.

[9] 陳 暢，李韶菁，唐仕歡，等.蜘蛛香藥理研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37（14）：2174-2177.