黔產(chǎn)大菟絲子中綠原酸的定性與定量分析

馮華+石尚友+羅秀瓊+王世俊+鄭凰雅+王祥培

【摘要】目的：對黔產(chǎn)大菟絲子中綠原酸進(jìn)行定性與定量分析。方法：采用TLC色譜法，以綠原酸為對照，建立定性鑒別方法；采用HPLC色譜法，建立其含量測定方法。結(jié)果：TLC法能很好分離各成分；高效液相色譜法綠原酸在00102～01142mg范圍內(nèi)與峰面積響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系（r=09998），平均加樣回收率為 990%。結(jié)論：本法簡便可行，重復(fù)性好，為評價大菟絲子質(zhì)量提供實驗依據(jù)，可用于大菟絲子藥材的有效鑒別。

【關(guān)鍵詞】黔產(chǎn)大菟絲子；綠原酸；定性與定量

【中圖分類號】R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）05-0014-03

大菟絲子為旋花科植物大菟絲子（Cuscuta Japonica Choisy）的干燥成熟種子，收載于2003版貴州省《中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[2]。本品為少數(shù)民族藥材，性辛、甘、平，具有滋補(bǔ)肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉功效，臨床用于腎虛腰痛、陽痿遺精、目昏耳鳴、胎動不安、尿頻等。大菟絲子藥材中含新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、3，4-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸等有機(jī)酸類成分[3]，其中綠原酸具有抗病毒、保肝利膽作用。筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，目前尚無對大菟絲子中綠原酸薄層鑒別和HPLC法含量測定方法的報道，筆者對大菟絲子中綠原酸薄層和含量測定進(jìn)行研究，建立了綠原酸的薄層鑒別與含量測定方法，為大菟絲子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和控制提供參考。

1儀器與材料

11儀器Agilent LC-1260高效液相色譜議（包括四元泵，DAD，柱溫箱，自動進(jìn)樣器，工作站）；AB204-S型梅特勒電子天平；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

12材料綠原酸對照品（批號：110753-20314，中國食品藥品檢定研究院）。聚酰胺薄膜（購于青島海洋化工有限公司），乙睛為色譜純，水為純凈水，其它試劑均為分析純。

大菟絲子采集于貴州省各地區(qū)，經(jīng)遵義市食品藥品檢驗所鄧順超副主任中藥師鑒定為旋花科植物大菟絲子的干燥成熟種子，樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

21薄層鑒別[1]取本品粉末約10g，置具塞量瓶中，加甲醇10mL，超聲30min，濾過，濾液水浴上濃縮約1mL，作為供試品溶液。另取綠原酸對照品，加甲醇溶液制成每1mL含01mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部附錄）試驗，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點于同一聚酰胺薄膜板上，以甲醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。結(jié)果表明，分離度好，斑點顯色清晰，陰性無干擾，見圖1。

22綠原酸的含量測定[3]

221色譜條件[2-3]色譜柱：Eclipse XDB-C18（5μm，46mm×250mm）；流動相：乙睛-01%磷酸溶液（12∶88），流速為：10mL/min，柱溫30℃，檢測波長為325nm。進(jìn)樣量10μL，分離度為24，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計，應(yīng)不低于3500，色譜圖見圖2、圖3。

222對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品1060mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，精密吸取2mL置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

223供試品溶液制備精密稱取大菟絲子藥材粉末（過二號篩）約10g，置具塞瓶中，加甲醇25mL，稱定重量，超聲50min，放置至室溫，用甲醇補(bǔ)足重量，過濾，取續(xù)濾液，即得。

224檢測波長確定照紫外-可見分光光度法，在200～400nm的波長范圍內(nèi)對對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照品溶液進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，綠原酸和樣品在325nm波長處有最大吸收，因此選擇檢測波長為325nm。

225線性關(guān)系的考察分別配制6個不同濃度綠原酸對照品溶液，濃度分別為00102、00204、00408、00816、00979、01142mg/mL，進(jìn)樣量為10μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，以綠原酸濃度（mg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，計算綠原酸回歸方程為：Y=68654X+00560（r=09998）。結(jié)果表明，在00102～01142mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

226精密度試驗精密吸對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀中，測定6份，平均峰面積657836，RSD=04%，表明儀器精密度良好。

227穩(wěn)定性試驗取同一批藥材粉末約10g，精密稱定，按供試品溶液項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀中，分別在0、2、4、8、12h測定一次，平均峰面積為682360，RSD為08%，表面供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

228重復(fù)性試驗取同一批藥材粉末約10g6份，精密稱定，照“223”項下制備方法制備成供試品溶液。進(jìn)樣10μL，平均含量為012%，RSD為11%，表明重復(fù)性良好。

229加樣回收試驗稱取已測定S1號樣品粉末5份（含量為012%），每份約05g，精密稱定，加入綠原酸對照品濃度為030mg/mL溶液2mL，按“223”項下的方法制備供試品溶液，在“221”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算綠原酸平均回收率為990%，RSD為06%，結(jié)果見表2。

2210含量測定分別測定大菟絲子藥材不同產(chǎn)地樣品，測定其含量，計算結(jié)果見表3，圖譜見圖4。

3討論

31綠原酸的TLC鑒別采用乙醇、甲醇溶劑提取后，乙醇提取溶液的斑點分離效果不佳，甲醇提取的各斑點能有效分離。按正文方法操作，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。結(jié)果表明，分離度好，斑點顯色清晰。以甲醇-冰醋酸-水不同比例為展開劑，在聚酰胺薄膜上展開，經(jīng)過不同比例調(diào)整。以甲醇—冰醋酸-水（4∶1∶5）溶液為展開劑，在聚酰胺薄膜上展開，斑點清晰，分離完全，。所以選擇聚酰胺薄膜板，甲醇—冰醋酸-水（4∶1∶5）溶液為展開劑。

32綠原酸提取條件的優(yōu)選選用甲醇、80%甲醇、50%甲醇作為提取溶劑，超聲、回流提取時間為40、50、60min?；亓髋c超聲提取綠原酸含量沒有差異，選擇甲醇25mL超聲50min，藥材中綠原酸提取完全，選用甲醇為溶劑比較好；對色譜條件進(jìn)行選擇，以乙睛-01%磷酸溶液（12∶88），流速為10mL/min；柱溫30℃；檢測波長為325nm，各組分峰達(dá)到完全分離。

綜上，本法簡便、快速，準(zhǔn)確度高，可用于大菟絲子的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：57.

[2]貴州省食品藥品監(jiān)督管理局編.《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[S].貴陽：貴州科技出版社，2003：39.

[3]瞿燕，李瓊， 魏文龍，等.大菟絲子生品和鹽炙品HPLC-UV特征圖譜及7個有機(jī)酸含量變化研究[J].藥物分析，2014，34（5）：824-829.