RP—HPLC測定桑葉中綠原酸的含量

郭紅霞等

[摘要] 目的 建立反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定桑葉中活性成分綠原酸的方法。 方法 采用Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 ？滋m）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-1.0%醋酸水溶液，采用梯度洗脫，檢測波長為325 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積10 μl。 結(jié)果 綠原酸的線性范圍為0.3890～7.771 ？滋g（r=0.9994），平均回收率為98.91%。 結(jié)論 RP-HPLC檢測效率高，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可用于桑葉中綠原酸的定量測定，可作為該藥材的質(zhì)量控制方法之一。

[關(guān)鍵詞] 桑葉；綠原酸；質(zhì)量控制；反相高效液相色譜法

[中圖分類號] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）02（a）-0017-03

桑葉為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的葉，初露后采收，除去雜質(zhì)，曬干，具有疏散風(fēng)熱，清肺潤燥，清肝明目之功效。主要用于風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭昏頭痛，目赤昏花[1]。現(xiàn)代藥理研究表明桑葉具有降血糖、降血壓、降血脂、抗炎、抗衰老、抗腫瘤等功效[2-4]。對桑葉的質(zhì)量控制研究大部分圍繞中桑葉中的活性成分蘆丁來進(jìn)行相應(yīng)的含量測定[5-6]，也有的圍繞黃酮類成分進(jìn)行相應(yīng)質(zhì)量控制研究[7]。目前，國內(nèi)外市場對桑葉的需求愈來愈大，且本課題組在前期指紋圖譜研究中發(fā)現(xiàn)綠原酸也是桑葉中的主要活性成分之一[8]，因此為了進(jìn)一步控制桑葉質(zhì)量，本研究采用反相高效液相色譜法（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）對從全國收集的桑葉藥材進(jìn)行綠原酸含量測定研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

KQ-100B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；BPZ11D型電子分析天平（Sartorius公司）；Waters2695-2996高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站，含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器（Waters 公司）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純，TEDIA公司），乙腈（色譜純，TEDIA公司），水為哇哈哈純凈水，冰乙酸（色譜純，北京化工廠）。

1.3 對照品及樣品

對照品綠原酸購于中國藥品生物制品檢定所（供含量測定用，批號110753-200413），不同產(chǎn)地的桑葉藥材，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室潘清平教授鑒定為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 ？滋m）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：325 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10 μl；流動(dòng)相：乙腈（A）-1.0%醋酸水（B）梯度洗脫，洗脫程序：0→20 min，9%A→18%A。按照上述色譜條件，待測成分綠原酸分離很好，無干擾，得色譜圖1。

2.2 供試品制備

取桑葉粉（80目）約1 g置50 ml三角瓶，精密稱定，加甲醇20 ml，稱重，超聲30 min（功率250 W，頻率40 kHz），取出，靜置，放涼，補(bǔ)重，0.22 μm微孔濾膜濾過，RP-HPLC分析。

2.3 對照品制備

精密稱取綠原酸對照品適量，用甲醇溶解，定容，得到濃度為0.3890 ？滋g/？滋l的對照品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下的綠原酸對照品溶液1、3、5、8、10、15、20 ？滋l進(jìn)樣分析，記錄按上述色譜條件測定的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣體積（？滋l）為橫坐標(biāo)（X），得綠原酸的線性回歸方程分別為：Y=182 283X-131 274（r=0.9994，0.3890～7.771 ？滋g）。

2.5 精密度

取同一供試品溶液，按上述RP-HPLC分析條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸峰面積，結(jié)果表明，峰面積RSD值<0.65%。

2.6 重現(xiàn)性

一份固定粉末樣品，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行RP-HPLC分析，考察綠原酸峰面積，峰面積的RSD值<1.02%，表明方法的重現(xiàn)性在誤差范圍內(nèi)。

2.7 穩(wěn)定性

制備藥材供試品溶液后，在室溫下放置不同時(shí)間，分別于0、1、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)行RP-HPLC分析，以綠原酸的峰面積計(jì)算，考察樣品的穩(wěn)定性，主要成分的峰面積在48 h內(nèi)RSD值<1.24%，表明樣品至少在48 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.8 回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的桑葉藥材樣品約0.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量綠原酸對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)制成加樣供試品溶液，按上述色譜條件測定含量，計(jì)算回收率（表1）。從表1中可知，樣品的平均回收率為98.91%，RSD為0.84%，表明回收率符合要求。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 含量測定

按照上述色譜條件，將不同產(chǎn)地的樣品進(jìn)行處理和進(jìn)樣，每一個(gè)相同產(chǎn)地及批號的樣品測3份，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算桑葉中綠原酸的平均含量（表2）。從表2中可知，不同產(chǎn)地的桑葉藥材綠原酸含量均在0.25%以上，最高的可達(dá)0.90%，提示綠原酸確實(shí)為桑葉中的一個(gè)主要成分。

表2 桑葉藥材來源及其綠原酸含量的測定結(jié)果（n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)定量化合物為酚酸，在甲醇中有較好的溶解度，選擇甲醇超聲，處理容易、可控；且樣品呈酸性，選擇醋酸水溶液作為水相，水相中醋酸比例是通過單因素多水平試驗(yàn)確定最佳比例為1.0%。選擇乙腈作為有機(jī)相來分析中藥復(fù)方，柱壓穩(wěn)定且較低，有利于保護(hù)儀器和色譜柱。波長選擇325 nm也是基于所測化合物在該波長處吸收最大，且雜質(zhì)干擾較少。梯度選擇均一梯度變化以保證樣品具有更好的重復(fù)性。

含量測定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地桑葉活性成分綠原酸含量相差較大，中部地區(qū)河南、湖南產(chǎn)地的桑葉綠原酸含量較高。與目前藥典中收載的蘆丁含量相比，桑葉中綠原酸的含量均大于蘆丁，因此建議藥典桑葉標(biāo)準(zhǔn)中增加綠原酸含量測定。

在此次含量測定中，發(fā)現(xiàn)桑葉樣品還有其他幾個(gè)明顯的色譜峰，課題組下一步準(zhǔn)備分離制備這些色譜峰，進(jìn)行相應(yīng)結(jié)構(gòu)鑒定和富集，為下一步開展桑葉中主要成分含量測定及其活性測試奠定基礎(chǔ)。

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)系統(tǒng)工程[9]，本文僅對桑葉中綠原酸的含量進(jìn)行了測定，只是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)部分。其中，影響桑葉中綠原酸含量的因素很多，如產(chǎn)地、初加工、采收季節(jié)等，因此，只能把綠原酸作為評價(jià)桑葉質(zhì)量的指標(biāo)之一，應(yīng)該建立更為系統(tǒng)、全面、體現(xiàn)中藥特點(diǎn)的桑葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：279.

[2] 羅存敏.桑葉提取物對小鼠血糖的影響及其有效成份測定[J].蠶業(yè)科學(xué)，2005，31（4）：418-421.

[3] 陳建國，步文磊.桑葉多糖降糖作用及其機(jī)制研究[J].中草藥，2011，42（3）：515-520.

[4] 李超，潘建明，羅新根，等.桑葉消渴膠囊對2型糖尿病大鼠的影響[J].海南醫(yī)學(xué)，2012，23（2）：18-20.

[5] 雷霖，何健飛.高效液相色譜法測定桑葉中蘆丁的含量[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（3）：468-469.

[6] 周美環(huán)，趙書楷，陳淼，等.HPLC法測定桑葉中蘆丁的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（5）：228-229.

[7] 馬合木提·買買提明，美麗班·霍加.HPCE法測新疆桑葉中黃酮類成分的研究[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（6）：134-136.

[8] 姚江雄，李春，廖端芳，等.桑葉藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（10）：119-121.

[9] 李貽奎，李連達(dá).從復(fù)方丹參制劑的混亂看中藥標(biāo)準(zhǔn)化的迫切性與必要性[J].中國中藥雜志，2008，33（4）：349-354.

（收稿日期：2013-12-03 本文編輯：郭靜娟）

含量測定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地桑葉活性成分綠原酸含量相差較大，中部地區(qū)河南、湖南產(chǎn)地的桑葉綠原酸含量較高。與目前藥典中收載的蘆丁含量相比，桑葉中綠原酸的含量均大于蘆丁，因此建議藥典桑葉標(biāo)準(zhǔn)中增加綠原酸含量測定。

在此次含量測定中，發(fā)現(xiàn)桑葉樣品還有其他幾個(gè)明顯的色譜峰，課題組下一步準(zhǔn)備分離制備這些色譜峰，進(jìn)行相應(yīng)結(jié)構(gòu)鑒定和富集，為下一步開展桑葉中主要成分含量測定及其活性測試奠定基礎(chǔ)。

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)系統(tǒng)工程[9]，本文僅對桑葉中綠原酸的含量進(jìn)行了測定，只是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)部分。其中，影響桑葉中綠原酸含量的因素很多，如產(chǎn)地、初加工、采收季節(jié)等，因此，只能把綠原酸作為評價(jià)桑葉質(zhì)量的指標(biāo)之一，應(yīng)該建立更為系統(tǒng)、全面、體現(xiàn)中藥特點(diǎn)的桑葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：279.

[2] 羅存敏.桑葉提取物對小鼠血糖的影響及其有效成份測定[J].蠶業(yè)科學(xué)，2005，31（4）：418-421.

[3] 陳建國，步文磊.桑葉多糖降糖作用及其機(jī)制研究[J].中草藥，2011，42（3）：515-520.

[4] 李超，潘建明，羅新根，等.桑葉消渴膠囊對2型糖尿病大鼠的影響[J].海南醫(yī)學(xué)，2012，23（2）：18-20.

[5] 雷霖，何健飛.高效液相色譜法測定桑葉中蘆丁的含量[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（3）：468-469.

[6] 周美環(huán)，趙書楷，陳淼，等.HPLC法測定桑葉中蘆丁的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（5）：228-229.

[7] 馬合木提·買買提明，美麗班·霍加.HPCE法測新疆桑葉中黃酮類成分的研究[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（6）：134-136.

[8] 姚江雄，李春，廖端芳，等.桑葉藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（10）：119-121.

[9] 李貽奎，李連達(dá).從復(fù)方丹參制劑的混亂看中藥標(biāo)準(zhǔn)化的迫切性與必要性[J].中國中藥雜志，2008，33（4）：349-354.

（收稿日期：2013-12-03 本文編輯：郭靜娟）

含量測定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地桑葉活性成分綠原酸含量相差較大，中部地區(qū)河南、湖南產(chǎn)地的桑葉綠原酸含量較高。與目前藥典中收載的蘆丁含量相比，桑葉中綠原酸的含量均大于蘆丁，因此建議藥典桑葉標(biāo)準(zhǔn)中增加綠原酸含量測定。

在此次含量測定中，發(fā)現(xiàn)桑葉樣品還有其他幾個(gè)明顯的色譜峰，課題組下一步準(zhǔn)備分離制備這些色譜峰，進(jìn)行相應(yīng)結(jié)構(gòu)鑒定和富集，為下一步開展桑葉中主要成分含量測定及其活性測試奠定基礎(chǔ)。

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)系統(tǒng)工程[9]，本文僅對桑葉中綠原酸的含量進(jìn)行了測定，只是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)部分。其中，影響桑葉中綠原酸含量的因素很多，如產(chǎn)地、初加工、采收季節(jié)等，因此，只能把綠原酸作為評價(jià)桑葉質(zhì)量的指標(biāo)之一，應(yīng)該建立更為系統(tǒng)、全面、體現(xiàn)中藥特點(diǎn)的桑葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：279.

[2] 羅存敏.桑葉提取物對小鼠血糖的影響及其有效成份測定[J].蠶業(yè)科學(xué)，2005，31（4）：418-421.

[3] 陳建國，步文磊.桑葉多糖降糖作用及其機(jī)制研究[J].中草藥，2011，42（3）：515-520.

[4] 李超，潘建明，羅新根，等.桑葉消渴膠囊對2型糖尿病大鼠的影響[J].海南醫(yī)學(xué)，2012，23（2）：18-20.

[5] 雷霖，何健飛.高效液相色譜法測定桑葉中蘆丁的含量[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（3）：468-469.

[6] 周美環(huán)，趙書楷，陳淼，等.HPLC法測定桑葉中蘆丁的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（5）：228-229.

[7] 馬合木提·買買提明，美麗班·霍加.HPCE法測新疆桑葉中黃酮類成分的研究[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（6）：134-136.

[8] 姚江雄，李春，廖端芳，等.桑葉藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（10）：119-121.

[9] 李貽奎，李連達(dá).從復(fù)方丹參制劑的混亂看中藥標(biāo)準(zhǔn)化的迫切性與必要性[J].中國中藥雜志，2008，33（4）：349-354.

（收稿日期：2013-12-03 本文編輯：郭靜娟）