丹參主要活性成分防治骨質(zhì)疏松癥分子機(jī)制研究進(jìn)展

丁劼 王晗松 王培歌 李小凱 郭海玲 趙詠芳*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學(xué)中心，上海 200120 2.上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 200120

骨質(zhì)疏松癥是一種全身骨代謝性疾病，其主要特征是骨量減少及骨的顯微結(jié)構(gòu)退變，伴骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加及骨折危險(xiǎn)性增加等。它的基本發(fā)病機(jī)制是骨重建動(dòng)態(tài)平衡被破壞，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞功能失衡，導(dǎo)致骨代謝失衡，骨吸收增多，骨形成減少，最終造成骨吸收遠(yuǎn)大于骨形成，骨量丟失[1-3]。中國骨質(zhì)疏松癥基金會的一項(xiàng)最新研究顯示，我國骨質(zhì)疏松癥的總患病率為6.6%～19.3%，平均13%，預(yù)計(jì)到2050年，我國骨質(zhì)疏松癥或骨密度低的患者將達(dá)到2.12億[4]。因此，積極防治骨質(zhì)疏松癥具有重要意義。

作為我國中醫(yī)臨床常用中藥飲片之一，丹參又名紅根、赤參、血參根，是唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根和根莖?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》是丹參最早的文獻(xiàn)記載。丹參性味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，種植主要分布于我國華北、華東和西北地區(qū)。丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效，主要用于治療心腦血管疾病、阿爾茨海默病、帕金森病、腎功能不全、肝硬化、腫瘤和骨量丟失等疾病[5-6]。近年來，丹參防治骨質(zhì)疏松的作用受到廣泛關(guān)注，已有大量研究表明其防治骨質(zhì)疏松癥的作用[7-14]。尤其值得注意的是，丹參可以通過多條信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和骨形成，以及抑制破骨細(xì)胞的增殖、分化和骨吸收，糾正骨代謝的平衡，從而阻斷骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。丹參的活性成分可分為水溶性成分和脂溶性成分[15]。水溶性成分主要包括丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原兒茶酸、原兒茶醛、紫草酸、咖啡酸等；脂溶性成分主要包括二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、丹參酮Ⅵ、隱丹參酮等。為探討丹參在體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松作用的確切機(jī)制，以及為抗骨質(zhì)疏松新型藥物的研究和開發(fā)，本文就近年報(bào)道的丹參主要活性成分治療骨質(zhì)疏松癥的分子信號通路機(jī)制作一綜述。

1 丹參活性成分促進(jìn)骨形成的作用機(jī)制

成骨細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來，是蛋白分泌型細(xì)胞，能產(chǎn)生Ⅰ型膠原，合成并分泌骨基質(zhì)，具有高堿性磷酸酶活性，并能吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子，是負(fù)責(zé)骨形成和骨重建的主要功能細(xì)胞[16]。研究[12,17]表明，丹參及其活性成分可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化，改善骨小梁的組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)骨形成。Luo等[18]運(yùn)用斑馬魚糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松模型，發(fā)現(xiàn)丹參素可以增加成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2a(Runx2a，Runt-related transcription factor 2a)、Osterix、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣素(osteocalcin)的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨作用，阻止骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

1.1 丹參活性成分促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化作用

1.1.1BMP/Smads信號通路：骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號通路是調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育和骨代謝的重要信號通路之一[19]。BMP是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的一個(gè)重要成員。其中，BMP-2與相應(yīng)受體結(jié)合后，通過磷酸化激活細(xì)胞質(zhì)的SMAD蛋白，包括SMAD1、SMAD5或SMAD8，隨后這些SMAD蛋白再與SMAD4結(jié)合成復(fù)合體并轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，從而啟動(dòng)下游成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

在糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松大鼠模型中，丹參素可能通過提高TGF-β的表達(dá)改善骨超微結(jié)構(gòu)和促進(jìn)骨量增加[20]。郭威等[21]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能夠提高大鼠體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)增殖速率，增加BMP-2和成骨細(xì)胞成熟相關(guān)基因Runx2、ALP、和Ⅰ型膠原(Collagen-1)mRNA的表達(dá)水平，并增加骨礦化基質(zhì)的水平，提示丹參酮ⅡA可能通過增加BMP-2的表達(dá)促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。Wang等[22]進(jìn)一步驗(yàn)證了丹參酮ⅡA可以抑制去卵巢大鼠體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的衰老并促進(jìn)其增殖。而且，丹參酮ⅡA可促進(jìn)大鼠體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的增殖[23-24]，其可能機(jī)制是通過上調(diào)BMP-2的表達(dá)水平[23]。Kim等[25]發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能促進(jìn)BMP-2蛋白誘導(dǎo)間充質(zhì)前體細(xì)胞C2C12的成骨細(xì)胞分化能力，而這種促進(jìn)作用與BMP/Smads/Runx2和BMP/p38 MAPK(絲裂原活化蛋白激酶，mitogen-activated protein kinase)信號通路的激活有關(guān)。

1.1.2Wnt/β-catenin信號通路：Wnt/β-catenin通路是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化及骨形成中的一條重要信號通路[26]。當(dāng)Wnt通路活化時(shí)，β-catenin蛋白由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控下游成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。閆小飛等[27]研究發(fā)現(xiàn)，丹參素可促進(jìn)原代培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的分化和礦化作用，且丹參素促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化可能與激活Wnt/β-catenin通路有關(guān)。

氧化應(yīng)激激活的轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白O3a(Forkhead box O3a，F(xiàn)oxO3a)可以阻斷Wnt通路[28]。Yang等[29-30]研究表明，在間充質(zhì)前體細(xì)胞C2C12和成骨前細(xì)胞MC3T3-E1，丹參素通過下調(diào)Fox3a轉(zhuǎn)錄活性抑制氧化應(yīng)激，從而重啟Wnt通路，激活下游成骨細(xì)胞特異性基因Axin2、ALP和骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)的表達(dá)，促進(jìn)成骨作用。Yang等[31]還發(fā)現(xiàn)，在糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松大鼠模型中，地塞米松會引起大鼠的骨量丟失和一系列骨生物力學(xué)指標(biāo)的下降，而丹參素可以糾正地塞米松的促骨質(zhì)疏松作用?？赡軝C(jī)制是，地塞米松誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體作用基因KLF15(Kruppel-like factor 15)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，后者可以通過p66Shc蛋白的磷酸化促進(jìn)ROS(reactive oxygen species)的增加，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而ROS的增加又可以降低Tcf4因子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而阻斷Wnt通路抑制下游成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因Runx2、ALP和Osteocalcin的表達(dá)。而丹參素可以通過抑制KLF15因子的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)ROS的水平，從而啟動(dòng)Wnt通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和骨形成作用。

Cui等[32]研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可以通過提高過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的表達(dá)，促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，這就意味著向成骨細(xì)胞分化的骨髓基質(zhì)細(xì)胞會相應(yīng)減少[33]，而丹酚酸B可以逆轉(zhuǎn)這一過程，通過降低PPARγ的表達(dá)，減少骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，同時(shí)啟動(dòng)Wnt通路誘導(dǎo)更多骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成。Yang等[30]和Wang等[34]進(jìn)一步探索了丹參素和丹酚酸B糾正骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化和成脂分化之間紊亂的分子機(jī)制，一方面，丹參素和丹酚酸B通過抑制醋酸潑尼松激活的PPARγ2/C-EBPα/ap2(過氧化物酶體增殖物激活受體γ2/CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α/脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白2)通路，抑制了脂肪的形成；另一方面，丹參素和丹酚酸B重新激活由醋酸潑尼松抑制的Wnt通路，促進(jìn)了骨的形成。

1.1.3MAPKs信號通路：胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase，JNK)是絲裂原活化蛋白激酶MAPKs家族的成員，其在骨發(fā)育和形成中發(fā)揮重要作用[35-36]。Xu等[37]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B不僅可以增加人胎兒骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)ALP的表達(dá)并促進(jìn)其礦化作用，而且可以增加MSCs的Runx2、Osterix、骨橋蛋白(Osteopontin)等成骨細(xì)胞分化和成熟相關(guān)基因的表達(dá)，提示丹酚酸B可以促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞的定向分化和礦化水平。而當(dāng)加入ERK信號通路阻斷劑U0126或ERK1/2干涉RNA后，丹酚酸B的促分化和礦化作用減弱了，說明丹酚酸B的促M(fèi)SCs分化和礦化作用是通過激活ERK信號通路實(shí)現(xiàn)的。隨后，Wang等[34]進(jìn)一步在成骨前細(xì)胞MC3T3-E1驗(yàn)證了丹酚酸B這一作用。另一方面，Han等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型中，丹參素可以降低骨轉(zhuǎn)換率，并且能抑制NF-κB(nuclear factor kappa-B，核因子κB)信號通路的激活，而NF-κB能抑制JNK信號通路的激活[39]，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟。隨后，Zhu等[40]在Wnt1sw/sw骨質(zhì)疏松小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA也是通過抑制NF-κB信號通路的激活促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟。

1.2 丹參活性成分抑制成骨細(xì)胞的凋亡

王秉義等[41]報(bào)道，丹參素能夠拮抗醋酸潑尼松誘導(dǎo)氧化應(yīng)激所致骨質(zhì)疏松大鼠中成骨細(xì)胞的凋亡，并在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，丹參素能夠上調(diào)小鼠成骨前細(xì)胞系MC3T3-E1中磷酸化AKT的表達(dá)，提示丹參素通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol-3-kinases/AKT，protein-serine-threonine kinase，PI3K)通路拮抗MC3TC-E1的凋亡。

Li等[42]發(fā)現(xiàn)，小鼠成骨前細(xì)胞系MC3T3-E1在地塞米松的刺激下Nox4(NADPH oxidase 4，NADPH氧化酶4)依賴的ROS增多，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而激活線粒體途徑的凋亡。而丹參酮ⅡA可以通過抑制Nox4的激活，減少氧化應(yīng)激，從而抑制MC3T3-E1的凋亡。

2 丹參活性成分抑制骨吸收的作用機(jī)制

破骨細(xì)胞是多核巨細(xì)胞，由造血干細(xì)胞發(fā)育而來，它的分化和成熟主要需要兩大因子：巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)和核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)。M-CSF首先促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜表面表達(dá)核因子-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)，而RANK與其配體RANKL的結(jié)合通過接頭蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNFR-associated factors，TRAF6)激活下游MAPKs、NF-κB和Akt信號通路，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子活化T細(xì)胞胞質(zhì)1核因子(the nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)的表達(dá)和快速擴(kuò)增，后者轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，并介導(dǎo)破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，使破骨細(xì)胞分化成熟并發(fā)揮骨吸收功能[43]。作為RANKL可溶性誘餌受體的骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)，能與RANK競爭結(jié)合RANKL，從而阻斷RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化成熟信號通路。RANKL、RANK和OPG共同調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、成熟和生物活性[46]。

張曉燕等[44]研究發(fā)現(xiàn)，與去卵巢組相比，丹參素治療組牙槽骨骨量明顯增多，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)陽性的破骨細(xì)胞數(shù)減少，RANKL/OPG活性比值降低，說明丹參素防治牙槽骨骨質(zhì)疏松可能與其調(diào)控OPG/RANKL/RANK信號通路有關(guān)。在炎癥介導(dǎo)的破骨細(xì)胞骨吸收中，成骨細(xì)胞可以增加環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，Cox-2)的活性并催化前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的合成，后者通過提升RANKL/OPG活性比例促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收作用，導(dǎo)致骨量丟失[45]；而丹參酮ⅡA可以通過抑制Cox-2/PGE2信號通路降低RANKL/OPG活性比例，從而抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用[46]。

圖1 丹參活性成分對成骨細(xì)胞作用的分子機(jī)制示意圖Fig.1 The effect and molecular mechanism on the osteoblasts induced by the active ingredients

Kim等[47]在M-CSF和RANKL誘導(dǎo)體外培養(yǎng)骨髓來源巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能在破骨細(xì)胞分化過程中下調(diào)破骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志基因calcitonin受體、c-Src和integrinβ mRNA的表達(dá)，并且丹參酮ⅡA是通過抑制RANKL激活的ERK(MAPKs成員之一)、NF-κB和Akt下游信號通路抑制破骨細(xì)胞分化成熟；而且丹參酮ⅡA還能通過破壞成熟破骨細(xì)胞F-actin環(huán)結(jié)構(gòu)抑制其骨吸收作用。Cheng等[48]在RAW264.7細(xì)胞系中進(jìn)一步驗(yàn)證了丹參酮ⅡA可以通過抑制RANKL激活的ERK、NF-κB和Akt下游信號通路抑制破骨細(xì)胞分化成熟。而且，Wang等[49]研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮也是通過抑制RANKL介導(dǎo)的ERK磷酸化和NF-κB激活抑制體外培養(yǎng)骨髓來源的巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化成熟。另外，Nicolin等[50]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅵ通過抑制RANKL/NF-κB通路抑制破骨細(xì)胞的分化和F-actin環(huán)結(jié)構(gòu)。王麗麗等[51]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可能通過抑制NF-κB的活性抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用，從而改善高脂飲食小鼠的骨代謝改變。

RANKL與RANK結(jié)合之后，通過MAPK信號通路激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1，激活的AP-1與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度波動(dòng)共同激活NFATc1分子，NFATc1是調(diào)控RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子[43]。Kwak等[52]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA通過抑制RANKL介導(dǎo)的c-Fos(轉(zhuǎn)錄因子AP-1成員之一)和NFATc1表達(dá)抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟。

從以上文獻(xiàn)報(bào)道可以看到，丹參不同的活性成分可以干預(yù)骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)通路進(jìn)行干預(yù)(示意圖見圖1和圖2)，其中研究較深入的為丹參素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮Ⅵ，其分子機(jī)制總結(jié)如下(見表1)。①丹參素通過激活Wnt/β-catenin、JNK和PI3K/AKT信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和骨形成作用，通過調(diào)節(jié)KLF15/FoxO3a/Wnt信號通路糾正體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，并通過抑制PPARγ2/C-EBPα/ap2信號通路，抑制成骨細(xì)胞前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，促進(jìn)成骨作用；而且丹參素可以通過調(diào)控OPG/RANKL/RANK 信號通路抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收作用；②丹參酮ⅡA通過激活BMP/Smads、MAPK p38和JNK信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和骨形成作用，而且丹參酮ⅡA可以通過調(diào)控RANKL/RANK及其下游ERK、NF-κB和AP-1信號通路抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收作用；③丹酚酸B通過激活Wnt/β-catenin和ERK信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和骨形成作用，并通過抑制PPARγ2的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化；而且丹酚酸B通過抑制NF-κB/cathepsin K信號通路抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用；④隱丹參酮和丹參酮Ⅵ通過調(diào)控RANKL/RANK 及其下游的NF-κB信號通路抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收作用。丹參的許多活性成分與現(xiàn)代抗骨質(zhì)疏松化學(xué)藥物具有相似的藥理作用，而且天然藥物丹參中提取的活性成分不良反應(yīng)小，各活性成分的優(yōu)化配比最大程度地發(fā)揮了藥效，這為將來對抗骨質(zhì)疏松新型藥物的研究和開發(fā)提供了更多思路。

圖2 丹參活性成分對破骨細(xì)胞作用的分子機(jī)制示意圖Fig.2 The effect and molecular mechanism on the osteoclasts induced by the active ingredients derived from SM

表1 丹參各活性成分干預(yù)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的信號通路