江蘇省2016—2019年不同來源小腸結(jié)腸炎耶爾森菌血清、生物型分布及分子特征分析

周 璐，段 然，祝雯雯，朱瑩瑩，鮑倡俊，王 鑫，談忠鳴*

1國家衛(wèi)生健康委員會(huì)腸道病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009；2中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206；3徐州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 徐州 221002；4東臺(tái)市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 東臺(tái) 224299

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種全球分布的重要人獸共患病病原菌［1-2］，人類主要通過接觸帶菌動(dòng)物、被污染的土壤、水源等而感染，并引起腹瀉、腸炎以及類闌尾炎等多種腸道癥狀，嚴(yán)重者可引起腸道外并發(fā)癥，如關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、心內(nèi)膜炎等，甚至可引起敗血癥，造成死亡［3］。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌宿主廣泛，除人以外，還有猴子、狗、豬、羊、嚙齒動(dòng)物及鳥類等，有研究顯示對(duì)人威脅最大的動(dòng)物為豬［4］。該病原菌也是一種重要的食源性致病菌，通過糞口途徑傳播，很多國家已將該菌列為進(jìn)出口食品的常規(guī)檢測項(xiàng)目。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌具有嗜冷性，在低溫環(huán)境中也可生長繁殖，其產(chǎn)生的耐熱腸毒素不僅耐高溫，也可在低溫條件下保持?jǐn)?shù)月活性，所以也被稱為“冰箱病”［5］。

血清型和生物型是根據(jù)表型對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行分型的兩種常規(guī)方法，不同國家或地區(qū)致病性菌株血清型和生物型存在較大差異。根據(jù)菌體O 抗原不同小腸結(jié)腸炎耶爾森菌可分為60 多種血清型，日本以O(shè)：3 為主，美國以O(shè)：8 為主，我國致病性菌株以O(shè)：3和O：9血清型為主［6-7］。

多位點(diǎn)序列分析（multilocus sequence typing，MLST）是一種基于核酸序列測定的細(xì)菌分型方法，通過擴(kuò)增小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的7 個(gè)管家基因（adk、argA、aroA、glnA、thrA、tmk、trpE）內(nèi)部片段并測定其序列，分析菌株的變異情況，較其他方法操作更加簡單，便于不同實(shí)驗(yàn)室之間的比對(duì)，該技術(shù)常用于細(xì)菌的流行病學(xué)監(jiān)測和進(jìn)化研究。

北歐是人感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病的高發(fā)地區(qū)，美國、日本、巴西及芬蘭出現(xiàn)過暴發(fā)［6-7］。我國人感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以散發(fā)為主，但蘭州和沈陽分別出現(xiàn)過兩次大規(guī)模暴發(fā)［8-9］。因此，中國疾病預(yù)防控制中心在全國多省設(shè)立小腸結(jié)腸炎耶爾森菌監(jiān)測點(diǎn)。為了解江蘇省小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的表型和基因型特征，現(xiàn)對(duì)2016—2019年江蘇省不同來源菌株的血清、生物型、分子特征和同源性進(jìn)行分析，探討其分子流行病學(xué)特點(diǎn)及遺傳進(jìn)化關(guān)系，為本省小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病的長期監(jiān)測和科學(xué)防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

江蘇省徐州的銅山區(qū)和鹽城的東臺(tái)市為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌國家級(jí)監(jiān)測點(diǎn)，采集本地腹瀉患者及家禽家畜糞便、生、熟肉制品等標(biāo)本，4 ℃保存待檢。

改良磷酸鹽緩沖液、麥康凱瓊脂、改良克氏雙糖瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；Rustigian’s尿素培養(yǎng)基（Oxoid 公司，英國）；革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡（VITEC?2 GN Test kit，上海梅里埃診斷產(chǎn)品有限公司）；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分型血清（包括O：1，2、O：3、O：5、O：8、O：9，生研式會(huì)社，日本）；細(xì)菌核酸提取試劑Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega公司，美國）；全自動(dòng)生化鑒定儀（VETIC?2 System，生物梅里埃公司，法國）。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離鑒定

按照?qǐng)F(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《耶爾森菌病診斷》（T/CPMA 005?2019），將標(biāo)本接種改良磷酸鹽緩沖液，于4 ℃分別增菌培養(yǎng)7 d、14 d、21 d后轉(zhuǎn)種于麥康凱平板，26 ℃培養(yǎng)48 h，挑取可疑菌落分別接種改良克氏雙糖瓊脂斜面26 ℃培養(yǎng)48 h，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣且不產(chǎn)硫化氫者轉(zhuǎn)種Rustigian’s 尿素培養(yǎng)基，尿素陽性者分別轉(zhuǎn)種兩支半固體培養(yǎng)基，分別置于26 ℃和37 ℃培養(yǎng)24 h。26 ℃有動(dòng)力且37 ℃無動(dòng)力者為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌疑似菌株，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和生化鑒定。鑒定為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的菌株用分型血清進(jìn)行玻片凝集，并設(shè)鹽水對(duì)照。

1.2.2 核酸提取

將培養(yǎng)好的菌苔刮至含200 μL 生理鹽水的1.5 mL EP管中。試劑盒提取細(xì)菌總DNA，操作步驟參照試劑盒使用說明書，核酸-80 ℃保存待用。

1.2.3 二代測序

細(xì)菌DNA采用Qubit Fluorometer 儀測定核酸濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢查核酸完整性，合格樣品送華大基因建庫（≤800 bp常規(guī)文庫）后上機(jī)進(jìn)行細(xì)菌全基因組重測序，測序平臺(tái)為BGI 2000。

1.2.4 毒力基因和MLST分析

下機(jī)原始數(shù)據(jù)采用CLC genomics workbench V20.0.4 軟件（Qiagen）過濾并檢查質(zhì)量，運(yùn)行Micro?bial Genomics Module模塊在NCBI數(shù)據(jù)庫里進(jìn)行5種毒力基因（ail、ystA、ystB、yadA、virF）［6］比對(duì)及MLST鑒定［10］。確定7 個(gè)等位基因序號(hào)構(gòu)成的基因型（se?quence type，ST），并將7 個(gè)字符型數(shù)據(jù)導(dǎo)入BioNu?merics 8.0（Applied Maths，Belgium）軟件，利用非加權(quán)配伍組平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株檢出情況

2016—2019 年共采集各類標(biāo)本6 398 份，分離出的可疑菌株進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性桿菌或球桿菌的菌株（圖1），純化培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定，共鑒定出186株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，分離率為2.91%。其中59株菌分離自腹瀉患者，43株菌來自豬，22株菌分離自狗糞便，25株菌來自羊糞，14株菌分離自牛糞，11株菌分離自雞糞，6株菌分離自食品，6株菌從蒼蠅中分離到（表1）。

表1 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌不同來源標(biāo)本分離情況Table 1 The table of Yersinia enterocolitic strains isolated from different sources

圖1 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌江蘇分離株革蘭氏染色鏡檢圖Figure 1 Gram stain microscope image of Yersinia entero?colitica strain isolated from Jiangsu Province

2.3 毒力基因分析

二代測序原始下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)入CLC genomics workbench V20.0.4 軟件，經(jīng)過濾后Clean data 在NC?BI 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)5 個(gè)主要毒力基因（ail、ystA、ystB、yadA、virF）。國內(nèi)常見的毒力基因型為Ⅰ型（ail+、ystA+、ystB?、yadA+、virF+）；Ⅱ型（ail+、ystA+、ystB?、yadA?、virF?）；Ⅲ型（ail?、ystA?、ystB+、yadA?、virF?）；Ⅳ型（ail?、ystA?、ystB?、yadA?、virF?）。通過全基因組掃描發(fā)現(xiàn)4種毒力基因型均有，Ⅲ型較多（119/186，63.98%），其次為Ⅳ型（46/186，24.73%）。人源株中只有Ⅲ型和Ⅳ型，其中Ⅲ型為主（50/59，84.75%）（表2）。

表2 2016—2019年江蘇省小腸結(jié)腸炎耶爾森菌株宿主?分型Table 2 Host?type of Yersinia enterocolitic strains isolated from Jiangsu，2016?2019

2.4 MLST聚類分析

測序數(shù)據(jù)上傳pub?MLST 數(shù)據(jù)庫定義菌株的7 個(gè)等位基因及ST型，每個(gè)等位基因的匹配度均為100%。結(jié)果顯示186株菌被分為81個(gè)ST型，菌株最多的3個(gè)ST型為別為ST429（21株）、ST157（11株）、ST404（9 株）?；颊叻蛛x株有32 個(gè)ST 型，其中最多的3 個(gè)ST 型為ST17（6 株）、ST178（6 株）和ST157（5 株）。所有ST 型聚類圖顯示，ST3 型處于中心位置，從ST3 型分出19 個(gè)亞型或分支，存在人源ST 型的分支有10個(gè)（圖2）。

圖2 江蘇省179株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌MLST最小生成樹圖Figure 2 Minimum spanning tree of 179 strains of Yersinia enterocolitica isolated from Jiangsu Province

3 討論

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種可通過食物進(jìn)行傳播的人獸共患病病原菌，本研究顯示2016—2019年江蘇省監(jiān)測標(biāo)本小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率為2.91%，而2010—2013年江蘇菌株分離率為3.77%［11］，該結(jié)果表明隨著人民生活水平的提高及疾病防控意識(shí)的加強(qiáng)，江蘇地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌流行強(qiáng)度可能出現(xiàn)一定程度的下降。國內(nèi)其他地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率差異較大，安徽省六安市2015—2018 年監(jiān)測結(jié)果顯示當(dāng)?shù)匦∧c結(jié)腸炎耶爾森菌分離率高達(dá)12.22%［12］；河南省2011—2017 年分離率則為3.06%［13］，與本研究結(jié)果較為接近。

根據(jù)“O”抗原不同，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌可至少分為60個(gè)血清型（O：1，2、O：3、O：5、O：8、O：9、O：21等）［1］。本研究顯示，不同來源分離株中一半以上的菌株血清型無法鑒定，已分型的77株菌中主要流行血清型為O：8與O：3，且O：1，2、O：5、O：9少量分布的特點(diǎn)，人源株血清型分布與此結(jié)果基本一致，這與我國僅存在O：3和O：9兩種血清型致病株的報(bào)道存在差異［7］。下一步將持續(xù)監(jiān)測收集更多的菌株，尤其需關(guān)注腹瀉患者分離株血清分布的變化。

根據(jù)生化反應(yīng)差異，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌還可分為6 個(gè)生物型（1A、1B、2、3、4、5），1A 型菌株經(jīng)常從人類臨床樣本中分離出，但它們對(duì)疾病的貢獻(xiàn)仍然是一個(gè)有爭議的話題，研究發(fā)現(xiàn)該型菌株對(duì)人血清補(bǔ)體殺傷普遍表現(xiàn)出抗性［14］，這可能表明該型菌株具有致病的潛力，然而它們的毒力機(jī)制仍不清楚。本研究顯示，江蘇地區(qū)不同來源的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌存在3個(gè)生物型，其中1A型為絕對(duì)優(yōu)勢生物型，3型所占比例較小，而2型僅1株。人源株除1株生物2 型外，也全部為1A 型，提示應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)于生物1A型菌株的研究工作。

以往研究顯示，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的致病性與毒力基因ail、virF、yadA、ystA和ystB相關(guān)，非致病性菌株毒力基因分布為：ail?virF?yadA?ystA?ystB+或ail?virF?yadA?ystA?ystB?。有多篇文獻(xiàn)報(bào)道腹瀉患者分離株中，不全為攜帶毒力基因的菌株，分離株中存在毒力基因Ⅲ、Ⅳ型的情況［14］。本研究顯示2016—2019 年江蘇地區(qū)收集到的不同來源分離株中4 種毒力基因型均存在，人源株中主要以毒力基因Ⅲ型為主，Ⅳ型并存的分布特點(diǎn)。下一步，將重點(diǎn)分析毒力基因Ⅳ型患者的臨床特征，并對(duì)該型分離株進(jìn)行全基因組毒力基因掃描。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分子分型技術(shù)較多，應(yīng)用也較為廣泛，如本實(shí)驗(yàn)室之前進(jìn)行的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌染色體16S rRNA 序列分析［15］，Duan 等［16］在中國建立的多位點(diǎn)序列分析（MLST），Wang 等［17］在國內(nèi)建立的多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA），以及在我國應(yīng)用最多的脈沖場凝膠電泳（PFGE）等。MLST通過對(duì)保守序列的測定來闡述菌屬水平的進(jìn)化關(guān)系，本研究采用全基因組測序技術(shù)，利用生物信息學(xué)手段在鑒定菌株ST型的同時(shí)，還可獲得大量額外的基因信息。本研究中采用的MLST方法將我省不同來源的186株菌分為81個(gè)ST型，聚類圖顯示所有ST型以ST3型為核心，呈分散分布。其中菌株數(shù)最多的3個(gè)ST型為別為ST429（21株）、ST157（11 株）、ST404（9 株），其中ST429 型菌株只在動(dòng)物中分離到，ST157 和ST404 在人源株中均有發(fā)現(xiàn)。人源分離株中菌株數(shù)最多的ST17 和ST157 型在歐洲均有報(bào)道。聚類圖上顯示ST3 位于中心位置，并有3 個(gè)與人源ST 型相關(guān)的主要進(jìn)化方向，分別為ST4、ST137 和ST166。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌基因組容易大段的插入或丟失，所以7 個(gè)管家基因變異度較高，ST 型呈分散分布，且有些人源ST 型與ST3 型距離較遠(yuǎn)，值得進(jìn)一步分析。

既往研究表明，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌大致呈現(xiàn)以豬為“圓心”向四周以同心圓形式發(fā)散的分布理論［18］。本研究采集各類型標(biāo)本中均有菌株檢出，表明江蘇地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌動(dòng)物宿主分布廣泛。MLST 結(jié)果顯示，從豬分離到與人源菌相同ST型的菌株最多，說明豬是當(dāng)?shù)匦∧c結(jié)腸炎耶爾森菌重要的宿主和傳播源；狗和雞僅次于豬，其中狗與人較親密，雞飼養(yǎng)較普遍，因此在飼養(yǎng)、屠宰、加工過程，相關(guān)從業(yè)人員需做好個(gè)人防護(hù)，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)相關(guān)動(dòng)物糞便等排泄物的監(jiān)管及周圍環(huán)境的消毒工作。

本研究收集了江蘇省不同來源的菌株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了國內(nèi)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的基因型并揭示了生物表型和基因型的相關(guān)性，為該病的綜合防治和病原的動(dòng)態(tài)監(jiān)測提供了參考依據(jù)。