嗜酸粒細胞性哮喘生物標志物的研究進展

陳雪琴，張明順，黃 茂，吉寧飛*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)國家衛(wèi)生健康委員會抗體技術(shù)重點實驗室，3免疫學(xué)系，江蘇 南京 211166

哮喘是一類具有不同病理生理特征、臨床表現(xiàn)、病理和預(yù)后的異質(zhì)性疾病。從氣道炎癥的角度可分為4 種類型：嗜酸粒細胞性哮喘（eosinophilic asthma，EA）、中性粒細胞哮喘、混合性粒細胞哮喘和寡粒細胞性哮喘，其中以EA最為常見［1］。誘導(dǎo)痰細胞是識別哮喘氣道炎癥的金標準，文獻中常將EA定義為痰嗜酸粒細胞比例＞1%～3%的哮喘［2］。近年來EA越來越受到關(guān)注，有研究顯示部分EA患者盡管吸入高劑量糖皮質(zhì)激素（激素）但氣道嗜酸性炎癥仍持續(xù)存在，與更嚴重的疾病程度和預(yù)后相關(guān)［3］。聚類分析顯示，這類患者成年起病，無特應(yīng)性，常合并慢性鼻竇炎及鼻息肉，存在持續(xù)的氣流受限［4］。目前，新型靶向2 型炎癥的生物制劑能夠精準化治療特定表型（如EA）的哮喘患者，對高特異性、可重復(fù)且易于測量的生物標志物的需求也愈加明顯。誘導(dǎo)痰嗜酸粒細胞可預(yù)測哮喘急性發(fā)作以及調(diào)整吸入性糖皮質(zhì)激素（inhaled corticosteroid，ICS）的劑量［5-6］，但技術(shù)要求較高且耗時，需配備專門的實驗室和操作人員。支氣管組織活檢和支氣管肺泡灌洗液能直接反映氣道嗜酸粒細胞炎癥，但這些方法具有侵入性、價格昂貴的缺點，在基層醫(yī)療機構(gòu)中不能廣泛使用。一些非侵入性的生物標志物包括外周血嗜酸粒細胞、呼出氣一氧化氮（fractional ex?haled nitric oxide，F(xiàn)eNO）和骨膜蛋白（periostin）等成為潛在的替代標志物，但其預(yù)測嗜酸性氣道炎癥的能力仍存在爭議。本文就EA的生物標志物作一綜述。

1 外周血嗜酸粒細胞

外周血嗜酸粒細胞一直是痰嗜酸粒細胞的良好替代指標［7］。有研究顯示血嗜酸粒細胞計數(shù)在150個/μL及以上能準確預(yù)測痰嗜酸粒細胞增多，敏感性為85%，特異性為75%［8］。同樣，Schleich等［9］提出血嗜酸粒細胞識別痰嗜酸粒細胞≥3%的理想界值為188 個/μL，敏感性為72%，特異性為73%。還有研究將截斷值設(shè)定在300 個/μL［5］甚至更高［10］。關(guān)于血嗜酸粒細胞計數(shù)作為嗜酸粒細胞炎癥的截斷值尚未達成共識。一項病例對照研究顯示，外周血嗜酸粒細胞增多與哮喘嚴重程度和癥狀控制不佳相關(guān)，但與肺功能減退無明顯關(guān)聯(lián)［7］。血嗜酸粒細胞可以預(yù)測哮喘急性發(fā)作［11］并識別出對抗白介素（IL）?5 單抗治療有應(yīng)答的人群［12］，但用于指導(dǎo)2型生物制劑治療的閾值是可變的（從150～400個/μL不等），取決于哮喘常規(guī)用藥和使用的生物制劑［13］。

外周血嗜酸粒細胞的測量具有簡便、可重復(fù)的優(yōu)點，但因其相對較高的假陰性率和假陽性率，仍不能完全代替痰嗜酸粒細胞［10］。Hastie 等［5］發(fā)現(xiàn)血嗜酸粒細胞計數(shù)＞300 個/μL 時識別嗜酸粒細胞表型的準確度只有63%，陽性預(yù)測值50%。這種低準確度可能是因為哮喘患者血嗜酸粒細胞的高度變異性［14］?？紤]到血嗜酸粒細胞在生物制劑的選擇方面有著不可或缺的作用，重復(fù)測量血嗜酸粒細胞是有必要的［14］。

2 FeNO

一氧化氮（nitric oxide，NO）是氣道上皮細胞表達的一氧化氮合酶合成的一種反應(yīng)性分子［2］，經(jīng)口測量的NO 又稱FeNO。多項研究表明，F(xiàn)eNO 與痰嗜酸粒細胞呈正相關(guān)［6，15］。2011年美國胸科協(xié)會指出FeNO＜25/20 ppb（成人/兒童）提示患者存在非嗜酸粒細胞炎癥，對激素治療不敏感；反之，F(xiàn)eNO＞50/35 ppb（成人/兒童）提示存在嗜酸粒細胞炎癥，對激素治療有效［16］。FeNO 不僅可以輔助診斷哮喘，還能指導(dǎo)哮喘抗炎治療［16-17］。一項Meta 分析顯示，基于FeNO 指導(dǎo)哮喘治療可降低哮喘發(fā)作風(fēng)險，但對哮喘控制和肺功能無明顯影響［18］。最近，F(xiàn)ielding等［19］使用7項隨機對照試驗的數(shù)據(jù)進行個體患者數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，基于FeNO 指導(dǎo)治療的模式對于未接受白三烯受體拮抗劑治療且不肥胖的哮喘患者可能更有效。高FeNO水平的重癥哮喘患者存在明顯的嗜酸性氣道炎癥、嚴重的氣流受限和氣道重塑，也存在頻繁的急診就診［20］。在重癥哮喘患者中觀察到的FeNO與嗜酸粒細胞之間的聯(lián)系可能是由于激素抵抗或上皮細胞的持續(xù)激活，后者是NO 合成的主要部位，也是嗜酸性趨化因子的來源［21］。Abe等［22］連續(xù)3年測量100例重癥哮喘患者的FeNO值，發(fā)現(xiàn)FeNO 水平持續(xù)在50 ppb 以上與病情惡化有關(guān)。此外，F(xiàn)eNO 還可預(yù)測重癥EA 患者對生物制劑，如奧馬珠單抗（omalizumab）、美泊利單抗（mepo?lizumab）和貝那利珠單抗（benralizumab）等的治療反應(yīng)［23］。

與誘導(dǎo)痰相比，F(xiàn)eNO 具有快速、簡便、安全、重復(fù)性好的優(yōu)點。但FeNO 的測定易受過敏、年齡、激素用量、食物飲料、晝夜節(jié)律、吸煙等多種因素的影響。Nanda等［24］研究發(fā)現(xiàn)在5～7 d內(nèi)多次測量FeNO的平均值比單次測量值能更好地反映痰嗜酸粒細胞水平。

3 骨膜蛋白

骨膜蛋白是一種與纖維化有關(guān)的分泌型基質(zhì)蛋白，重組IL?4和IL?13在培養(yǎng)的支氣管上皮細胞和成纖維細胞中可上調(diào)骨膜蛋白的表達［25］。在哮喘患者中，骨膜蛋白的表達水平與網(wǎng)狀基底膜厚度相關(guān)［25］。血清骨膜蛋白是哮喘嗜酸性氣道炎癥的生物標志物，與痰嗜酸粒細胞和激素治療反應(yīng)相關(guān)［25-26］。以25 ng/mL 為分界值，血清骨膜蛋白可有效區(qū)分嗜酸粒細胞低和高的個體，敏感性為57%，特異性為85%，陽性預(yù)測值為93%［25］。然而，研究結(jié)果顯示，在兩個獨立的哮喘隊列中，與血嗜酸粒細胞和FeNO相比，血清骨膜蛋白在鑒別嗜酸粒細胞性炎癥（痰嗜酸粒細胞≥3%）和非嗜酸粒細胞性炎癥方面的準確度最低［27］。盡管診斷EA 的能力相對較弱，血清骨膜蛋白可預(yù)測哮喘患者的固定氣流受限［28］以及新型生物制劑的療效［26，29］。在一項人源化抗IL?13 單抗（lebrikizumab）的Ⅱ期臨床試驗中，治療前血清骨膜蛋白水平較高的哮喘患者使用lebrikizumab后肺功能的改善比骨膜蛋白水平較低的患者更明顯［29］。

相較于其他2 型炎癥生物標志物，血清骨膜蛋白的實驗室標本處理和分析工作缺乏標準化流程，且易受年齡、吸煙、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、合并癥等因素的影響［26，30］，因此對于結(jié)果的解讀需謹慎。

4 免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）

IgE 通過Fc 區(qū)與肥大細胞上的FcεR Ⅰ受體或B淋巴細胞和嗜酸粒細胞上的FcεR Ⅱ受體結(jié)合，釋放炎癥介質(zhì)，在過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［13，31］。IgE與痰嗜酸粒細胞相關(guān)［5-6］，但其診斷嗜酸粒細胞性哮喘的效力可能劣于FeNO和血嗜酸粒細胞。Wester?hof 等［32］通過受試者工作特征曲線比較血嗜酸粒細胞、FeNO 和總IgE 3 種生物標志物預(yù)測痰嗜酸粒細胞增多的準確度發(fā)現(xiàn)，總IgE的曲線下面積（area un?der the curve，AUC）最小。Good 等［33］通過支氣管鏡檢查以鑒定哮喘表型，也發(fā)現(xiàn)總IgE 水平與支氣管肺泡灌洗液或活檢標本中的嗜酸粒細胞缺乏相關(guān)性，盡管這部分有嗜酸粒細胞證據(jù)的患者大多（＞80%）過敏原皮膚試驗陽性。

血清總IgE 雖不能預(yù)測哮喘患者的臨床應(yīng)答，但抗IgE 治療可顯著減少氣道和外周血嗜酸粒細胞［34］。對這一矛盾可能的解釋是與抗IgE下調(diào)肥大細胞、嗜堿性粒細胞和樹突狀細胞表面的FcεRⅠ有關(guān)，表達FcεRⅠ細胞的減少限制過敏原誘導(dǎo)的IgE介導(dǎo)的反應(yīng)，進而阻止細胞因子的釋放和嗜酸粒細胞在氣道中的募集［2］。此外，抗IgE治療還可以通過降低氣道樹突狀細胞水平促進Th2 分化、嗜酸粒細胞存活和募集所必需的2型細胞因子減少。

5 血嗜酸粒細胞、FeNO、血清骨膜蛋白和總IgE 的組合

Korevaar 等［6］納入32 項研究的薈萃分析顯示，使用單一的替代生物標志物將導(dǎo)致大量假陽性或假陰性。不難理解，EA 發(fā)病機制復(fù)雜、涉及不同的分子途徑，而不同的生物標志物可能代表不同的2型氣道炎癥途徑。因此，兩個或兩個以上生物標志物的組合或許可以提高檢測嗜酸性氣道炎癥的敏感性和特異性。

Westerhof 等［32］聯(lián)合使用FeNO 和血嗜酸粒細胞顯著提高了診斷EA的準確度，但將總IgE加入FeNO和血嗜酸粒細胞的組合時，AUC值無明顯變化。而Hastie 等［5］聯(lián)合使用血嗜酸粒細胞、FeNO 和IgE 并未提高EA診斷的準確度。同樣，Wagener等［27］將血嗜酸粒細胞、FeNO和血清骨膜蛋白3個標志物組合在一起時，沒有發(fā)現(xiàn)任何改善。在指導(dǎo)治療方面，Malerba等［35］研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)策略（基于臨床癥狀）相比，聯(lián)合FeNO和痰嗜酸粒細胞調(diào)整ICS劑量可提高EA控制水平以及減少急性發(fā)作。正在進行中的英國醫(yī)學(xué)研究理事會的難治性哮喘分層計劃（RASP?UK）旨在探索重癥哮喘的新型生物標志物分層策略，以改善重癥哮喘患者的臨床管理和靶向治療，其結(jié)果在未來將提供更多的信息［36］。

6 嗜酸粒細胞陽離子蛋白和嗜酸粒細胞源性神經(jīng)毒素

嗜酸粒細胞陽離子蛋白（eosinophil cationic pro?tein，ECP）和嗜酸粒細胞源性神經(jīng)毒素（eosinophil?derived neurotoxin，EDN）是嗜酸粒細胞活化的標志，被認為是哮喘2型炎癥的潛在生物標志物［37-38］。一項美泊利單抗治療重癥EA的Ⅲ期臨床試驗的事后分析［39］結(jié)果顯示，EDN 和ECP 可預(yù)測第1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in first second，F(xiàn)EV1）的改善，同時高基線EDN 亞組的哮喘急性發(fā)作頻率較低基線EDN 亞組下降更明顯。但研究者指出，EDN的預(yù)測能力很大程度上是由于其與基線外周血嗜酸粒細胞的相關(guān)性。最近，有研究顯示血清EDN 可用于評估EA 的嚴重程度［40］。An 等［41］發(fā)現(xiàn)EDN 比血嗜酸粒細胞計數(shù)能更好地反映哮喘控制狀況（AUC 0.726vs.0.628，P=0.024）。

7 呼吸組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)等

“組學(xué)（omics）”反映了一種基于從單個樣本獲取大規(guī)模數(shù)據(jù)集的實驗范式，目的是識別疾病的生物標志物和/或闡明新的功能或病理機制［42］。測量呼出氣冷凝物中的揮發(fā)性有機化合物（volatile or?ganic compound，VOC）稱為“呼吸組學(xué)”。呼出氣中含有數(shù)千種VOC的復(fù)雜氣體混合物，它們來自全身和局部的代謝、炎癥和氧化過程［43］。目前用于分析VOC的技術(shù)包括氣相色譜?質(zhì)譜（gas chromatography?mass spectrometry，GC?MS）和電子鼻（electronic nose，eNose）。GC?MS作為一種化學(xué)分析技術(shù)，通過與先前建立的參考庫比較單個化合物的質(zhì)量與電荷比以識別出呼吸樣本中的單個成分；電子鼻則是類似哺乳動物嗅覺的多傳感器設(shè)備，其對VOC混合物中的多種化合物具有交叉反應(yīng)，產(chǎn)生由VOC混合物驅(qū)動并具有其特征的傳感器響應(yīng)模式［43］，缺點是不能對呼出氣的化學(xué)成分進行精確分析。研究顯示，電子鼻技術(shù)能夠區(qū)分哮喘和對照組，其準確度與FeNO 和痰嗜酸粒細胞相當，并且預(yù)測哮喘患者對激素的反應(yīng)優(yōu)于痰嗜酸粒細胞和FeNO［44］。Schleich等［45］在一項前瞻性隊列研究中使用GC?MS 分析發(fā)現(xiàn)，己烷和2?己酮能很好地識別EA，其準確度與血嗜酸粒細胞和FeNO相當。此外，F(xiàn)eNO、血嗜酸粒細胞和VOCs 的組合對EA 顯示出較好的預(yù)測能力（AUC為0.9）。

除上述呼吸組學(xué)可應(yīng)用于炎癥表型的識別，還有其他組學(xué)技術(shù)在開展。Rossios 等［46］發(fā)現(xiàn)痰IL1RL1（也稱為IL33R 或ST2）基因表達與重癥EA相關(guān)。Schofield等［47］采用無偏標記定量質(zhì)譜和拓撲數(shù)據(jù)分析方法對206例哮喘患者的痰上清液蛋白質(zhì)組進行分析，發(fā)現(xiàn)有10 種蛋白（組蛋白H4、玻璃體凝集素、富含組氨酸的糖蛋白、免疫球蛋白重常數(shù)g3、補體C3、轉(zhuǎn)甲狀腺素、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、α?1?抗胰蛋白酶、半乳糖凝集素?3 結(jié)合蛋白和ezrin）能較好地預(yù)測EA表型。Gai 等［48］使用液相色譜?質(zhì)譜法測定血清代謝甘油磷脂譜，結(jié)果顯示痰嗜酸粒細胞≥3%組血清溶血磷脂酰甘油水平明顯高于痰嗜酸粒細胞＜3%組，提示血清溶血磷脂酰甘油可能是EA的一個生物標志物。

8 分子途徑相關(guān)標志物

在過敏性EA中，Th2細胞是哮喘病理生理的驅(qū)動因素，但近年來的研究表明，在成人起病的非過敏性EA中，2型固有淋巴細胞（group 2 innate lymphoid cell，ILC2）扮演著重要角色［49］。ILC2是一群不表達譜系標志物（不表達T、B、NK、肥大及嗜堿性粒細胞等譜系標志物），并且缺乏抗原識別受體的細胞群，在IL?33、IL?25和/或胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素的刺激下產(chǎn)生大量IL?5 和IL?13，介導(dǎo)2 型固有免疫［49］。研究顯示，ILC2 在哮喘患者外周血中增加［50］，且重癥EA患者的痰和外周血中ILC2水平比輕癥哮喘患者高［51］。Liu等［52］研究發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細胞ILC2的百分比（%ILC2）診斷EA 的準確度略優(yōu)于血嗜酸粒細胞和FeNO。以0.076%ILC2 為界值，檢測嗜酸性氣道炎癥的敏感性為67.7%，特異性為95.3%，提示ILC2可能是EA的潛在生物標志物。一項前瞻性研究結(jié)果顯示，ILC2與外周血嗜酸粒細胞百分比呈正相關(guān)，但與肺功能無關(guān)［53］。目前，關(guān)于ILC2 能否替代誘導(dǎo)痰診斷EA以及其在預(yù)測激素治療反應(yīng)和疾病預(yù)后方面尚需進一步研究。

綜上所述，無創(chuàng)、易獲取、可重復(fù)的生物標志物將極大地簡化和改善哮喘的診斷和治療。單一的生物標志物并不能有效捕捉復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)，兩種或兩種以上生物標志物的聯(lián)合也許能提高診斷的準確度（如血嗜酸粒細胞和FeNO 的組合）。此外，隨著對EA發(fā)病機制的進一步認識以及組學(xué)等新技術(shù)的開展，確定新的、更上游的嗜酸粒細胞炎癥生物標志物將為EA 患者帶來理想的靶向治療。最后，考慮到部分生物標志物的不穩(wěn)定性［14］，未來的研究應(yīng)著眼于這些炎癥性生物標志物在長時間內(nèi)的縱向變異性，以更好地應(yīng)用于臨床。