高脂飲食影響小鼠空回腸上皮功能的差異性研究

金 燚，俞 靜，夏 凡，丁國(guó)憲

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，高能量、高脂肪、低膳食纖維食物攝入顯著增加，導(dǎo)致全球肥胖及2 型糖尿病、冠心病、腦卒中等并發(fā)癥發(fā)病率逐年上升，帶來(lái)了沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。肥胖是由于長(zhǎng)期能量攝入過(guò)多，超過(guò)能量消耗導(dǎo)致的。而幾乎所有的能量攝入都發(fā)生在腸道［1］。目前關(guān)于高脂飲食（high fat diet，HFD）對(duì)腸道功能影響的研究，結(jié)果不完全一致［2-3］。

腸道是接觸食物的重要器官，因此腸道功能紊亂是HFD 導(dǎo)致疾病發(fā)生的主要原因［4］。然而，許多研究忽略了腸道是由不同的區(qū)域組成，具有不同的解剖和生理功能特征。因腸道組織結(jié)構(gòu)及腸道菌群分布的差異，不同腸段對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收也各不相同［5］，空腸是營(yíng)養(yǎng)吸收的主要區(qū)域，而回腸在免疫調(diào)節(jié)中起更重要的作用［6］。目前尚無(wú)關(guān)于HFD對(duì)不同部位小腸功能影響的研究。

本研究通過(guò)對(duì)小鼠空回腸上皮絨毛、隱窩形態(tài)、杯狀細(xì)胞數(shù)量和功能、干細(xì)胞增殖分化能力的研究，初步探討HFD 對(duì)不同部位小腸功能的影響，為空回腸在HFD 導(dǎo)致的肥胖及炎癥中的不同作用和機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性C57BL/6J 小鼠40 只，8 周齡（江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司），SPF級(jí)環(huán)境，溫度（23±1）℃。熒光定量PCR 儀ABI7000 StepOne?Plus（ABI公司，美國(guó)）。生長(zhǎng)因子EFG、R?spondin 1、Noggin 和Wnt3a（Pepro Tech 公司，美國(guó)），3D 培養(yǎng)基質(zhì)Matri?gel 356231（Corning公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建HFD小鼠模型

將小鼠隨機(jī)分配到正常飲食組（normal chow diet，NCD，n=20）或HFD 組（n=20），分別喂養(yǎng)3 個(gè)月。HFD熱卡來(lái)源組成：60%由脂肪提供，20%由碳水化合物提供，20%由蛋白質(zhì)提供。小鼠自由飲水，每周測(cè)量體重，記錄攝食情況。

1.2.2 小腸上皮組織分離

脫頸法處死小鼠后取出整個(gè)腸道（小腸：從幽門至回盲部連接；十二指腸：距幽門5 cm；空腸：中間段小腸的中間部10 cm，回腸：靠近回盲腸部的10 cm）。

1.2.3 石蠟切片及HE染色

4%甲醛固定24 h，修剪組織后脫水，依次進(jìn)行75%酒精4 h→85%酒精2 h→90%酒精1 h→無(wú)水乙醇Ⅰ30 min→無(wú)水乙醇Ⅱ30 min→醇苯5～10 min→二甲苯Ⅰ5～10 min→二甲苯Ⅱ5～10 min→蠟Ⅰ1 h→蠟Ⅱ1 h→蠟Ⅲ1 h。常規(guī)包埋。將包埋好的蠟塊置于切片機(jī)上切片，4℃冰箱保存。取石蠟切片，常規(guī)脫蠟，蘇木素染液3～5 min，然后伊紅染液中染色5 min。常規(guī)脫水后用中性樹(shù)膠封片。每組于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)HE染色的區(qū)域進(jìn)行觀察。

1.2.4 過(guò)碘酸希夫（periodic acid?Schiff，PAS）糖原染色

取小鼠小腸組織石蠟切片，常規(guī)包埋、復(fù)水。樣品滴加1%阿利新藍(lán)染液（pH 2.5），室溫放置10～20 min，沖洗1次，再用蒸餾水浸洗2次。滴加高碘酸溶液，室溫放置10 min。再次沖洗1次，再用蒸餾水浸洗2 次。滴加Schiff 試劑，室溫放置10～15 min。純水沖洗。逐級(jí)常規(guī)乙醇脫水后中性樹(shù)膠封固。每組于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)PAS 染色的組織隱窩區(qū)域進(jìn)行觀察。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取小鼠小腸組織，提取組織RNA，并測(cè)定RNA的含量和純度。將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA 為模板，用相關(guān)引物進(jìn)行RT?PCR 擴(kuò)增。實(shí)時(shí)定量PCR（ABI7000，StepOne?Plus，美國(guó)）?？偡磻?yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)；72～94 ℃，每升高0.5 ℃讀1 次制備熔解曲線。以actin 基因作為內(nèi)參，引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer seguences

1.2.6 小腸上皮分離隱窩及3D類器官培養(yǎng)

小鼠處死后冰上分離出10 cm腸管并縱行切開(kāi)，將小腸腔面的黏液及絨毛完整刮除后，用含100 U/mL青霉素，10 mg/mL鏈霉素的DPBS清洗4～5次直至上清液澄清。將處理過(guò)的小腸組織放入2 mmol/L EDTA消化液中，4 ℃搖床孵育直至充分螯合（60 min），用5 mL 移液槍用力吹打，直至50%～80%的隱窩單位從固有層脫落，收集富集隱窩的吹打液，70 μm過(guò)濾，4 ℃300g離心5 min，獲得隱窩沉淀。將隱窩沉淀與液體狀態(tài)的基質(zhì)膠Matrigel按1∶2混合，將含有隱窩單位的Matrigel 滴在24 孔培養(yǎng)板的孔中心，形成半球狀，聚合成固態(tài)的3D立體結(jié)構(gòu)。加入現(xiàn)配的完全培養(yǎng)液DMEM/F12（Gibco 公司，美國(guó)）、N2 Sup?plement（Life Technologies 公司，美國(guó)）、B27 Supple?ment（Life Technologies公司，美國(guó)）、GlutaMAX（Gibco公司，美國(guó)）、1 μmol/L N?乙酰半胱氨酸（Sigma?Al?drich公司，美國(guó)）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素（Gibco 公司，美國(guó)）、50 ng/mL EGF、1 μg/mL R?spondin1和100 ng/mL Noggin［7］。置于5%CO2，37 ℃細(xì)胞孵育箱培養(yǎng)，每天觀察，每48 h更換1次培養(yǎng)液。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HFD導(dǎo)致小鼠體重顯著增加

為了明確HFD 誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型是否構(gòu)建成功，對(duì)小鼠每周進(jìn)行稱重，結(jié)果顯示隨著HFD 時(shí)間的增加，小鼠體重明顯增加，與正常飲食組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1）。

圖1 小鼠體重Figure 1 Weight of mice

2.2 HFD影響小鼠空回腸絨毛、隱窩形態(tài)

為了研究HFD是否改變小腸上皮形態(tài)，對(duì)小鼠空回腸上皮組織進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)與NCD組相比，HFD組小鼠盡管空回腸的絨毛長(zhǎng)度沒(méi)有明顯改變，但空回腸的隱窩深度均明顯變淺（P＜0.001，圖2）。與NCD組相比，HFD組小鼠的空腸回腸單位面積內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化（圖3）。上述結(jié)果表明HFD影響了小腸上皮形態(tài)。

圖2 小腸上皮組織HE染色Figure 2 HE staining images of small intestinal epithelium

圖3 小腸杯狀細(xì)胞PAS染色Figure 3 PAS staining images of goblet cells

2.3 HFD影響小鼠空回腸干細(xì)胞的增殖分化能力

腸道上皮隱窩底部含有活躍的腸道干細(xì)胞，是腸道上皮在成體哺乳動(dòng)物各器官中更新最快的基礎(chǔ)［8］。為探究HFD對(duì)小鼠空回腸上皮干細(xì)胞增殖分化能力的影響，利用3D類器官原代培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了體外研究（圖4A）。結(jié)果顯示，與NCD 組比較，培養(yǎng)3 d后HFD組小鼠空腸形成類器官的類隱窩區(qū)域數(shù)目減少（P＜0.05，圖4B），而回腸形成類器官的類隱窩區(qū)域數(shù)目有增高趨勢(shì)（圖5B）。培養(yǎng)5 d 后，HFD組小鼠空腸形成類器官的類隱窩區(qū)域數(shù)目仍減少（圖4C），而回腸形成類器官的類隱窩區(qū)域數(shù)目明顯增加（P＜0.05，圖5C）。以上結(jié)果表明HFD對(duì)不同區(qū)域小腸上皮干細(xì)胞增殖分化能力的影響不同。

圖4 空腸3D類器官培養(yǎng)及形態(tài)分析Figure 4 3D organiod culture and morphological analysis of jejunum organoids

圖5 回腸3D類器官培養(yǎng)及形態(tài)分析Figure 5 3D organoid culture and morphological analysis of ileum organoids

2.4 HFD導(dǎo)致小鼠空回腸上皮凋亡基因表達(dá)改變

DNA 損傷或細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)P53 的表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、凋亡［9］。為明確HFD 對(duì)空回腸上皮細(xì)胞凋亡的作用，利用熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFD 組小鼠空腸細(xì)胞凋亡基因P53 的表達(dá)較NCD 組顯著下降（P＜0.001，圖6A），而回腸細(xì)胞凋亡基因P53的表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯差異。回腸細(xì)胞凋亡基因Bbc3、H2afx的表達(dá)較對(duì)照組顯著下降（P＜0.001、P＜0.01，圖6B），而空腸凋亡基因Bbc3、H2afx的表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯差異（圖6A），表明HFD導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞凋亡改變。

圖6 小鼠空回腸凋亡基因表達(dá)Figure 6 Apoptosis gene expression in jejunum and ileum of mice

3 討論

目前，HFD對(duì)小腸形態(tài)和功能影響的研究結(jié)果不完全一致。Beyaz等［3］發(fā)現(xiàn)，HFD喂養(yǎng)的小鼠小腸絨毛長(zhǎng)度減少，隱窩深度增加，干細(xì)胞的數(shù)量增加、自我更新能力增強(qiáng)。也有研究發(fā)現(xiàn)，在HFD喂養(yǎng)的Sox9?EGFP小鼠空腸絨毛長(zhǎng)度增加而隱窩深度無(wú)明顯變化，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，致使位于腸上皮表面的黏液層變薄，進(jìn)而使腸道屏障保護(hù)功能下降［2］。這些不一致的研究結(jié)果可能與小鼠的品系、年齡、HFD喂養(yǎng)時(shí)間、含量等不同有關(guān)。

不僅如此，眾所周知，小腸的不同區(qū)域具有不同的生理功能。十二指腸和空腸中的絨毛長(zhǎng)，大部分食物的消化吸收多發(fā)生于此。而回腸絨毛較短，除了吸收膽汁鹽和維生素B12 外，較少參與其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收［10］。與空腸相比，回腸上皮的特征是存在Peyer 斑塊，含有大量淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的淋巴濾泡，因此在免疫學(xué)上非常活躍［6］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，HFD 組空回腸的隱窩深度均明顯變淺。同時(shí)，HFD 組小鼠空腸干細(xì)胞培養(yǎng)3 d 后分化能力下降，凋亡相關(guān)基因P53的表達(dá)顯著下降，而回腸干細(xì)胞培養(yǎng)5 d后分化能力增加，凋亡相關(guān)基因Bbc3、H2afx表達(dá)顯著下降。證實(shí)HFD不僅導(dǎo)致小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收代償性減少，對(duì)空回腸干細(xì)胞增殖能力也存在差異。

小腸是人體中固定細(xì)胞更新率最快的部位之一，小腸上皮細(xì)胞不斷脫落更新，并且由隱窩底部的增殖層引導(dǎo)［11］。而小腸上皮細(xì)胞的更新是由小腸上皮細(xì)胞凋亡，小腸干細(xì)胞的增殖和分化共同調(diào)節(jié)的。小腸干細(xì)胞的數(shù)量和功能對(duì)于小腸健康起著至關(guān)重要的作用［12］。在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中，小腸干細(xì)胞發(fā)育成由多個(gè)細(xì)胞組成的類器官球形結(jié)構(gòu)，反映了小腸干細(xì)胞的存活和增殖。并且，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，類器官生長(zhǎng)并形成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，顯示出腔及類隱窩，包含干細(xì)胞和所有分化的腸上皮細(xì)胞［13］。因此，類器官是評(píng)價(jià)小腸干細(xì)胞增殖和分化能力的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)空回腸類器官的分別培養(yǎng)，對(duì)不同區(qū)域小腸干細(xì)胞增殖分化能力的差異進(jìn)行了研究。

已有研究表明，HFD可影響小腸干細(xì)胞微環(huán)境，導(dǎo)致小腸干細(xì)胞和部分祖細(xì)胞的功能發(fā)生改變［14］。小腸干細(xì)胞位于小腸隱窩基底部，隱窩深度可反映小腸干細(xì)胞活性和功能，同時(shí)小腸干細(xì)胞受隱窩及其周邊細(xì)胞組成的生態(tài)位的多種信號(hào)調(diào)控［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然HFD使小鼠空回腸的隱窩深度均明顯變淺，但在體外類器官培養(yǎng)中空回腸干細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯變化，空腸干細(xì)胞分化能力下降，而回腸干細(xì)胞分化能力增加。這種體內(nèi)外研究結(jié)果的不一致，可能是小腸干細(xì)胞功能在體內(nèi)時(shí)還受到周邊細(xì)胞組成的生態(tài)位影響。而類器官由多種不同細(xì)胞組成，并模擬體內(nèi)上皮的再生過(guò)程，更可以產(chǎn)生黏液，具有吸收和分泌的功能［17］。因此，相比于隱窩深度，類器官更能評(píng)估小腸干細(xì)胞的功能。飲食與腸道微生物的相互作用是通過(guò)腸道上皮實(shí)現(xiàn)的。本研究闡明HFD 對(duì)不同部位小腸功能的影響存在差異，為具體機(jī)制的研究提供警示，同時(shí)對(duì)后期定點(diǎn)監(jiān)測(cè)、靶向干預(yù)飲食誘導(dǎo)的小腸功能改變提供理論基礎(chǔ)。