西藏產(chǎn)綿頭雪兔子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

王喜錕 萬(wàn)玉瑩 蘭鈞 次旦多吉 達(dá)娃卓瑪**

（1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥藏藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850000）

綿頭雪兔子屬菊科風(fēng)毛菊屬植物綿頭雪兔子（Sau?ssurea laniceps Hand.-Mazz.）的干燥全草，藏文名為“恰果蘇巴”［1］。目前有關(guān)綿頭雪兔子的化學(xué)成分研究報(bào)道，綿頭雪兔子中主要含香豆素類、黃酮類、木脂素類、甾體類、糖類、生物堿類、萜類等化學(xué)成分［2-4］。有關(guān)于綿頭雪兔子［5-16］的藥理學(xué)研究報(bào)道，綿頭雪兔子所含的香豆素類、黃酮類、木脂素類等成分與其抗風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、強(qiáng)心、抗損傷、抗氧化及清除自由基、抗癌、終止妊娠等作用有關(guān)。另外還有研究報(bào)道綿頭雪兔子［17］揮發(fā)油成分主要為單萜、倍半萜、脂肪酸及其酯和一些長(zhǎng)鏈烷烴、烷醇和烷醛，還有一些芳香化合物等。

雪蓮花現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)?藏藥?第一冊(cè)》（以下簡(jiǎn)稱“95部頒”）中，僅收載了性狀及顯微鑒別，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)低，因此本項(xiàng)目對(duì)綿頭雪兔子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂提高研究，為該藥材質(zhì)量控制及合理利用資源提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DE；超級(jí)循環(huán)恒溫水浴箱：山西海金沙科技有限公司，型號(hào)：PTC-6；電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器，型號(hào)：DHG-9242A；馬弗爐：Yamato，型號(hào)：Fo610C；十萬(wàn)分之一天平：瑞士梅特勒公司，型號(hào)：AB204-S；十萬(wàn)分之一天平：瑞士梅特勒公司，型號(hào)：XP504；萬(wàn)用電爐：北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司，型號(hào)：DL-1；純水/超純水一體機(jī)：默克密理博，型號(hào)：Direct 16。

1.2 試藥

本實(shí)驗(yàn)收集到的11批綿頭雪兔子藥材，經(jīng)西藏自治區(qū)藏醫(yī)院格桑巴珠副主任藥師鑒定為菊科風(fēng)毛菊屬植物綿頭雪兔子（Saussurea laniceps Hand.-Mazz.）的干燥全草。東莨菪內(nèi)酯購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110768-200504 純度：100%；7-羥基香豆素購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111739-200501 純度：100%；色譜純乙腈；色譜純甲醇；自制超純水；分析純甲醇；分析純二氯甲烷；分析純冰醋酸；分析純甲酸。

表1 綿頭雪兔子樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀觀察

本品外形似綿球狀、圓柱狀或圓錐形，表面黃褐色、灰褐色或深灰色。莖長(zhǎng)7～25cm,基部有殘存的黑色葉基，呈覆瓦狀密集排列，膜質(zhì)；莖中部至頂端的葉片密集,皺縮卷曲，密被白色或褐色絨毛。完整葉片卵圓形、匙形、倒披針形或狹倒卵形,邊緣近全緣或齒狀。頭狀花序集生莖頂，呈半圓球形；花冠紫色、白色或紅紫色。稀見瘦果，具白色或黑褐色長(zhǎng)冠毛，密集成氈狀，形似灰白色絨球，直徑4～8mm；可見紫紅色或紫黑色的花柱和柱頭露于冠毛外，組成紫灰相間的斑點(diǎn)。氣淡，味微苦、澀。［1］

2.2 顯微鑒別

本品粉末黑褐色，伴有黃褐色棉毛。用水合氯醛透化，稀甘油裝片，置顯微鏡下觀察：非腺毛，極多，均由多細(xì)胞組成，粗細(xì)均勻，絞成團(tuán)狀，多已碎短。冠毛多見，軸多細(xì)胞組成，單細(xì)胞分枝眾多，內(nèi)層冠毛馬尾狀，單細(xì)胞形如非腺毛，但較直；外層冠毛刺毛狀，單細(xì)胞短圓錐形。花粉粒眾多，淡黃色，球形或類球形，直徑28.87～43.74μm，外壁有短刺及疣狀雕紋，萌發(fā)孔3個(gè)。

2.3 薄層鑒別

取綿頭雪兔子藥材粉末1g，加入甲醇50mL，超聲處理60min，濾過，作為供試品溶液。另取綿頭雪兔子對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取東莨菪內(nèi)酯和傘形花內(nèi)酯對(duì)照品，加甲醇制成每1mL 含0.1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502），吸取上述供試品溶液與對(duì)照藥材溶液6～10μL、對(duì)照品溶液3μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（25︰1︰0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365nm）下檢視。結(jié)果見圖3。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.4 水分測(cè)定

對(duì)照2020 年版《中國(guó)藥典》四部通則0832 第二法，共測(cè)定11 批次綿頭雪兔子，水分含量最低值6.57%，最高值11.25%（結(jié)果見表2），平均值為9.06%.以均值的120%為限，暫定水分限度為不得超過11.0%.

2.5 總灰分測(cè)定

共測(cè)定11 批次綿頭雪兔子，總灰分最低值7.12%，最高值為17.57%，其中17.57%數(shù)據(jù)過大，對(duì)計(jì)算結(jié)果影響過大，不予統(tǒng)計(jì)，其余數(shù)據(jù)平均值為9.06%（結(jié)果見表2），以均值的120%為限度，暫定總灰分限度為不得超過11.0%.

2.6 酸不溶性灰分

共測(cè)定11批次綿頭雪兔子，酸不溶性灰分最低值0.43%，最高值9.94%，其中9.94%數(shù)據(jù)過大，對(duì)計(jì)算結(jié)果影響過大，不予統(tǒng)計(jì)，其余數(shù)據(jù)平均值為1.52%（結(jié)果見表2），以均值的120%為限，暫定酸不溶性灰分限度為不得超過2.0%.

2.7 浸出物測(cè)定

熱浸法測(cè)定，用水作溶劑，共測(cè)定11 批次綿頭雪兔子浸出物，可知11批綿頭雪兔子的浸出物最低值為18.95%，最高值為34.88%（結(jié)果見表2），均值為30.37%，以均值的80%為限，暫定浸出物限度為不得少于24.0%.

表2 綿頭雪兔子檢查項(xiàng)以及浸出物含量測(cè)定（n=2）

2.8 高效液相色譜法測(cè)定傘形花內(nèi)酯含量

2.8.1 對(duì)照品溶液的制備。取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的傘形花內(nèi)酯對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.04mg的溶液，即得。

2.8.2 供試品溶液的制備。取綿頭雪兔子藥材粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，加熱回流1.5h，取出，放涼，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.8.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。色譜柱為Wa?ters XSelect CSH C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-1%冰乙酸溶液（10∶90）；檢測(cè)波長(zhǎng)為324 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。分別取“2.8.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、“2.8.2”項(xiàng)下供試品溶液以及空白對(duì)照溶液（甲醇），按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，待測(cè)成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，理論板數(shù)按傘形花內(nèi)酯計(jì)不低于3000，并且空白溶液對(duì)測(cè)定無干擾。說明該方法專屬性好。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的高效液相色譜圖見圖4。

2.8.4 線性關(guān)系考察。精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的傘形花內(nèi)酯對(duì)照品10.22mg，置100mL 容量瓶中，加甲醇溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備液，取續(xù)濾液1μL、3μL、5μL、7μL、9μL、11μL、13μL，注入液相色譜儀，測(cè)定含量，以傘形花內(nèi)酯進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線：

傘形花內(nèi)酯Y=5496817.1652X+10294.5714（R2=0.9998）

表明傘形花內(nèi)酯進(jìn)樣量在0.1022～1.3286μg 范圍內(nèi)與其峰面積積分值有良好的線性關(guān)系。

2.8.5 精密度試驗(yàn)。精密量取0.04896mg/mL 的對(duì)照品溶液10μL 注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD 值。結(jié)果，傘形花內(nèi)酯峰面積的RSD為0.96%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取XTZ-1 樣品約0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備方法處理，分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄每次測(cè)得的傘形花內(nèi)酯的峰面積并計(jì)算峰面積RSD 值。結(jié)果，傘形花內(nèi)酯峰面積的RSD 為1.84%（n=6），表明該供試品溶液在室溫12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。取XTZ-1 樣品約0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備方法處理，平行取樣測(cè)定6 次，測(cè)定峰面積，計(jì)算每次測(cè)得傘形花內(nèi)酯的0.5g 相對(duì)峰面積的RSD 值。結(jié)果，傘形花內(nèi)酯的0.5g平均相對(duì)峰面積RSD為2.19%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)。取已知傘形花內(nèi)酯含量的XTZ-7樣品6 份，每份約0.25g，精密稱定，按已知含量（4.26mg/ml）供試品待測(cè)成分含量的100%精密加入傘形花內(nèi)酯濃度為0.02036mg/ml 的對(duì)照品溶液50ml（含傘形花內(nèi)酯1.018mg），按供試品溶液制備方法處理，得相關(guān)溶液，進(jìn)液相色譜儀處理，計(jì)算傘形花內(nèi)酯含量及加樣回收率。結(jié)果，傘形花內(nèi)酯的平均回收率為94.46%，RSD 為0.36%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果如表3。

表3 加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.8.9 樣品測(cè)定。按“2.8.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別測(cè)定11 批樣品。結(jié)果XTZ-1～XTZ-11 傘形花內(nèi)酯含量依次為1.13%、0.47%、0.25%、0.28%、0.24%、0.25%、0.43%、0.18%、0.24%、0.21%、0.27%（按干燥品計(jì)），最高值為1.13%，最低值為0.18%，因XTZ-1 的含量過大，與其他樣品含量相差較大，計(jì)入統(tǒng)計(jì)影響結(jié)果，因此不將其納入統(tǒng)計(jì)范圍，其余樣品含量平均值為0.28%，以均值的80%為限度，暫定綿頭雪兔子傘形花內(nèi)酯含量按干燥品計(jì)算，不得少于0.22%.

3 討論

3.1 綿頭雪兔子藥材的檢查項(xiàng)及浸出物含量測(cè)定

95部頒中，沒有收載雪蓮花的各檢查項(xiàng)及浸出物項(xiàng)。因此，在本次對(duì)綿頭雪兔子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提高研究中，針對(duì)綿頭雪兔子的各檢查項(xiàng)及浸出物進(jìn)行了研究。各檢查項(xiàng)與浸出物項(xiàng)按照2020 年版《中國(guó)藥典》［17］各項(xiàng)規(guī)定進(jìn)行測(cè)定。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［18］，綿頭雪兔子中揮發(fā)油含量不高，僅不到1%，因此水分測(cè)定選擇了操作簡(jiǎn)單的烘干法進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于浸出物測(cè)定項(xiàng)，分別考察了不同濃度的乙醇溶液和純化水，以熱浸法和冷浸法分別提取，比較各組結(jié)果，最終發(fā)現(xiàn)，用水作溶劑，熱浸法提取，綿頭雪兔子的浸出物最高。

3.2 定性與定量對(duì)照物質(zhì)的選擇

本文通訊作者在對(duì)綿頭雪兔子主要成分分析研究［2］過程中發(fā)現(xiàn)，香豆素類成分是綿頭雪兔子的主要化學(xué)成分，其中東莨菪內(nèi)酯和傘形花內(nèi)酯的含量相對(duì)較高［3］，因此擬以上述對(duì)照品建立薄層色譜鑒別方法，又選擇了含量相對(duì)比較高的傘形花內(nèi)酯，作為綿頭雪兔子含量測(cè)定項(xiàng)的指標(biāo)成分，為綿頭雪兔子及其研制產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

3.3 薄層色譜條件的探索

在對(duì)綿頭雪兔子的薄層色譜鑒別研究中，參考了有關(guān)傘形花內(nèi)酯的薄層色譜鑒別研究文獻(xiàn)［19］，并參考其他關(guān)于薄層色譜鑒別的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［20-22］，最終發(fā)現(xiàn)，三氯甲烷-甲醇體系，對(duì)于傘形花內(nèi)酯和東莨菪內(nèi)酯的展開較好。又考慮到三氯甲烷的毒性相對(duì)較大，因此將三氯甲烷更換為二氯甲烷來進(jìn)行展開，展開條件為二氯甲烷-甲醇（25︰1）。在方法探索過程中發(fā)現(xiàn)存在拖尾現(xiàn)象，考慮加入少量的甲酸，以防拖尾，最終確定薄層鑒別展開系統(tǒng)為二氯甲烷-甲醇-甲酸（25︰1︰0.1），在硅膠G板上進(jìn)行展開。并且，后續(xù)又對(duì)薄層鑒別項(xiàng)進(jìn)行了方法學(xué)研究，對(duì)點(diǎn)樣量、不同規(guī)格的薄層板以及在不同濕度溫度條件下進(jìn)行了展開，發(fā)現(xiàn)結(jié)果并沒有明顯差異。說明該方法耐用性好。

3.4 HPLC測(cè)定方法的探索

在對(duì)HPLC 測(cè)定方法探索選擇的過程中，筆者對(duì)供試品提取方法、提取溶劑以及提取時(shí)間做了相應(yīng)的考察。最終通過所測(cè)得的含量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，選擇了甲醇回流90min 作為最佳的供試品提取方法。接著，以文獻(xiàn)作為參考［23-28］，考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫、甲醇-1%冰乙酸（30︰70）、乙腈-1%冰乙酸（15︰85）、乙腈-1%冰乙酸（10︰90）幾個(gè)系統(tǒng)，根據(jù)所得色譜圖結(jié)果，綜合考慮出峰時(shí)間、分離度等因素，最終選擇以乙腈-1%冰乙酸（10︰90）作為HPLC 測(cè)定方法。根據(jù)傘形花內(nèi)酯紫外吸收波長(zhǎng)，選擇324nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。并且通過方法學(xué)考察研究，結(jié)果顯示該方法符合含量測(cè)定項(xiàng)要求。

綜上所述，本研究就顯微鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物項(xiàng)對(duì)綿頭雪兔子進(jìn)行了測(cè)定，建立了綿頭雪兔子中傘形花內(nèi)酯和東莨菪內(nèi)酯的薄層色譜鑒別方法，并針對(duì)綿頭雪兔子所含傘形花內(nèi)酯的含量建立了HPLC 測(cè)定方法，為西藏產(chǎn)綿頭雪兔子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提高提供依據(jù)，為西藏產(chǎn)雪蓮花的質(zhì)量控制提供參考。