參白方中總多糖與總皂苷提取工藝的研究

簡(jiǎn)鳳嬌，李孝棟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，截至2019年，全球新增癌癥病例2 360 萬(wàn)例，以化療為主的腫瘤治療過(guò)程中，骨髓抑制是最常見(jiàn)的毒副反應(yīng)，而白細(xì)胞減少癥是骨髓抑制的突出表現(xiàn)［1-2］。臨床上，西醫(yī)治療白細(xì)胞減少癥的方法主要有口服或注射升白藥物、成分輸血以及胚胎干細(xì)胞移植等，短期療效確切，但常伴有不良反應(yīng)且費(fèi)用昂貴［3-4］。中藥具有多靶點(diǎn)、長(zhǎng)效、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，但存在使用周期長(zhǎng)、見(jiàn)效慢的缺點(diǎn)，而由有效部位組成的中藥制劑可提高中藥的治療效果［5］。本研究中的參白方出自譚支紹教授主編的《藥用寄生》，方中取銀耳12 g、絞股藍(lán)45 g、黃芪和黨參各30 g 用清水共煎煮，長(zhǎng)期服用可防治癌癥放化療導(dǎo)致的白細(xì)胞減少癥［6］。參白方的傳統(tǒng)提取工藝雖然簡(jiǎn)單，但有效成分提取不完全，起效慢。通過(guò)前期文獻(xiàn)查閱與預(yù)實(shí)驗(yàn)［7-10］，表明總多糖與總皂苷是參白方的主要有效部位。故本研究先采用水提醇沉的方法提取參白方中銀耳、黃芪和黨參中的總多糖，再將藥渣與絞股藍(lán)合并，先乙醇回流提取后再用水飽和正丁醇萃取獲得總皂苷。以總多糖和總皂苷的提取率及含量作為正交優(yōu)化總多糖和總皂苷的提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，為參白方的制劑研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-9600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；AR-2140 十萬(wàn)分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥 乙醇（湖南湘易康制藥有限公司，批號(hào)：100320170322）；香草醛（北京市芳草醫(yī)藥化工研制公司，批號(hào)：860718）；人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703201933，純度≥98.0%）、D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833200302，純度≥98.0%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；分析純冰醋酸（批號(hào)：2102191）、正丁醇（批號(hào)：1601011）、苯酚（批號(hào)：171116）均購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；甲醇（批號(hào)：20190320）、高氯酸（批號(hào)：10076732）、濃硫酸（批號(hào)：20201222）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。黃芪、絞股藍(lán)、銀耳、黨參均購(gòu)自福州閩侯上街致誠(chéng)藥店，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室黃澤豪副教授鑒定為合格藥材，符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 總多糖含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取銀耳2.0 g、黃芪和黨參各 5.0 g，浸泡 30 min，加入 25 倍水煎煮 3次，每次4 h，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL；加入4 倍量95%乙醇，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，濾餅干燥即得總多糖粗品；精密稱取總多糖粗品5.06 mg 于50 mL 量瓶中，加蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，即得每1 mL 含0.101 mg 總多糖的供試品溶液，備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品25.13 mg 于25 mL 量瓶中，加蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，即得每1 mL 含1.005 mg 的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 10 mL 量瓶中，加入新配的5%苯酚溶液1 mL，搖勻，再加入濃硫酸5 mL，沸水浴加熱15 min 后，取出，置冰水浴冷卻10 min，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，隨行空白。以對(duì)照品濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y＝8.45x＋7.92×10-2，r＝0.998 3。結(jié)果表明：D-無(wú)水葡萄糖在0.010 0～0.060 3 mg/mL 濃度范圍與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 量取同一份對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法，重復(fù)測(cè)定吸光度值6次。測(cè)得吸光度的平均值為0.450，RSD為0.86%，結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性考察 分別制備6 份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行測(cè)定吸光度值，計(jì)算供試品溶液中總多糖平均含量為43.114%，RSD為0.62%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 量取同一份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法，分別在0、15、30、45、60、90、120 min時(shí)測(cè)定吸光度值。測(cè)得吸光度平均值為0.431，RSD為1.08%，結(jié)果表明供試品溶液在2 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取6 份已知含量的供試品溶液各0.5 mL，分別加入對(duì)照品溶液各20 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值。結(jié)果見(jiàn)表1，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 總皂苷含量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取絞股藍(lán)7.5 g，合并多糖提取濾渣，加入8倍量由“2.1.1”項(xiàng)下所得醇沉液配制的80%乙醇，浸泡30 min，提取2 h，過(guò)濾；濾渣再加入8 倍量80%乙醇，同法提取，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL；每次加入3 倍量水飽和正丁醇，共萃取3次，取正丁醇層，回收正丁醇，干燥即得總皂苷粗品；將所得總皂苷粗品適量溶于25 mL量瓶中，加入蒸餾水稀釋至刻度，即得每1 mL 含1 mg 的總皂苷的供試品溶液，備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品10.04 mg 置于25 mL 量瓶中，加入甲醇溶解，稀釋至刻度，即得每1 mL 含0.402 mg 的人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液，備用。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于10 mL 量瓶中，100℃水浴揮干后，冷卻，加入新配的5%香草醛溶液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，60℃水浴加熱15 min，取出，立即用冰水冷卻，精密加入冰醋酸5 mL 后，用紫外分光光度計(jì)于550 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，隨行空白。以對(duì)照品濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y＝1.01×10-2x－1.02×10-2，r＝0.999 1。結(jié)果表明：人參皂苷Rg1 在0.016 1～0.064 3 mg/mL 濃度范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 量取同一份對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法，重復(fù)測(cè)定吸光度值6次。測(cè)得吸光度的平均值為0.393，RSD為0.45%，結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性考察 分別制備6 份供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行測(cè)定吸光度值，計(jì)算供試品溶液中總皂苷平均含量為33.639%，RSD為0.28%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 量取同一份供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法，分別于0、15、30、45、60、90、120 min時(shí)測(cè)定吸光度值。測(cè)得吸光度平均值為0.287，RSD為1.06%，結(jié)果表明供試品溶液在2 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取6 份已知含量的供試品溶液各1.5 mL，分別加入人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液各0.1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值。結(jié)果見(jiàn)表2，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 總多糖提取的正交試驗(yàn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間（A）、提取次數(shù)（B）、料液比（C）為考察因素，平行操作條件下，以總多糖的提取率與含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表3。分別稱取9 份銀耳2.0 g，黨參、黃芪各5.0 g，根據(jù)正交因素水平表，按“2.1.1”項(xiàng)下方法提取得總多糖粗品。精密量取0.1 mg/mL 總多糖溶液1 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法，測(cè)定總多糖的吸光度值，并計(jì)算總多糖含量。結(jié)果見(jiàn)表4～表5。

表3 總多糖提取的正交試驗(yàn)因素水平表

表4 總多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 總多糖提取的正交試驗(yàn)方差分析表

由表5 方差分析可知：提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比對(duì)總多糖含量影響均不顯著（P＞0.05），選擇的3 個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，由大到小為A＞B＞C，總多糖的優(yōu)選提取工藝條件為A3B3C2，即料液比為1∶20，提取3次，每次4 h，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL，加入4 倍量95%乙醇，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，濾餅干燥即得總多糖粗品。

2.3.2 總皂苷提取的正交試驗(yàn) 根據(jù)相關(guān)資料與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間（A）、提取次數(shù)（B）、乙醇濃度（C）、料液比（D）為考察因素，平行操作條件下，以總皂苷的提取率與含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表6。分別稱取9份絞股藍(lán)7.5 g，根據(jù)正交因素水平表，按“2.2.1”項(xiàng)下方法提取得總皂苷粗品。精密量取1 mg/mL 總皂苷溶液1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法，測(cè)定吸光度值并計(jì)算總皂苷含量。結(jié)果見(jiàn)表7～表8。由方差分析可知：提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇濃度、料液比對(duì)總皂苷含量影響均不顯著（P＞0.05），選擇的4個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，由大到小為B＞C＞D＞A，總皂苷的最佳提取工藝條件為A3B2C2D1，即料液比為1∶8，用80%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL，每次加入3 倍量水飽和正丁醇，共萃取3次，取正丁醇層，回收正丁醇，干燥即得總皂苷粗品。

表6 總皂苷提取的正交試驗(yàn)因素水平表

表7 總皂苷提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

表8 總皂苷提取的正交試驗(yàn)方差分析表

2.4 工藝驗(yàn)證 分別稱取3 份與正交試驗(yàn)相同批次的各個(gè)藥材，分別按“2.3.1 ”與“2.3.2 ”項(xiàng)下方法提取總多糖粗品與總皂苷粗品，并計(jì)算其提取率與含量。結(jié)果見(jiàn)表9～表10。

表9 總多糖最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證結(jié)果

表10 總皂苷最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證結(jié)果

所得結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果最大值比較，相差不大，由此可判斷，優(yōu)選的工藝可行、穩(wěn)定。

3 討 論

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，但因其成分眾多、復(fù)雜，也造成了中藥制劑服用量大，起效慢，故分離純化中藥有效成分或部位，減量增效是中藥現(xiàn)代化開(kāi)發(fā)的有效思路之一。通過(guò)文獻(xiàn)的查閱，對(duì)參白方中各藥味有效部位的分析，結(jié)合前期藥效預(yù)實(shí)驗(yàn)，表明參白方中總多糖和總皂苷具有升高白細(xì)胞水平的作用，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)參白方中總多糖和總皂苷的提取進(jìn)行工藝優(yōu)化研究。傳統(tǒng)中藥復(fù)方的提取液中成分眾多，給有效成分的分離純化帶來(lái)諸多不便。而本實(shí)驗(yàn)在提取階段便分離出所需的有效部位粗品，為后期進(jìn)一步純化處理奠定基礎(chǔ)。

參白方中提取的總多糖為粗多糖，硫酸能夠?qū)⒍嗵窍人鉃閱翁?，并迅速脫水生成糖醛衍生物，并與苯酚生成橙黃色化合物，采用硫酸-苯酚法能夠準(zhǔn)確測(cè)定總多糖的含量，同時(shí)可以避免粗總多糖中蛋白的影響，且顯色較為穩(wěn)定［11］。結(jié)合文獻(xiàn)以及2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)多糖的含量測(cè)定，以D-無(wú)水葡萄糖作為指標(biāo)成分。參白方中提取的總皂苷主要以絞股藍(lán)皂苷為主，而人參皂苷Rg1是絞股藍(lán)皂苷中具有升高白細(xì)胞水平作用的主要成分之一［12］，故以人參皂苷Rg1為總皂苷含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

總多糖與總皂苷提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以含量和提取率為評(píng)分指標(biāo)，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)綜合評(píng)分權(quán)重為含量占比70%，提取率占比30%。主要考慮到本實(shí)驗(yàn)提取的總多糖和總皂苷為粗品，其含量能反映該提取工藝對(duì)后期分離純化的影響；同時(shí)以提取率作為輔助指標(biāo)，能全面反映提取工藝的優(yōu)劣。在前期的單因素實(shí)驗(yàn)中，分別考察了提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）和料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對(duì)銀耳、黃芪和黨參中總多糖提取的影響，結(jié)果表明：隨著提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比的增加，總多糖的得率及含量逐漸增加，分別在提取4 h、提取3次和料液比為1∶25 時(shí)達(dá)到峰值，而提取 3 h 和 5 h 對(duì)總多糖提取的影響相當(dāng)，考慮時(shí)間成本，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化的因素和水平。同樣，分別考察了提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）、料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14）和乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）對(duì)參白方中總皂苷回流提取的影響，結(jié)果表明：分別在提取2次和料液比為1∶10 之后，總皂苷的提取率在逐漸下降，而提取2 h 和乙醇濃度為80%時(shí)，最有利于總皂苷的提取，故設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化總皂苷提取的因素和水平。

總皂苷提取工藝優(yōu)化結(jié)果表明：回流提取次數(shù)對(duì)總皂苷的提取影響較大，提取時(shí)間與料液比影響較小，如果考慮到節(jié)約試劑和時(shí)間成本，可以適當(dāng)調(diào)整提取時(shí)間和料液比。從本次正交試驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)：總多糖的提取率達(dá)到15%，總皂苷提取率可達(dá)12%，含量為30%～50%，可根據(jù)需要考慮是否進(jìn)一步純化，以提高總多糖與總皂苷的含量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)參白方中多個(gè)有效部位提取工藝的優(yōu)化能為中藥復(fù)方的提取工藝提供有益啟示，也為中藥制劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。