跑臺運動和二甲雙胍在改善2型糖尿病小鼠血管炎癥中的作用及機制研究

姬麗麗，王 丹，江東謀，余蓉蓉，許桂清，王少兵，劉一平*

糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的常見且高發(fā)的代謝性疾病。血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥，是其導致患者致殘、致死的主要原因。目前，我國糖尿病患病人數(shù)居于全球首位，因此，防控糖尿病血管病變刻不容緩。2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）機體內(nèi)糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、氧化應激以及炎癥反應相互作用，導致血管內(nèi)皮功能障礙，促進動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生與發(fā)展。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）是一氧化氮（nitric oxide，NO）合成的關(guān)鍵酶，NO和內(nèi)皮素-1（endothelin 1，ET-1）是血管內(nèi)皮細胞分泌的具有拮抗作用的血管活性因子，NO/ET-1的失衡可促進糖尿病血管損傷與病變，因此，eNOS在維持血管功能中起著重要作用。在體內(nèi)，低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）的氧化修飾主要發(fā)生在動脈管壁（潘玉婷等，2014）。在糖尿病氧化應激狀態(tài)下，LDL易被氧化成氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）。凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1）是一種Ⅱ型單鏈跨膜蛋白，屬于C型凝集素家族分子，是介導內(nèi)皮細胞攝取ox-LDL的主要受體。研究表明，LOX-1介導血管內(nèi)皮細胞攝取ox-LDL后，其脂質(zhì)成分可通過損傷內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)、誘導血管炎癥反應、降低血管舒張功能等導致內(nèi)皮功能損傷（徐雅琴等，2000），促進AS的發(fā)生發(fā)展，但其作用機制尚未明確。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是調(diào)控轉(zhuǎn)錄多種炎性因子的中心環(huán)節(jié)和共同通路，參與調(diào)控炎癥反應、免疫反應、凋亡及細胞增殖與分化。NF-κBp65發(fā)生核轉(zhuǎn)位時，可激活下游炎癥靶基因表達。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine-dependent aspartatedirected proteases-3，caspase-3）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成員介導的蛋白酶級聯(lián)反應下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分（董雅潔 等，2012）。因此，本研究首先以NF-κBp65和Caspase-3探討ox-LDL、LOX-1對T2DM血管炎癥及細胞凋亡的影響。

目前，T2DM的治療以控制血糖為主，二甲雙胍是一種具有胰島素增敏效應的口服降糖藥，在控制血糖和預防糖尿病心血管并發(fā)癥中具有良好效果，成為眾多國家和組織控制T2DM的一線用藥。由于T2DM及其血管病變是血糖血脂代謝紊亂的多因素結(jié)果，有氧運動具有改善糖脂代謝、減少心血管危險因素、延緩血管損傷等作用，已成為防控糖尿病及其血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)療法。研究報道，有氧運動可提高糖尿病胰島素敏感性，控制血糖，減輕血清白介素-1β（interleukin-l-beta，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）水平，下調(diào)主動脈 NF-κBp65基因及蛋白表達，改善血管內(nèi)皮功能（李俊等，2019；劉一平等，2007）。那么，作為胰島素增敏劑的二甲雙胍與可改善糖脂代謝紊亂的有氧運動對T2DM血管損傷的保護作用機制是否存在異同呢？本研究以ox-LDL、LOX-1為切入點，在探討T2DM血管炎癥損傷的基礎(chǔ)上，進一步比較有氧運動和二甲雙胍對T2DM血管保護效應的異同，評價有氧運動和二甲雙胍對T2DM血管脂代謝、炎癥反應的影響，并探討其影響的可能途徑。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物與分組

2周齡清潔級雄性C57BL/6J小鼠69只（吳氏實驗動物中心提供），體質(zhì)量12～15 g，健康狀況良好，合格證號：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)房室溫：（24±1）℃，濕度：50%～60%，晝夜循環(huán)12 h：12 h。所有小鼠普通飼料適應性喂養(yǎng)一周。小鼠隨機分為8組，具體如下：正常組（N，n=8）、正常對照組（NC，n=8）、正常跑臺運動組（NE，n=8）、T2DM組（D，n=9）、T2DM對照組（DC，n=9）、T2DM跑臺運動組（DE，n=9）、T2DM二甲雙胍組（DM，n=9）、T2DM跑臺運動＋二甲雙胍組（DEM，n=9）。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，T2DM造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)（64.8%基礎(chǔ)飼料，15%蔗糖，15%豬油，5%蛋黃粉，0.2%膽酸鈉）。

1.2 T2DM小鼠模型制備

采用高脂飲食和多次小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素制備T2DM小鼠模型（馮潤等，2017）。高脂飼料自由進食4周，禁食12～14 h，稱量小鼠空腹體質(zhì)量，連續(xù)3天以40 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素[STZ溶于0.1 mmol/L冰檸檬酸緩沖液（pH=4.4），現(xiàn)配現(xiàn)用，避光放置，30 min內(nèi)完成注射]，常規(guī)飼養(yǎng)的正常組腹腔注射相同劑量的檸檬酸緩沖液。注射后第7、14天，在小鼠尾靜脈采血測其血糖，最終隨機血糖≥16.7 mmol/L確定為糖尿病模型。依據(jù)小鼠腹腔糖耐量實驗和血清胰島素水平判斷其是否為T2DM模型。每天觀察小鼠的活動狀態(tài)和飲食情況，造模成功后每周記錄小鼠的血糖變化。

1.3 運動干預方案

依據(jù)Fernando等（1993）制作的跑速與最大攝氧量（V˙O2max）對應表，運動組小鼠進行 8 周 12 m/min（75%V˙O2max）跑臺運動干預。運動組小鼠先進行一周適應性跑臺運動，之后以60 min/次、5天/周，進行8周正式運動干預。適應性運動方案：第一天8 m/min，25 min，第二天8 m/min，30 min，第三天8 m/min，40 min，第四天10 m/min，40 min，之后以12 m/min、40 min進行3天的跑臺干預。正式運動干預分為4部分：熱身期（5 min）、中間期（10 min）、主負荷期（40 min）、恢復期（5 min）。熱身期和恢復期的速度均為8 m/min，中間期將速度逐漸增加到12 m/min，在主負荷期以12 m/min運動強度進行40 min的運動干預。

1.4 給藥方案

參考陳致瑜等（2017）的研究，二甲雙胍給藥劑量為200 mg/（kg·天），給藥體積為0.05 ml/10 g體質(zhì)量，每周根據(jù)小鼠體質(zhì)量調(diào)整灌胃劑量。

1.5 腹腔糖耐量實驗

小鼠空腹12～14 h，尾部靜脈采血測其空腹血糖，然后按照1.5 g/kg體質(zhì)量給予小鼠腹腔注射50%葡萄糖注射液，于注射后15、30、60、120 min尾部靜脈取血，測其血糖水平，以近似梯形的計算公式計算其曲線下面積。

1.6 樣品制備

按照0.1 ml/10 g體質(zhì)量劑量腹腔注射10%水合氯醛，待小鼠完全麻醉，摘眼球取血，室溫靜置20 min，4℃離心機3 000 r/min離心25 min，吸取上層血清，-20℃保存?zhèn)溆?。打開小鼠胸腹部，迅速剝離主動脈，放入-80℃冰箱里冷凍，用于Western blot實驗。

1.7 血清指標檢測

血糖采用羅氏血糖儀和配套血糖試紙進行尾部采血檢測；脂質(zhì)指標采用相應試劑盒檢測；NO采用硝酸還原酶法檢測；胰島素、TNF-α、IL-1β、ET-1采用ELISA法檢測。

1.8 Western Blot法

用10 mg組織加入100 ul含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，提取主動脈總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。制備凝膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，4℃搖床孵育一抗過夜。次日TBST清洗一抗3次（10 min/次），二抗室溫孵育2 h，TBST清洗二抗3次（10 min/次）。之后，進行雙色紅外激光成像與分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗或One-way ANOVA，所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。P＜0.05表示具有顯著差異，P＜0.01表示具有極顯著差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 T2DM小鼠模型構(gòu)建

2.1.1 空腹胰島素水平和腹腔糖耐量實驗

與N組相比，D組空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）水平和腹腔糖耐量實驗的時間-血糖曲線下面積（area under curve，AUC）顯著升高（P＜0.01；圖1）。D組各時間點血糖水平遠高于N組。120 min時，N組血糖恢復到0 min時的血糖水平，D組血糖明顯高于0 min時的血糖水平。

圖1 空腹胰島素水平和腹腔糖耐量實驗Figure 1.Fasting Insulin Level and Intraperitoneal Glucose Tolerance Test

2.1.2 N組和D組小鼠主動脈eNOS、ox-LDL、LOX-1、NF-κBp65、VCAM-1、Caspase-3蛋白表達變化

如圖2所示，與N組相比，D組ox-LDL、LOX-1及NF-κBp65蛋白表達顯著增加（P＜0.01，P＜0.05），eNOS、血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和Caspase-3蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 N組和D組主動脈eNOS、ox-LDL、LOX-1、NF-κBp65、VCAM-1、Caspase-3蛋白表達Figure 2.Results of Protein Expression ofAortic ENOS，Ox-LDL，LOX-1，NF-κBp65，VCAM-1，Caspase-3 in N and D Groups

2.2 T2DM建模9周后糖脂代謝、炎癥狀態(tài)、血管功能比較

如表1顯示，與N組相比，D組空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、FINS、胰島素抵抗（HOMA-insulin resistance，HOMA-IR）、胰島素敏感性指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）顯著升高（P＜0.01），高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）顯著降低（P＜0.05），TNF-α、IL-1β、NO、ET-1、NO/ET-1無顯著性差異（P＞0.05）。與D組相比，DC組FBG、HOMA-IR、TG、HDL-C、TNF-α、ET-1顯著升高（P＜0.01），ISI、HDL-C、NO、NO/ET-1顯著降低（P＜0.01），F(xiàn)INS、TC、LDL-C、IL-1β無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 T2DM小鼠建模9周后糖脂代謝、炎癥狀態(tài)與血管功能情況Table 1 Glucolipid Metabolism，Inflammatory Status and Vascular Function in T2DM Mice after 9 Weeks M±SD，n=5～9

2.3 跑臺運動和二甲雙胍對T2DM小鼠糖脂代謝、炎癥狀態(tài)、血管功能的影響

圖3顯示，干預周期內(nèi)，NC組和NE組血糖維持在穩(wěn)定狀態(tài)，DC組、DE組、DM組和DEM組血糖明顯高于NC組和NE組，DC組血糖呈逐漸升高趨勢。干預前5周內(nèi)，DE組、DM組和DEM組血糖水平維持在穩(wěn)定狀態(tài)；5周后，DE組、DM組和DEM組血糖呈逐漸下降趨勢，DE組整體血糖高于DM組和DEM組。表2顯示，與NC組比，DC組FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、TNF-α、IL-1β、ET-1顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），ISI、HDL-C、NO、NO/ET-1顯著降低（P＜0.01）。與DC組比，DE組、DM組和DEM組 FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、TNF-α、IL-1β、ET-1顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），ISI、HDL-C顯著升高（P＜0.01）；DE組和DEM組NO、NO/ET-1顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），DM組NO、NO/ET-1無顯著性差異（P＞0.05）。與 DE組比，DM 組 ET-1顯著升高（P＜0.01）；DEM 組 TC、TNF-α、ET-1顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），NO/ET-1顯著升高（P＜0.01）。與DM組比，DEM組FINS、HOMA-IR、TG、LDL-C、ET-1顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），ISI、HDL-C、NO/ET-1顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。

表2 T2DM小鼠糖脂代謝、炎癥狀態(tài)、血管功能Table 2 Glucolipid Metabolism，Inflammatory Status and Vascular Function in T2DM Mice M±SD，n=5～8

圖3 各組小鼠干預周期內(nèi)血糖水平（M±SD，n=7～9）Figure 3.Blood Glucose Levels of Mice in Each Group during the Intervention Period

2.4 跑臺運動和二甲雙胍對T2DM小鼠主動脈eNOS、ox-LDL、LOX-1、NF-κBp65、VCAM-1、Caspase-3蛋白的影響

圖4顯示，與NC組比較，NE組、DEM組eNOS蛋白表達顯著升高（P＜0.01），DC組eNOS蛋白表達顯著降低（P＜0.01），DE組、DM組eNOS蛋白表達無顯著差異（P＞0.05）；NE組 ox-LDL、NF-κBp65和 VCAM-1蛋白表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），LOX-1和Caspase-3蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）；DC組、DE組、DM組和DEM組ox-LDL、LOX-1、NF-κBp65和VCAM-1蛋白表達顯著升高；DC組和DM組Caspase-3蛋白表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），DE組和DEM組無顯著性差異（P＞0.05）。與DC組比較，DE組、DM組和DEM組eNOS蛋白表達顯著升高（P＜0.01），ox-LDL、LOX-1、NF-κBp65和Caspase-3蛋白表達均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；DE組和DEM組VCAM-1蛋白表達顯著降低（P＜0.01），DM組VCAM-1蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）。DE組和DM組相比，DEM組eNOS蛋白表達顯著增加（P＜0.01），ox-LDL、LOX-1、NF-κBp65和 Caspase-3蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。與DE組相比，DEM組VCAM-1蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）；與DM組相比，DEM組VCAM-1蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。

圖4 各組小鼠主動脈eNOS、ox-LDL、LOX-1、NF-κBp65、VCAM-1、Caspase-3蛋白表達Figure 4.Protein Expression ofAortic ENOS，Ox-LDL，LOX-1，NF-κBp65，VCAM-1，Caspase-3 among NC NE，DC，DE，DM，and DAM Groups

3 分析與討論

3.1 高脂聯(lián)合STZ誘導的T2DM小鼠早期血管發(fā)生炎性反應

高脂飲食聯(lián)合低劑量STZ多次腹腔注射誘導的T2DM小鼠模型與人類T2DM有相似的病理結(jié)構(gòu)和生化特點（曾位森 等，2014）。T2DM通常表現(xiàn)出高TG、高LDL-C、低HDL-C。在機體代謝應激狀態(tài)下，LDL易被氧化成ox-LDL。ox-LDL對內(nèi)皮細胞具有毒性作用，可誘導中性粒細胞黏附于內(nèi)皮細胞（Alouffi et al.，2018），促進巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（Yao et al.，2013），導致血管功能障礙。LOX-1作為介導內(nèi)皮細胞攝取ox-LDL的主要受體，ox-LDL/LOX-1/ROS通路的激活可促進各種絲裂原激活蛋白激酶類、NF-κB和黏附分子的表達，促進炎癥因子、生長因子和趨化因子的產(chǎn)生（Nègre-Salvayre et al.，2017）。本研究顯示，實驗誘導的T2DM小鼠早期隨機血糖、FINS顯著升高；TC、TG、LDL-C顯著升高，HDL-C顯著降低；主動脈ox-LDL、LOX-1和NF-κBp65蛋白表達顯著升高，eNOS、VCAM-1、Caspase-3蛋白表達無顯著性差異，說明該模型小鼠糖脂代謝紊亂，胰島素抵抗，血管處于炎性狀態(tài)但還未發(fā)生明顯的炎性損傷。

大量流行病學數(shù)據(jù)顯示，糖尿病是多種心血管疾病的獨立危險因素，高血糖會增加心血管疾病的風險，但血糖控制并不能顯著降低心血管疾病的發(fā)生率（Meigs et al.，2003），說明糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生還存在血糖之外的因素。本研究中，T2DM小鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)9周后，其血清TC、TG、LDL-C顯著升高，HDL-C顯著降低，脂代謝紊亂進一步加重；TNF-α和IL-1β顯著升高，機體處于明顯的炎癥狀態(tài)；主動脈ox-LDL、LOX-1、NF-κBp65、VCAM-1蛋白表達顯著上調(diào)，血管處于炎癥狀態(tài)；ET-1顯著升高，NO、NO/ET-1顯著降低，eNOS蛋白表達顯著下調(diào)，血管舒張與收縮功能障礙。LDL的氧化修飾主要發(fā)生在動脈管壁，作為ox-LDL主要受體的LOX-1是一種有效的促炎介質(zhì)。研究證實，ox-LDL可增加ET-1表達，降低內(nèi)皮細胞活力，抑制內(nèi)皮細胞遷移能力，降低eNOS蛋白表達，增加內(nèi)皮黏附分子表達，誘導血管內(nèi)皮功能障礙（Chen et al.,2019）。糖脂代謝紊亂、氧化應激、胰島素抵抗均可誘導血管炎癥的發(fā)生與發(fā)展?？梢?，造模成功后，仍高脂喂養(yǎng)且未進行運動干預的小鼠，將發(fā)生T2DM血管炎性損傷。

可見，糖尿病小鼠在早期就存在血管炎性反應，但血管功能正常，提示糖尿病早期就存在血管問題。但在不進行任何干預情況下，血管炎性反應會逐漸增加，并出現(xiàn)血管功能紊亂的現(xiàn)象，說明糖尿病后期若任其自然發(fā)展，血管病變將會加重。

3.2 跑臺運動和二甲雙胍可顯著抑制T2DM小鼠血管的炎癥反應，減少血管的細胞凋亡

運動鍛煉作為慢性病防控的非藥物手段，有助于降低代謝應激，減少心血管危險因素，防止糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生。有氧運動具有血管保護作用，與其提高胰島素敏感性、抑制炎癥反應和改善線粒體功能等密切相關(guān)（Zanuso et al.，2017）。其可增加大動脈血管內(nèi)皮eNOS活性，增加NO基礎(chǔ)釋放量，改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能（Silva et al.，2016）。雖然認識到運動能夠改善糖尿病血管并發(fā)癥，但其作用機制并不完全明確。二甲雙胍是目前應用最廣泛的抗糖尿病藥物，可通過抑制肝臟糖異生和肝糖分解，增加肝臟和外周組織對胰島素的敏感性，有效降低血糖，改善脂質(zhì)代謝，增加脂肪酸氧化，降低LDLC水平，還具有獨立于降糖外的心血管保護作用（DeFronzo，1999）。那么，運動、二甲雙胍以及聯(lián)合干預在防控T2DM血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展上又有哪些異同？本研究顯示，8周75%V˙O2max跑臺運動、二甲雙胍及其聯(lián)合干預后，ox-LDL、LOX-1、NF-κBp65蛋白表達顯著下調(diào)，血管炎性反應降低；Caspase-3蛋白表達顯著下調(diào)，血管細胞凋亡減少；主動脈eNOS蛋白表達顯著上調(diào)，血管功能改善。這更加說明在糖尿病早期進行藥物或運動干預的重要性。

研究表明，LOX-1的激活可導致氧化應激和炎癥增加（Vincent et al.，2009），ox-LDL（Zhang et al.，2014）和高濃度葡萄糖（5.6～30.0 mmol/L）（Li et al.，2003）均以時間和劑量依賴性增加內(nèi)皮細胞LOX-1 mRNA及蛋白表達。而胞內(nèi)ox-LDL積累可誘導NF-κBp65磷酸化，促進線粒體細胞色素C釋放到細胞質(zhì)，激活Caspase-3，導致內(nèi)皮細胞凋亡（Lin et al.，2018）。血管內(nèi)皮細胞的過度凋亡是造成血管病變的始動環(huán)節(jié)。高糖（40 mmol/L葡萄糖）引起人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）炎癥因子IL-1β、TNF-α分泌增多，Caspase-3表達增多，使細胞存活率降低（譚其平等，2018）。誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡的信號通路均需激活Caspase-3才能產(chǎn)生細胞凋亡效應（吳云飛等，2013）。因此，推測運動可通過下調(diào)主動脈ox-LDL與LOX-1的表達，減輕血管炎癥，減少血管細胞凋亡，以改善血管功能。此外，運動和聯(lián)合干預均可增加NO水平、NO/ET-1，顯著下調(diào)主動脈VCAM-1蛋白表達；二甲雙胍對血清NO、NO/ET-1及VCAM-1蛋白表達未見顯著影響，該現(xiàn)象可能與二甲雙胍的用藥劑量和用藥時長有關(guān)。本研究還顯示，聯(lián)合干預在改善T2DM小鼠脂質(zhì)代謝紊亂和血管炎癥反應上的效果更顯著，說明運動和二甲雙胍在改善脂質(zhì)代謝和血管炎癥反應上可能存在協(xié)同效應。

4 結(jié)論

T2DM小鼠造模成功后未進行運動或藥物干預，糖脂代謝紊亂進一步加重，主動脈炎性反應增強，血管細胞凋亡明顯增加，血管舒張功能出現(xiàn)障礙；8周跑臺運動在降低血管炎癥、改善血管舒張功能方面較二甲雙胍作用顯著，聯(lián)合干預顯示出更有效的血管舒張功能改善效應。推測：8周跑臺運動干預可能是通過下調(diào)ox-LDL、LOX-1蛋白表達，減輕血管炎癥與細胞凋亡，從而改善血管舒張功能的，聯(lián)合干預則顯示出運動與二甲雙胍的協(xié)同作用。