8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2敲除鼠骨骼肌抗氧化系統(tǒng)及運(yùn)動(dòng)能力的影響

劉雨佳 ，毛雅蕓 ，張 纓 *

運(yùn)動(dòng)能力受到多種因素的影響，骨骼肌內(nèi)的氧化還原狀態(tài)是影響骨骼肌工作能力的重要因素。當(dāng)骨骼肌內(nèi)自由基生成增多超出了機(jī)體正常水平時(shí)，骨骼肌處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而引起骨骼肌運(yùn)動(dòng)性疲勞。正常情況下，機(jī)體內(nèi)存在著抗氧化系統(tǒng)，可以清除多余的自由基，使機(jī)體氧化還原狀態(tài)保持平衡。在長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)中，骨骼肌處于缺血缺氧狀態(tài)，由于運(yùn)動(dòng)中的能量需求增加，引起骨骼肌線(xiàn)粒體電子漏增加以及黃嘌呤代謝途徑的激活，導(dǎo)致骨骼肌自由基生成增多（Jin et al.，2015，Kerksick et al.，2015），進(jìn)而引起骨骼肌氧化還原狀態(tài)失衡，使骨骼肌的收縮功能下降。

研究發(fā)現(xiàn)，核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2p45-related factor 2，Nrf2）在調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中起到非常重要的作用。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2受到自由基的激活，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，識(shí)別并結(jié)合核內(nèi)大部分抗氧化酶基因中都含有的特異DNA啟動(dòng)子序列——抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE），促進(jìn)過(guò)氧化氫酶（CAT）、醌氧化還原酶（NQO1）和血紅素加氧酶（HO-1）等一系列抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)，從而上調(diào)多種保護(hù)性酶的表達(dá)，進(jìn)而清除體內(nèi)過(guò)多的自由基（Harvey et al.，2009；Leonard et al.，2006；Zhong et al.，2013）。

近年研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2受到運(yùn)動(dòng)干預(yù)的影響。急性運(yùn)動(dòng)可以顯著增強(qiáng)Nrf2活性，從而作用于抗氧化酶的表達(dá)（Li et al.，2015）；而長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)Nrf2的作用和機(jī)制仍未完全明確，且長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能否通過(guò)Nrf2通路增強(qiáng)骨骼肌工作能力仍有待進(jìn)一步探索。因此，本研究采用Nrf2敲除鼠進(jìn)行8周有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，探討Nrf2信號(hào)通路在有氧運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)能力中的作用。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

8周齡雄性Nrf2敲除小鼠（Nrf2 KO鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所）和同周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠（WT鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司）各20只，敲除鼠和野生鼠均隨機(jī)分為安靜對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組，即野生安靜組（WC組）、野生運(yùn)動(dòng)組（WE組）、敲除安靜組（KC組）和敲除運(yùn)動(dòng)組（KE組），每組10只。動(dòng)物房采用12∶12晝夜燈光循環(huán)照明，室內(nèi)濕度控制在50%～70%，室溫保持在22℃～25℃，自由飲食、飲水。

安靜組小鼠正?；\中活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)組小鼠先進(jìn)行1周適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，方案為：坡度0°，跑速12 m/min，持續(xù)時(shí)間15 min/天，運(yùn)動(dòng)頻率5天/周。之后運(yùn)動(dòng)組采用正式訓(xùn)練方案：坡度 0°，跑速 12 m/min（約 75%V.O2max）（Fernando et al.，1993），運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度持續(xù)時(shí)間60 min/天，運(yùn)動(dòng)頻率5天/周，共8周。

1.2 運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試

在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練8周后采用遞增負(fù)荷強(qiáng)度測(cè)定小鼠運(yùn)動(dòng)能力。測(cè)試方案為：起始速度為10 m/min，持續(xù)5 min，然后跑速每3 min增加3 m/min直至力竭。記錄小鼠達(dá)到力竭的跑速、時(shí)間和距離。力竭的判斷標(biāo)準(zhǔn)為小鼠不能維持跑速，且電刺激10 s后仍不能堅(jiān)持。

1.3 取材

所有小鼠取材均在最后一次運(yùn)動(dòng)后48 h進(jìn)行。小鼠脫頸椎處死，立即取小鼠兩側(cè)股直肌下段，迅速稱(chēng)量，用錫紙包裹，標(biāo)記，立刻投入液氮中。然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，保存待用。

1.4 組織ROS水平測(cè)定

細(xì)胞ROS水平測(cè)定采用GENMED（GMS10016.3）試劑盒，熒光比色法進(jìn)行測(cè)定。取各組100 mg骨骼肌組織樣品置于離心管，加入清理液A清洗，棄去清理液，用濾紙吸干。然后加入稀釋液C，用剪刀將組織剪碎，勻漿。靜置10 min后，4℃10 000 rpm離心10 min。取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度將蛋白勻漿液稀釋至20 μg/μL，取10 μL加入避光酶標(biāo)板，按照試劑盒要求稀釋染色液B，加入到含蛋白勻漿液的酶標(biāo)板孔中，37℃避光孵育20 min，激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，散發(fā)波長(zhǎng)520 nm檢測(cè)熒光強(qiáng)度值。計(jì)算與空白熒光強(qiáng)度差值，以表示該孔細(xì)胞ROS含量。

1.5 RT-PCR法測(cè)定mRNA的表達(dá)

取50 mg的骨骼肌加入0.8 mL預(yù)冷Trizol中，剪碎，勻漿后，依次采用氯仿、異丙醇、75%酒精進(jìn)行分離提純總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的純度和濃度，采用RT-PCR試劑盒（Toyobo，F(xiàn)SQ101）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增。

采用美國(guó)ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)定，引物分別采用Nrf2（QT00095270），過(guò)氧化氫酶（CAT；QT010558106），醌氧化還原酶1（NQO1；QT00094367）和血紅素氧合酶（HO-1；QT00159915）。反應(yīng)體系采用：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，引物 2 μL，CDNA模版2 μL，ddH2O 6 μL。使用ABI7500PCR儀自帶的軟件對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量CT值進(jìn)行讀取，用比較CT法對(duì)目的基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量。具體計(jì)算公式為：目的基因=2-△△C。

1.6 Western Blot測(cè)定蛋白表達(dá)

取100 mg凍存骨骼肌組織，加入1 mL含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液（碧云天）中。剪碎，高速勻漿；冰上靜置30 min；12 000 rpm，4℃離心30 min，取上清液于離心管中，-20℃凍存?zhèn)溆?。采用美?guó)Pierce公司生產(chǎn)的蛋白濃度試劑盒，BCA方法測(cè)定骨骼肌的蛋白濃度。以上樣蛋白量20 μg為一次上樣量，根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度計(jì)算蛋白上樣量。采用美國(guó)life technologies公司產(chǎn)Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝膠，電泳分離Nrf2、CAT、NQO1、HO-1及內(nèi)參（β-actin），然后采用美國(guó)Invitrogen公司的iBlot Gel Transfer System轉(zhuǎn)移電泳膠將電泳后蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃一抗過(guò)夜，一抗分別為 Nrf2（1∶200，Santa Cruz，SC-722），CAT（1∶500，Santa Cruz，SC-50508），NQO1（1∶500，Santa Cruz，SC-16464），HO-1（1∶1 000，abcam，ab13248），室溫孵育搖床1 h，后用TBST洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光顯影，放入Bio-Rad凝膠成像儀中進(jìn)行拍攝得到目的條帶圖像。用Image Lab軟件讀取條帶的積分灰度值，用式（1）計(jì)算比值表示最后結(jié)果：

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SE）的形式顯示，采用雙因素方差分析方法，對(duì)干預(yù)方式（安靜和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練）和不同基因型的主效應(yīng)以及兩因素的交互作用進(jìn)行分析。如果無(wú)主效應(yīng)，同種干預(yù)方式或同種基因型組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著性水平取P＜0.05，非常顯著性水平取P＜0.01。

2 研究結(jié)果

2.1 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響

野生鼠和Nrf2敲除鼠的運(yùn)動(dòng)組的終止跑速、達(dá)到力竭時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離均顯著高于各自安靜組；而不同基因型鼠的同種干預(yù)方式間并未呈現(xiàn)出顯著性差異（表1）。

表1 不同組別小鼠的運(yùn)動(dòng)能力Table 1 Exercise Capacity in Mice from Various Groups

2.2 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2敲除鼠ROS的影響

與WC組相比，KC組小鼠ROS無(wú)顯著變化，Nrf2敲除并未引起小鼠骨骼肌ROS水平升高；與WE組相比，KE組小鼠ROS水平顯著下降（P＜0.05），8周有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后野生鼠ROS高于Nrf2敲除鼠。WE組與WC組相比無(wú)顯著性差異，KE組與KC組相比也無(wú)顯著性差異（圖1）。

圖1 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2敲除鼠骨骼肌ROS的影響Figure 1. Effects of 8 Weeks Exercise on ROS in Nrf2 Knockout Mice

2.3 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2及抗氧化酶mRNA表達(dá)的影響

KC組小鼠Nrf2、NQO1和CAT mRNA非常顯著低于WC組，但KC、WC組HO-1 mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異；與WC組相比，WE組Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA非常顯著升高，而Nrf2敲除鼠運(yùn)動(dòng)組與安靜組間mRNA均無(wú)顯著性差異（圖2）。

圖2 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2敲除鼠骨骼肌Nrf2及抗氧化酶mRNA的影響Figure 2. Effects of 8 Weeks Exercise on mRNAof Nrf2 andAntioxidant Enzymes in Nrf2 Knockout Mice

2.4 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2及抗氧化酶蛋白表達(dá)的影響

KC組與WC組相比，Nrf2蛋白表達(dá)非常顯著降低，而NQO1、HO-1和CAT表達(dá)均無(wú)顯著性差異；KE組與WE組相比，Nrf2及其調(diào)節(jié)的NQO1、HO-1和CAT的蛋白表達(dá)均顯著降低。WE組與WC組相比，Nrf2及其調(diào)節(jié)的NQO1、HO-1和CAT的蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異；KE組較KC組各蛋白無(wú)顯著改變（圖3）。

圖3 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2敲除鼠骨骼肌Nrf2及抗氧化酶蛋白表達(dá)的影響Figure 3. Effects of 8 Weeks Exercise on Expression of Nrf2 andAntioxidant Enzymes in Nrf2 Knockout Mice

3 分析討論

3.1 Nrf2對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的作用

有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激，對(duì)骨骼肌中ROS的生成起到刺激作用（Powers et al.，2020）。Nrf2是細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)中關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)ROS激活，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)多種抗氧化解毒酶的表達(dá)，進(jìn)而清除ROS，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)平衡。而Nrf2是否會(huì)受到運(yùn)動(dòng)的影響，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)能力？相關(guān)的研究仍沒(méi)有明確結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)8周的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，野生鼠和Nrf2敲除鼠達(dá)到力竭的時(shí)間都呈現(xiàn)顯著提高，但兩種基因型小鼠間并沒(méi)有顯著性差異。Crilly等（2016）的研究結(jié)果與本研究一致，采用Nrf2敲除小鼠和野生鼠進(jìn)行自由轉(zhuǎn)輪訓(xùn)練6周，在最后一次運(yùn)動(dòng)后48 h進(jìn)行最大運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試，結(jié)果顯示，兩種基因型小鼠在運(yùn)動(dòng)后均比各自的安靜組運(yùn)動(dòng)能力顯著性增加，但Nrf2敲除小鼠達(dá)到力竭時(shí)的運(yùn)動(dòng)距離與野生鼠相比并無(wú)顯著性差異。關(guān)于Nrf2對(duì)運(yùn)動(dòng)能力作用的研究結(jié)論并不一致，有研究采用外源性藥物補(bǔ)充的方式激活Nrf2，發(fā)現(xiàn)Nrf2的激活增強(qiáng)了運(yùn)動(dòng)能力。如，Wafi等（2019）研究證明，姜黃素可以上調(diào)骨骼肌Nrf2信號(hào)，增強(qiáng)了骨骼肌的運(yùn)動(dòng)能力；Oh等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素（SFN）可以通過(guò)激活骨骼肌Nrf2，降低了力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的骨骼肌氧化應(yīng)激，從而使運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，且可以減少運(yùn)動(dòng)至力竭引起的骨骼肌結(jié)構(gòu)損傷。研究結(jié)果的不一致可能與Nrf2的激活方式不同有關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果來(lái)看，有氧運(yùn)動(dòng)可以增強(qiáng)Nrf2敲除鼠和野生鼠的運(yùn)動(dòng)能力，但并不依賴(lài)于Nrf2系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能力的改善。

3.2 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2敲除鼠骨骼肌ROS的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，在Nrf2敲除狀態(tài)下，多個(gè)器官ROS水平有所升高（He et al.，2009；Kovac et al.，2015），也有研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2的缺失并未引起ROS以及氧化損傷標(biāo)志物的增加（Gong et al.，2006；Osburn et al.，2006）。Muthusamy等（2012）對(duì)Nrf2敲除小鼠心肌ROS的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在一次性運(yùn)動(dòng)應(yīng)激后，心肌ROS水平增加；而在基礎(chǔ)狀態(tài)下，Nrf2敲除鼠與野生鼠ROS水平并無(wú)顯著性差異。因此，Nrf2敲除對(duì)ROS的影響，一方面是由于在體和離體狀態(tài)下細(xì)胞或器官生存環(huán)境不同，另一方面，還跟細(xì)胞或器官的活動(dòng)狀態(tài)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在安靜狀態(tài)下Nrf2敲除鼠ROS水平與野生鼠無(wú)顯著性差異，由此也說(shuō)明ROS的生成不僅與Nrf2有關(guān)，可能存在其他的通路對(duì)骨骼肌中ROS的生成產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物取材時(shí)間選擇在基礎(chǔ)狀態(tài)下，因而Nrf2敲除并未引起小鼠骨骼肌基礎(chǔ)狀態(tài)下氧化還原狀態(tài)的失衡。

運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激，可以影響線(xiàn)粒體的功能，使骨骼肌ROS水平增加（Saborido et al.，2011）。另有研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律性的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練也可以引起機(jī)體ROS的適應(yīng)性變化。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的功能，且運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能影響了線(xiàn)粒體和胞漿中ROS的生成（He et al.，2016）。Merry等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2除了調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)多種抗氧化酶的表達(dá)外，還可能影響細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體代謝相關(guān)的酶。該研究通過(guò)對(duì)Nrf2敲除鼠V.O2max檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Nrf2敲除鼠V.O2max也顯著低于野生鼠，由此說(shuō)明Nrf2敲除引起線(xiàn)粒體代謝功能下降，而ROS的生成也因此受到限制。在本研究中，KC組與WC組ROS水平相比無(wú)顯著性差異，而KE組ROS水平低于WE組，這與最初的預(yù)期結(jié)果并不一致。ROS的生成與骨骼肌線(xiàn)粒體代謝關(guān)系密切。Kovac等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2通路參與調(diào)節(jié)了線(xiàn)粒體內(nèi)NADPH氧化酶（NOX）的表達(dá)。Nrf2敲除鼠NOX4表達(dá)降低，而NOX2出現(xiàn)代償性增加，這可能是ROS水平升高的原因。Crilly等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2敲除引起小鼠骨骼肌線(xiàn)粒體功能降低，而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練并不依賴(lài)Nrf2途徑提高細(xì)胞色素c氧化酶4的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)線(xiàn)粒體功能，這也可能是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后導(dǎo)致Nrf2敲除鼠ROS水平低于安靜組的原因。因此結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能影響了Nrf2敲除鼠骨骼肌ROS水平，具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

3.3 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2敲除鼠骨骼肌抗氧化系統(tǒng)的影響

ROS除了引起氧化損傷外，在細(xì)胞內(nèi)還擔(dān)任著信號(hào)分子的作用，例如，Nrf2的激活就依賴(lài)于ROS。有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起Nrf2敲除鼠骨骼肌的抗氧化系統(tǒng)的適應(yīng)性變化可能是通過(guò)對(duì)ROS的改變來(lái)起作用的（Merry et al.，2016）。近些年來(lái)關(guān)于長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的研究發(fā)現(xiàn)，有氧耐力訓(xùn)練可以增加Nrf2及其調(diào)控的Ⅱ相解毒酶的表達(dá)和/或活性增加（Aguiar et al.，2016；Asghar et al.，2007；Camiletti-Moirón et al.，2014；da Silva Fiorin et al.，2016；George et al.，2009；Gounder et al.，2012；Jiang et al.，2014；Kumar et al.，2011；Muthusamy et al.，2012；Strobel et al.，2011；Sun et al.，2013；Zhao et al.，2013）。本研究結(jié)果顯示，盡管在安靜狀態(tài)下，Nrf2敲除小鼠Nrf2、NQO1、HO-1和CAT抗氧化酶mRNA表達(dá)低于野生鼠，但NQO1、HO-1和CAT蛋白表達(dá)并未顯著低于野生鼠。而KE組與WE相比，Nrf2、NQO1、HO-1和CAT的表達(dá)均顯著降低。結(jié)合ROS水平的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nrf2和抗氧化酶蛋白表達(dá)結(jié)果與ROS水平變化趨勢(shì)相似，即在安靜的基礎(chǔ)狀態(tài)下，Nrf2的缺失并未引起機(jī)體內(nèi)ROS和抗氧化系統(tǒng)的明顯差異，但在經(jīng)過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，ROS和抗氧化酶的表達(dá)出現(xiàn)差異。有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能增加了基礎(chǔ)狀態(tài)下的ROS水平，而NQO1、HO-1和CAT抗氧化酶的表達(dá)增加可能是對(duì)ROS的敏感性增加，這一運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性變化過(guò)程依賴(lài)于Nrf2的參與。

4 結(jié)論

8周有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)Nrf2促進(jìn)骨骼肌抗氧化酶的表達(dá)。8周有氧運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)了小鼠運(yùn)動(dòng)能力，但并不依賴(lài)于Nrf2發(fā)揮作用。