趕黃草活性成分槲皮素和沒食子酸對CCl4所致小鼠急性肝損傷的保護作用及機制*

中草藥是中華民族瑰寶，趕黃草又名水楊柳、水澤蘭，學(xué)名扯根菜

，為四川滬州古藺苗族地道藥材。具有清熱解毒、活血化瘀、退黃化濕之功效。趕黃草具有保肝

、抗菌

、抗肝癌

、抗氧化

、抗病毒

和降血糖

等作用。趕黃草及其相關(guān)生物制劑在臨床上廣泛應(yīng)用于酒精性脂肪肝、乙型肝炎、肝硬化和肝纖維化等疾病的治療

。趕黃草主要含有類黃酮、木脂素類、三萜類、有機酸類、苯乙酮類、酯類和揮發(fā)油等多種化學(xué)成分

,槲皮素和沒食子酸分別屬于類黃酮和有機酸類，是趕黃草的重要的成分并且相對含量較高

。因此趕黃草成分中有可能是槲皮素和沒食子酸發(fā)揮著保護肝臟的作用。本研究通過腹腔注射CCl

構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型，從保護肝臟功能、抗炎癥和抗氧化損傷等方面去探究槲皮素和沒食子酸保護肝臟的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑 槲皮素和沒食子酸(購自湖北諾納科技有限公司)；ELISA試劑盒：谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和還原型谷胱甘肽(GSH)(購自卡米諾公司)；兔抗鼠血紅素加氧酶(HO-1)抗體(購自Proteintech公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)研究所)；蘇木素、伊紅(購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動物處理 40只SPF級昆明小鼠，雄性，體重(20±2)g(川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組、槲皮素組(100 mg/kg)、沒食子酸組(100 mg/kg)，每組10只。槲皮素組和沒食子酸組每天灌胃1次相應(yīng)藥物，正常組和模型組每天灌胃1次等量生理鹽水，連續(xù)7 d。末次給藥后2 h，除正常組外，其他各組小鼠腹腔注射0.2% CCl

植物油溶液(15 ml/kg)，16 h后麻醉處死小鼠取材。

2.水深 池塘養(yǎng)鱉普遍的水深為1～2m。山塘水庫的水深一般在5m以上，因此，山塘水庫水深的要求不應(yīng)太苛刻，只是要求淺水區(qū)面積要占有一定的比例，需要有一定面積的淺灘，淺灘面積越大越好。

1.3 肝組織及形態(tài)學(xué)觀察

2.5.2 免疫熒光結(jié)果 相較于正常組小鼠HO-1表達，模型組、槲皮素組和沒食子酸組小鼠肝臟中HO-1表達均明顯增多。槲皮素和沒食子酸組肝臟中HO-1表達較模型組增多更為明顯，見圖6。

2.1 小鼠肝臟及其組織染色形態(tài) 肉眼觀察肝臟：正常組小鼠肝臟色澤紅潤、質(zhì)地柔軟、觸摸光滑有彈性、邊緣透亮。模型組肝臟顏色偏暗、表面可見均勻分布的白色結(jié)節(jié)、觸摸質(zhì)地較硬。槲皮素和沒食子酸干預(yù)組小鼠較模型組肝臟損傷形態(tài)有所恢復(fù)，結(jié)節(jié)大幅減少，顏色質(zhì)地接近正常。組織形態(tài)學(xué)觀察可見：正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列整齊，細胞和結(jié)構(gòu)清晰，細胞無腫脹、炎性浸潤等病理現(xiàn)象；模型組小鼠肝細胞腫脹明顯，可見細胞空泡壞死，存在嚴重的炎性細胞浸潤現(xiàn)象，細胞腫脹變性面積占比44%，較正常組增加(

<0.05)；槲皮素和沒食子酸組小鼠較模型組肝細胞腫脹、變性恢復(fù)，無明顯空泡形成，細胞排列規(guī)整，炎細胞浸潤減少(如圖1)，細胞腫脹變性面積占分別為13%和14%，較模型組明顯減少(

<0.05)。模型組小鼠肝臟指數(shù)相比于正常組顯著升高(

<0.05)；沒食子酸組小鼠相比于模型組肝臟指數(shù)顯著降低(

<0.05)。

1.3.2 肝細胞形態(tài)觀察 用手術(shù)刀切割綠豆大小肝組織放入提前標記的組織包埋盒中。10%甲醛溶液固定24 h。做成中性樹脂封片保存。在顯微鏡下對其進行病理學(xué)觀察。

1.4 血清中TNF-α和ALT水平測定 建模后16 h，腹腔注射3%戊巴比妥麻醉小鼠。用剪刀剪去兩側(cè)胡須，行眼球摘取法取血。ELISA檢測TNF-α和ALT水平，操作步驟遵照ELISA試劑盒說明書。

1.6 Western blot測定肝組織中HO-1水平 稱取小鼠肝臟100 mg，剪碎用預(yù)冷PBS洗滌2次，4℃離心機3 000 r/min離心3 min，棄去上層液體。加入500 μl含有PMSF的細胞裂解液，于玻璃勻漿機在冰水浴中研磨充分。4℃離心機10 000 r/min離心5 min，分離上清。于渦旋振蕩10 s，冰上放置20 min，期間震蕩3～5次。再于4℃離心機12 000 r/min離心10 min，分離上清。BSA法蛋白定量。調(diào)整濃度后加入等量Loading buffer蛋白變性后上樣，60 V預(yù)電泳至蛋白成一條直線，110 V跑分離膠，參考Marker停止跑膠并轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后于5%脫脂奶粉37℃恒溫搖床封閉1.5 h，一抗孵育過夜，二抗室溫2 h，加入ECL顯色液后于凝膠成像系統(tǒng)顯示。

1.5 肝勻漿中GSH含量測定 ELISA檢測肝勻漿中GSH水平，操作步驟遵照ELISA試劑盒說明。

1.7 免疫熒光測定肝組織中HO-1表達 將組織切片通過微波輻射抗原修復(fù)法修復(fù)。待恢復(fù)至室溫過后畫阻水圈，5% BSA+0.3% Triton-100進行室溫封閉1 h，滴加一抗(1∶100)4℃過夜，滴加二抗(1∶400)室溫1 h，滴加DAPI(1∶10 000)30 min立即于熒光顯微鏡下觀察。

2.在Rt△ABC中，∠C=90°，a、b、c分別是∠A、∠B、∠C的對邊，下列關(guān)系式正確的是( ).

2 結(jié)果

1.3.1 摘取肝臟并測定肝臟指數(shù) 取血后，脊椎脫臼法處死小鼠并迅速開腹取肝。于提前預(yù)冷的4℃ PBS溶液沖洗小鼠肝臟，吸水紙擦干后稱重并計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)計算公式為：(肝臟重量/小鼠體重)×100%。

2.2 小鼠血清中ALT水平 模型組小鼠相比于正常組小鼠血清中ALT顯著升高(

<0.01)，而槲皮素和沒食子酸干預(yù)小鼠后，其血清中ALT水平較模型組顯著降低(

<0.01) ，見圖2。

2.3 小鼠血清中TNF-α水平 相較于正常組，模型組小鼠TNF-α顯著升高(

<0.01)，這與HE染色所看到的炎性浸潤結(jié)果相符合，見圖3。

2.4 小鼠肝勻漿中GSH水平 相較于正常GSH水平，模型組和沒食子酸組小鼠肝勻漿中GSH表達均減少(

<0.01)。相較于模型組GSH水平，槲皮素和沒食子酸組肝勻漿中GSH水平顯著升高(

<0.01)，見圖4。

2.5 HO-1蛋白表達水平

首先，我們利用CCl

這一常用動物肝臟損傷模型構(gòu)建試劑制備動物模型，其間施以槲皮素及沒食子酸單體藥物干預(yù)。肝臟形態(tài)及組織HE染色結(jié)果顯示：CCl

確導(dǎo)致嚴重的急性肝損傷，而槲皮素及沒食子酸干預(yù)后，小鼠無論在肝臟指數(shù)、炎癥損傷和組織形態(tài)學(xué)指標等方面均得到了很好的恢復(fù)。

很好地處理理論與教學(xué)實踐之間的關(guān)系當(dāng)然也應(yīng)被看成教師專業(yè)成長的又一重要因素，以下則是這些年的課改實踐給予人們的一個重要啟示或教訓(xùn)：與片面強調(diào)理論的學(xué)習(xí)與落實相比較，應(yīng)當(dāng)更加注重“理論的實踐性解讀”與“教學(xué)實踐的理論性反思”．

（3）應(yīng)采用級配中粗砂作為水泥砂漿的砂料，含泥量≤3%；水泥砂漿比例為1∶1，水灰比大于0.35且小于0.45，砂子粒徑≤1.0mm，灌漿液稠度應(yīng)為灌注朝上垂直孔而不致發(fā)生垂流。

3 討論

趕黃草因其強大保肝功效、低毒性等特點越來越受到研究人員們的關(guān)注。但趕黃草成分中具體是哪些活性物質(zhì)發(fā)揮著保護肝臟的作用以及其保護肝臟的機制仍有待進一步研究。楊麗娜

和朱一倫

等人在趕黃草藥物成分上的研究表明，槲皮素和沒食子酸在趕黃草中含量相對較高，且二者分別屬于類黃酮物質(zhì)和有機酸類。本文以此為基礎(chǔ)，研究趕黃草主要活性成分槲皮素和沒食子酸對肝損傷的保護作用及其機制。

由表2和圖2可以看出，東營市的綠色經(jīng)濟發(fā)展水平在2007—2016年總體呈現(xiàn)上升趨勢。生活消費系統(tǒng)、環(huán)境系統(tǒng)、能源系統(tǒng)保持著較好的上升趨勢，具體如圖3所示。

2.5.1 Western blot結(jié)果 相較于正常組小鼠水平HO-1，模型組、槲皮素組和沒食子酸組小鼠肝臟中HO-1表達水平顯著升高(

<0.01)。槲皮素和沒食子酸組小鼠肝臟中HO-1水平比模型組表達顯著升高(

<0.01)。其中槲皮素組HO-1升高更加明顯，見圖5。

其次，在肝功能方面，ALT反應(yīng)肝臟損傷嚴重程度，通過槲皮素及沒食子酸干預(yù)后，ALT明顯下降，說明肝臟損傷趨于恢復(fù)，但仍高于正常對照，其主要的原因可能是CCl

作為一種強肝毒性物質(zhì)其損傷程度較高，因此，難于在實驗終止時間內(nèi)完全恢復(fù)正常。

另外，肝臟損傷與機體組織器官抗氧化應(yīng)激能力密切相關(guān)

，因此，我們檢測了組織中抗氧化應(yīng)激過程中的兩種主要酶GSH及HO-1。當(dāng)CCl

大量進入機體后，會侵襲肝臟從而產(chǎn)生過量自由基，導(dǎo)致氧化-抗氧化系統(tǒng)失去平衡，造成嚴重的肝損傷

，損傷過程中細胞能通過不斷消耗GSH來抵抗氧化應(yīng)激損傷

。我們的實驗結(jié)果也證實，在應(yīng)用槲皮素及沒食子酸干預(yù)后，肝組織中GSH水平明顯升高，尤以槲皮素更為明顯，因其恢復(fù)水平與正常組幾乎無差異，說明其確能通過升高GSH水平，從而達到增強小鼠抗氧化應(yīng)激損傷的能力。

血紅素氧合酶(HO)系統(tǒng)主要由HO-1和組成型血紅素氧合酶-2(HO-2) 構(gòu)成。其中HO-1系統(tǒng)是機體抗氧化應(yīng)激的另一重要機制

。高水平的HO-1能夠增強機體對氧化應(yīng)激損傷的抵抗能力

。正常情況下體內(nèi)的HO-1表達較低，當(dāng)機體受到急性應(yīng)激性刺激時，血紅素氧合酶系統(tǒng)會被激活，從而誘導(dǎo)HO-1的上調(diào)來增強機體的抗氧化應(yīng)激損傷能力。本研究中Western Blot和免疫熒光結(jié)果顯示，槲皮素和沒食子酸能夠上調(diào)小鼠肝臟中HO-1蛋白的表達，從而達到保護肝臟免受氧化應(yīng)激損傷的目的。

魔刀松開捏了一把汗的手長出了一口氣?！俺Ｐ州p松了許多。”魔刀聽到大幻劍的傳音點頭道：“我非自貶，一旦出手無論是天問還是我都會傾力而為，可三少既然首肯，該是想借此將天問大師和紫陽道長收之麾下，而不是一場非死即傷的豪賭。”

生命體驗以個體生命存在為基礎(chǔ)，強調(diào)對生活感受和生命意識的重視，是人在觀照生死及一系列生存狀態(tài)時的情感表達和感悟升華。在語文教學(xué)過程中注重體悟作者蘊含在作品中的生命體驗，能夠幫助學(xué)生更好地理解生命、感悟生命、尊重生命，使生命意義得到彰顯和擴展。當(dāng)下，由于功利主義的盛行，分數(shù)是學(xué)生的唯一追求，語文教學(xué)大多被當(dāng)作是以讀、寫、誦為目的的機械性知識傳遞活動，這樣不僅抹殺了語文學(xué)科的人文性，也忽視了學(xué)生的生命發(fā)展。因此，語文教學(xué)應(yīng)該關(guān)注生命體驗，通過實施行之有效的策略，讓學(xué)生在在體悟作者復(fù)雜情感體驗的基礎(chǔ)上獲得啟發(fā)和引導(dǎo)，不斷促進學(xué)生生命成長。

急性肝損傷屬于炎癥性病理反應(yīng)，TNF-α是一種炎癥性細胞因子，在炎癥反應(yīng)中多有表達。本研究中ELISA結(jié)果顯示槲皮素和沒食子酸能降低肝損傷小鼠血清中TNF-α的含量，從而保護肝臟免受炎癥損傷。然而，在肝損傷中TNF-α既可以參與肝損傷，又能發(fā)揮保護作用。當(dāng)TNF-α超過一定濃度后能夠激活肝細胞內(nèi)的一系列信號通路，從而啟動凋亡程序加速肝細胞的死亡，加重肝損傷程度。而在低濃度時又能夠快速進入損傷的肝細胞中，抑制肝細胞凋亡，同時促進上皮細胞增殖，促進肝損傷的修復(fù)過程。因此，本研究中兩干預(yù)組TNF-α濃度明顯降低可能是通過初期階段減輕肝臟損傷作用和后期促進肝臟損傷修復(fù)作用的共同結(jié)果。

綜上，趕黃草活性物質(zhì)槲皮素和沒食子酸均具有保護肝臟免受損傷的作用。其作用機制主要通過降低ALT水平保護肝臟；上調(diào)GSH和HO-1來增強肝臟的抗氧化應(yīng)激損傷能力；抑制TNF-α炎癥因子進而保護肝臟免受炎癥損傷。因此，趕黃草及其主要活性成分確可作為臨床肝臟炎癥損傷性疾病治療的主要藥物。本研究也為開發(fā)設(shè)計及合成新型保肝治療藥物奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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