鱉龍軟肝湯抗肝纖維化-肝癌“多成分-多靶點”的網絡藥理學研究*

肝癌是全球第二大癌癥相關死亡原因，患者5年總體生存率約18%

；肝損傷因素如肝炎病毒感染、酒精和黃曲霉素攝入、遺傳代謝性疾病、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝病、膽汁淤積等引起肝細胞損傷，炎癥細胞浸潤和廣泛的組織重塑、血管結構紊亂和組織缺氧，最終導致進行性肝纖維化、肝硬化或肝癌

。肝纖維化是一種肝臟對各種慢性損傷所產生的修復反應，炎癥細胞浸潤和廣泛的組織重塑、血管結構紊亂和組織缺氧，促進了纖維化的發(fā)展，最終導致肝硬化甚至肝癌

。肝癌的發(fā)生存在“肝炎-肝纖維化/肝硬化-肝癌”的序列演進規(guī)律

。肝纖維化是所有慢性肝臟疾病共有的病理學基礎，阻止和/或延緩肝纖維化發(fā)生，可延緩肝硬化和原發(fā)性肝癌的發(fā)生。因此，尋求有效的藥物阻斷或逆轉肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，是防止“肝炎-肝纖維化/肝硬化-肝癌”序列演進的重點。

鱉龍軟肝湯(BLRGD)原名“疏肝理脾Ⅱ號方”，是治療肝纖維化的重要中藥方劑，治以活血化瘀為主，配以滋陰益氣健脾。鱉龍軟肝湯由鱉甲、地龍、茯苓、桃仁、莪術、柴胡、白芍等藥材組成，前期研究發(fā)現(xiàn)鱉龍軟肝湯有較好的抗肝纖維化、抗肝癌的作用，并有效改善脾虛血瘀的作用

。本研究采用網絡藥理學的方法，探討B(tài)LRGD抗肝纖維化-肝硬化-肝癌(HF-LC-PLC)“多成分-多靶點-多通路”的作用機制，為BLRGD治療HF-LC-PLC提供理論依據。

此后，生態(tài)語言學的理念逐漸引入英語教學的研究領域，國內部分學者開展了相關研究，馬瑞娟、任麗及吳宗會以生態(tài)語言學為視角分別探討如何改革本科及研究生公共英語教學，其研究僅涉及本科或研究生公共英語。

阿米東索神山，孤峰獨秀，氣勢磅礴，是祁連縣的象征，因其形似牛心，所以又被稱為牛心山。牛心山海拔4667米，積雪常年不化，皚皚雪峰在藍天白云的映襯下分外壯美。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分篩選 基于TCMSP數據庫，以“白芍”“柴胡”“莪術”“茯苓”“桃仁”為檢索詞，選取中藥的化合成分。以OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4作為篩選條件，過濾獲取每味中藥的化合成分及對應的藥物靶點。鱉甲、地龍潛在靶點的反向預測及篩選通過并在PubChem數據庫中獲取相關成分SDF格式化學結構，所有化學結構均采用ChemBio 3D Ultra軟件轉換為Mol2文件格式，將鱉甲、地龍化學成分Mol2格式結構文件，上傳至PharmMapper服務器，以活性小分子為探針，搜尋潛在藥物靶點，得到虛擬篩選和預測化合物生物活性。通過UniProt數據庫(http://www.Uniprot.org/)中的UniProtKB檢索藥物靶點，輸入蛋白名稱并限定物種為“Homo sapiens”，將檢索得到的所有靶點進行校正。

1.4 GO功能及KEGG富集分析 將DDT結果輸入至KOBAS在線數據庫進行GO功能和KEGG富集分析，分別通過OmicShare平臺(http://www.omicshare.com/)和Cytoscape3.7.1軟件對GO和KEGG富集分析結果進行可視化。

2.2 DDT網絡構建及可視化 共得到鱉龍軟肝湯中116個藥物靶點，通過GeneCards上檢索到關于疾病的3 063個靶點(肝硬化4 179個靶點，肝纖維化6 431個靶點，原發(fā)性肝癌14 853個靶點，三者交集為3 063個靶點)，將兩者進行交集處理，共得到64個藥物疾病靶點，詳見圖1。利用Cytoscape3.7.1軟件對DDT進行網絡可視化，詳見圖2。

2.4 GO富集分析 將所得到的64個藥物疾病靶點，通過KOBAS數據庫進行GO功能富集分析，共得到87條功能注釋。通過OmicShare平臺對BP、MF和CC進行排名，根據P值和富集靶點數靠前的GO富集分析結果進行排序。詳見圖4、表2。

首先，你們要加強心理康復能力，拿到修復能量！這需要你們掌握一些能轉移情緒、宣泄痛苦的心理調節(jié)手段。如果你們忙得像陀螺一樣，還能擠點時間放松自己，或者在心情不佳的時候轉移注意力，能讓自己始終像太陽一樣明媚，那我可能會被“曬傷”，沒辦法對你們施加影響了。

2 結果

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在牛血清白蛋白(BSA)復制的大鼠肝纖維化模型，鱉龍軟肝片具有保護肝細胞，抑制大鼠肝臟膠原纖維合成及抑制肝臟纖維組織增生的作用

；鱉龍軟肝片能顯著性降低慢性乙型肝炎患者FibroIndex積分值，有抗慢性乙型肝炎患者肝纖維化的療效

；BLRGD聯(lián)合經肝動脈化療栓塞術治療HBV相關原發(fā)性肝癌，可改善患者生活質量，提高近期療效

。提示BLRGD有較好的抗肝纖維化、抗肝癌的作用，并有效改善脾虛血瘀的作用，但具體機制尚不明確。

本文在借鑒相關研究結果的基礎上，對當前湖南省城市化與生態(tài)環(huán)境的耦合協(xié)調發(fā)展階段與狀態(tài)進行研究分析，并提出了相關的改善措施，對推進湖南省新型城市化建設，提高省域內城市化與生態(tài)環(huán)境協(xié)調度具有一定的借鑒意義。但由于城市化與生態(tài)環(huán)境內部各要素之間交互耦合關系較為復雜，無論是在構建指標體系方面，還是研究方法及模型運用等方面難免存在不足與缺陷，仍需深入研究。同時，關于城市化與生態(tài)環(huán)境耦合關系、相關性的研究方法還有很多[20]，如數據包絡分析法、德爾菲法、生態(tài)足跡法等等，本文由于數據限制，目前的指標體系還很難全面刻畫城市化與生態(tài)環(huán)境的全部內涵，更為全面、合理的指標體系的構建值得進一步探討。

1.2 藥物-疾病靶點(DDT)網絡可視化分析 利用GeneCards數據庫以“Hepatic Fibrosis、Cirrhosis、Liver Cancer”為檢索詞，收集與疾病相關的靶點。運用Interactivenn平臺(http://www.interactivenn.net/)將藥物活性成分-疾病共同蛋白進行提取，所得交集即為DDT。通過Cytoscape3.7.1軟件對Drug-Disease進行可視化網絡分析的展示。

2.3 PPI網絡的構建及可視化 通過String平臺對得到的64個藥物-疾病靶點進行PPI網絡構建，然后利用Cytoscape 3.7.1軟件對PPI結果行網絡可視化分析。PPI網絡最終得到共包含64個節(jié)點，128條邊。根據Degree值對節(jié)點進行排序，排名前5的靶點為IL6、MAPK8、CCND1、RELA、ICAM1。詳見圖3。

1.3 構建蛋白互作網絡 將DDT結果傳至String平臺進行PPI網絡分析。設定物種為“Homo sapiens”，設定最低互動分數為0.400。運用Cytoscape3.7.1軟件進行可視化分析。

祖國醫(yī)學本無肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌等病名，據其具體臨床表現(xiàn)可歸屬于“脅痛”“積聚”“癥瘕”“黃疸”“臌脹”等范疇

。目前普遍認為，肝癌的病因病機主以肝郁脾虛，以毒邪、血瘀、濕熱、氣滯為標

。肝癌癌前病變可分為氣滯血瘀證、肝郁脾虛證、肝腎陰虛證、濕熱內盛證及瘀毒蘊結證5個證型

，其中肝郁脾虛是形成HF-LC-PLC的主要內在基礎

。疏肝健脾活血法為原發(fā)性肝癌的主要治法

。BLRGD由鱉甲、地龍、茯苓、桃仁、莪術、柴胡、白芍等藥材組成，方中莪術、桃仁為君，莪術苦辛溫，桃仁性味苦酸，均入肝經，行破血祛瘀、消積散之效。鱉甲、白芍、柴胡為臣，鱉甲性味咸微寒，入肝脾腎經，治以軟堅散結、滋陰潛陽；白芍性味酸苦微寒，歸肝脾經，養(yǎng)血斂陰；柴胡性味苦微寒，經歸肝膽，行疏肝解郁、行氣止痛之效；三味合用助君藥活血化瘀之功，同時以鱉甲滋肝陰、白芍養(yǎng)肝血，可防莪術、桃仁活血破血過甚所致傷正。茯苓性味甘平為佐藥，以淡滲利濕，健脾和胃，健胃消食，可改善便溏、腹脹、納差等脾虛癥狀。地龍為使，性味寒咸，歸肝脾經，具清熱、利尿、通絡之效，可調和諸藥，使藥力直達肝脾二臟，共奏疏肝健脾、活血化瘀之效，達到攻不傷正，補不留邪，攻補兼施，標本兼治之目的。

2.5 KEGG通路富集分析 通過KOBAS平臺對64個DDT進行KEGG富集分析，共得到722條富集通路，富集排名靠前的通路主要有Metabolic pathways、TNF、Pathways in cancer等信號通路密切相關，詳見圖5、表3。通過Cytoscape軟件對DDT與富集通路進行可視化網絡，該網絡共有174節(jié)點，532條邊，詳見圖6。

3 討論

在大數據技術的整個運行周期種，首要的環(huán)節(jié)就是數據采集，要依據Map Reduce產生的數據進行有效分類，先分布式局部計算得出結果再統(tǒng)一合并得到計算結果。

2.1 鱉龍軟肝湯活性成分的篩選 共檢索得到活性成分67個，見表1。

隨著網絡藥理學的興起與發(fā)展，利用網絡藥理學方法分析中藥復方“多成分-多靶點-多通路”的技術日益成熟。本文通過網絡藥理學反向藥效團匹配方法篩選BLRGD中化學成分的靶點基因，并與HF-LC-PLC靶點基因進行映射，發(fā)現(xiàn)64個相關度較高的靶點基因。將這些靶點基因進行GO富集和KEGG通路分析、化學成分-靶點-通路及蛋白互作網絡分析，探討B(tài)LRGD“多成分-多靶點-多通路”的作用機制。

通過分析中藥-化學成分-靶點網絡圖及結合文獻分析發(fā)現(xiàn)，paeoniflorgenone(芍藥苷)，albiflorin(芍藥內酯苷)，hederagenin(常春藤皂苷元)，bisdemethoxycurcumin(雙去甲氧基姜黃素)是BLRGD抗HF-LC-PLC的核心化學成分。芍藥苷通過調節(jié)巨噬細胞活性、抑制炎癥因子表達、抗細胞凋亡、調節(jié)免疫反應、抑制α-SMA、Collagen-I等纖維化指標的表達及抗氧化應激發(fā)揮護肝作用

。在體外研究中發(fā)現(xiàn)，芍藥苷能促進肝癌細胞凋亡，抑制肝癌侵襲及轉移

。α-常春藤皂苷通過抑制腫瘤細胞增殖、 誘導腫瘤細胞凋亡、溶血活性、增加化療藥物的敏感性、誘導自噬及抑制腫瘤細胞轉移等藥理活性在人類結腸癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用

。雙去甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin)是從姜科植物根莖中提取的天然多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗過敏、神經保護等多種藥理活性。雙去甲氧基姜黃素通過抑制TGF-β1、α-SMA和PI3K/Akt蛋白的表達治療硫代乙酰胺誘導的小鼠肝纖維化

。雙去甲氧基姜黃素能增加ROS生成和AMPK磷酸化水平，抑制p-STAT3表達從而抑制肝癌細胞增殖誘導肝癌細胞凋亡

。

肝癌發(fā)生機制復雜，可能與多種形式的肝炎病毒、長期過量飲酒、長期食用霉變的飲食或受污染的水以及接觸化學毒藥或寄生蟲等因素相關，涉及多基因突變、一系列分子事件的動態(tài)變化，如信號通路活化、炎性細胞聚集、炎性因子過表達及氧化應激等。PPI 網絡互作分析顯示，IL6、MAPK8、CCND1、RELA、ICAM1等為BLRGD抑制HF-PLC的主要靶點， Metabolic pathways、TNF、Pathways in cancer、Wnt signaling pathway 、Chemokine signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway可能為BLRGD抑制HF-PLC的核心通路。提示BLRGD可能調節(jié)炎癥微環(huán)境。

肝細胞癌(HCC)與不同病因引起的慢性炎癥和纖維化有關。炎癥微環(huán)境已被公認為腫瘤的第七大特征。腫瘤的啟動、進展和轉移等幾個階段均與炎癥微環(huán)境的調控有關。巨噬細胞是腫瘤相關的炎癥微環(huán)境中數量最多的一種炎癥細胞，其數量可達炎癥細胞總數的50%。研究亦發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)與HCC的進展及不良預后密切相關

，TAMs在腫瘤組織中主要分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、細胞黏附因子(ICAM)等，激活增殖、轉移及血管生成相關信號通路發(fā)揮促瘤功能

。

網絡藥理學結果提示，BLRGD抗HF-LC-PLC是一個“多成分-多靶點-多通路”的復雜過程，多種成分、全方位的作用機制體現(xiàn)了BLRGD抗HF-LC-PLC 的中醫(yī)藥整體思路。但具體機制目前尚處于基礎研究階段，而網絡藥理學也只是基于生物信息技術對BLRGD抗HF-LC-PLC作用機制的預測。本研究后續(xù)將著手研究BLRGD與炎癥微環(huán)境之間的關系，各核心成分也將在后續(xù)研究中進一步驗證，闡明BLRGD抗HF-LC-PLC “多成分-多靶點”的作用機制。

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