血清lncRNA HOTAIR在肝癌患者中的表達(dá)及臨床診斷意義*

原發(fā)性肝癌(PLC)是全球發(fā)病率第5位癌癥，其致死率在腫瘤相關(guān)死亡病例中位居第3

。肝癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，許多患者在診斷時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，病死率高，早期診斷成為提高PLC患者生存率的關(guān)鍵

。lncRNA在多種腫瘤組織和體液(如血液、唾液和尿液等)中存在異常表達(dá)，且已應(yīng)用于部分腫瘤的早期診斷

，可較早地預(yù)測(cè)疾病的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，在疾病的診治中至關(guān)重要。lncRNA HOTAIR在肝癌中的過(guò)度表達(dá)與其不良預(yù)后、腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)呈正相關(guān)

，可能是肝癌診斷潛在的敏感性指標(biāo)。因此，為驗(yàn)證lncRNA HOTAIR在肝癌患者中的表達(dá)及評(píng)估診斷價(jià)值意義，我們開(kāi)展了本項(xiàng)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年4月至2019年11月就診于杭州市西溪醫(yī)院的PLC患者61例，男50例，女11例，年齡23～84(55.96±12.34)歲。另選取年齡、性別匹配的肝硬化患者20例，男14例，女6例，年齡21～80(53.11±12.28)歲；健康體檢者20例，男13例，女7例，年齡28～56(41.65±9.90)歲。3組受試者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

>0.05)，具有可比性。本研究獲得杭州市西溪醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) PLC組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合我國(guó)2019版PLC診療規(guī)范

臨床診斷為PLC；②肝內(nèi)占位病灶或肝外轉(zhuǎn)移灶活檢、外科手術(shù)切除組織標(biāo)本，經(jīng)病理組織學(xué)和(或)細(xì)胞學(xué)檢查診斷為PLC；③未進(jìn)行手術(shù)、射頻消融、介入治療(PEI、TACE等)、靶向治療、放療、化療及免疫治療等其他治療的初診患者。符合第①和(或)②條，并且同時(shí)符合第③條者。

肝硬化組納入標(biāo)準(zhǔn)：①肝硬化診斷基于肝臟活檢；②影像學(xué)顯示肝臟回聲粗糙呈結(jié)節(jié)狀，肝體積縮小；③有門(mén)脈高壓的征象，如脾大、腹水或靜脈曲張。符合任意一條者。

觀察組無(wú)效4例,有效19例,顯效9例,,總有效率87.5%,對(duì)照組無(wú)效14例,有效17例,顯效5例,總有效率56.25%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=2.52,p<0.05)。

2.2 血清lncRNA HOTAIR表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系 肝癌患者的TNM分期、Child-Pugh肝功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、肝外轉(zhuǎn)移、血管侵犯、癌栓形成、腫瘤大小均與血清高lncRNA HOTAIR表達(dá)量相關(guān)(

<0.05)，而與患者年齡、性別、AFP、功能狀態(tài)(PS)評(píng)分、伴有乙型肝炎、腫瘤數(shù)目方面則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

>0.05)，見(jiàn)表2。

1.3 研究方法

2.4 血清lncRNA HOTAIR對(duì)肝癌TNM分期預(yù)測(cè) ROC分析結(jié)果表明血清lncRNA HOTAIR預(yù)測(cè)肝癌TNM分期的曲線下面積為0.708(95%

=0.573～0.844,

=0.006 8)，最大約登指數(shù)為0.388，最優(yōu)截?cái)嘀禐?.000 151，其敏感性和特異性分別為78.3%、60.5%，見(jiàn)圖2。

2.1 3組受試者血清lncRNA HOTAIR表達(dá)水平情況 見(jiàn)表1。

(3)0～10 cm土層，0.05～0.25 mm和<0.0 5 mm粒徑微團(tuán)聚體有機(jī)碳對(duì)總有機(jī)碳有顯著作用；10～20 cm土層，在1～2 mm、0.05～0.25 mm粒徑，團(tuán)聚體有機(jī)碳對(duì)總有機(jī)碳有顯著作用；20～40 cm和40～60 cm土層有機(jī)碳對(duì)團(tuán)聚體有機(jī)碳影響不明顯。這與植物根系分布深度及耕作施肥深度有關(guān)，同時(shí)也說(shuō)明了紅壤有機(jī)碳的增加通過(guò)形成或進(jìn)入小團(tuán)聚體而實(shí)現(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)所有資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較采用

檢驗(yàn)和單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用 χ

檢驗(yàn)。用受試者工作特征曲線(ROC)評(píng)價(jià)lncRNA HOTAIR的診斷效能，以

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由表4可知，本實(shí)驗(yàn)所選用的模型顯著（P＜0.0001），失擬項(xiàng)P=0.505＞0.05，不顯著；模型的校正系數(shù)RAdj2=0.9911，相關(guān)系數(shù)R2=0.9678，說(shuō)明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可以用此來(lái)分析和預(yù)測(cè)殼聚糖-明膠復(fù)合澄清劑的澄清作用。由表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，殼聚糖對(duì)20%vol紅棗白蘭地透過(guò)率的影響極顯著（P＜0.01），明膠對(duì)20%vol紅棗白蘭地透過(guò)率的影響極顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)AB、A2和B2也對(duì)透過(guò)率影響極顯著（P＜0.01）。這表明各試驗(yàn)因素對(duì)透過(guò)率的影響呈二次關(guān)系，且因素之間存在交互作用。

2 結(jié)果

1.3.2 RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)lncRNA HOTAIR 本研究所有l(wèi)ncRNA檢測(cè)均在杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，檢測(cè)方法采用qRT-PCR法檢測(cè)。采用RNA分離試劑盒(DP503，天根生物科技有限公司)從血清樣品中提取總RNA。對(duì)每個(gè)樣本的每個(gè)基因進(jìn)行 3次重復(fù)試驗(yàn)。以1 μg總 RNA 為模板，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-201，東洋紡生物科技有限公司)合成cDNA。以RNA 18S作為內(nèi)源性參照，采用20 μl qRT-PCR反應(yīng)體系(QPK-201，東洋紡生物科技有限公司)。取cDNA置于PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃ 1 min，95℃ 15 s, 60℃ 40 s，共40循環(huán)；采用2

法測(cè)定lncRNA HOTAIR的相對(duì)表達(dá)量。HOTAIR上游引物：5'-AAACAGAGTCCGTTCAGTGTCA-3'，下游引物：5'-TTCTTAAATTGGGCTGGGTC-3'；內(nèi)參RNA 18S上游引物：5'-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3'，下游引物：5'-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3'。

正常對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、超聲、CT等輔助檢查排除惡性腫瘤、慢性內(nèi)科疾病、傳染病等疾病史的健康者。

PLC是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康

。肝癌的早期發(fā)現(xiàn)可使患者能夠接受早期治療，有效延長(zhǎng)患者生存時(shí)間

。目前血清甲胎蛋白檢測(cè)是PLC早期篩查最常用的檢查方法，但此方法不易發(fā)現(xiàn)早期微小癌灶，靈敏度較差，易漏診

。超聲造影、增強(qiáng)CT、MRI對(duì)于微小癌灶的診斷具有一定優(yōu)勢(shì)，但也存在著創(chuàng)傷性大、費(fèi)用高、患者依從性差等不足，故不適于人群早期大規(guī)模篩查

。因此，尋找能夠在早期診斷PLC的靈敏度及特異性高、創(chuàng)傷小的腫瘤生物標(biāo)志物十分重要，有利于提高PLC患者預(yù)后

。

數(shù)字貨幣是一種以電子形式存在的貨幣，不再像虛擬貨幣一樣局限于網(wǎng)絡(luò)游戲，而是能夠像法幣一樣購(gòu)買真實(shí)的物品。密碼貨幣是數(shù)字貨幣的重要組成之一，利用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拿艽a學(xué)原理進(jìn)行貨幣的產(chǎn)生、記賬和交易。自從第一個(gè)密碼貨幣即比特幣誕生后，諸如以太坊、門(mén)羅幣和零幣等一系列密碼貨幣相繼面世，密碼貨幣市場(chǎng)呈現(xiàn)井噴式發(fā)展；但是密碼貨幣在具有價(jià)值的同時(shí)，也伴隨著一定的風(fēng)險(xiǎn)。分析密碼貨幣的生成和運(yùn)行原理能夠讓人們對(duì)數(shù)字貨幣有更深的理解，從而做到理性投資。

1.3.1 血液樣本采集 血清lncRNA檢測(cè)需要收集所有納入受試者廢棄靜脈血5 ml(肝癌患者選擇術(shù)前3 d內(nèi)廢棄血清)，3 000 r/min高速離心10 min,吸取血清至1.5 ml 無(wú)酶離心管中，-80℃保存。血清AFP測(cè)定需抽取所有納入組成員清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血3 ml, 3 000 r/min高速離心10 min,將血清分離，-80℃保存。

3 討論

2.3 血清lncRNA HOTAIR對(duì)肝癌患者診斷價(jià)值 ROC分析結(jié)果顯示血清lncRNA HOTAIR診斷肝癌的曲線下面積為0.991(95%

=0.975 8～1.000，

<0.001)，最大約登指數(shù)為0.907，最優(yōu)截?cái)嘀禐?.00 004 911，其敏感性和特異性分別為95.7%、95.0%，見(jiàn)圖1。

多項(xiàng)研究表明，在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移等多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程中，lncRNAs都是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子

。而血清lncRNAs能否應(yīng)用于肝癌的早期診斷受到了研究者們的關(guān)注。Wang等

研究發(fā)現(xiàn)血清lncRNA-p21可作為肝炎感染、乙型肝炎肝硬化、酒精性肝病、HBV相關(guān)性肝癌患者肝細(xì)胞損傷的潛在生物標(biāo)志物。Yu等

報(bào)道血清lncRNA PVT1和uc002mbe.2與HCC腫瘤大小、BCLC分期、血清膽紅素相關(guān)。一項(xiàng)納入820例 HCC患者和785例健康者的Meta分析結(jié)果表明，血清lncRNAs在肝癌診斷上具有較高的臨床價(jià)值，可用于輔助肝癌診斷

。

HOTAIR是一種在多種腫瘤中起致癌作用的lncRNA

。研究表明，lncRNA HOTAIR與肝癌密切相關(guān)， Zhong等

研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，在體外實(shí)驗(yàn)中HOTAIR的沉默會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞增殖。Gao等

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HOTAIR對(duì)HCC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制一部分是通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。Yasuyuki等

發(fā)現(xiàn)，肝惡性腫瘤的大小與HOTAIR高表達(dá)相關(guān)，高表達(dá)的HOTAIR是通過(guò)加強(qiáng)ATG7和ATG3表達(dá)使肝癌細(xì)胞的自噬能力增加，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、擴(kuò)散。

建議：不建議術(shù)前長(zhǎng)時(shí)間的禁食禁飲。術(shù)前無(wú)胃腸動(dòng)力障礙或腸梗阻的患者，麻醉前8 h禁食高脂高蛋白食物，麻醉前6 h禁食固體食物，麻醉前2 h可口服300 mL以內(nèi)的清流質(zhì)。

本研究發(fā)現(xiàn)血清lncRNA HOTAIR在PLC患者中的表達(dá)量明顯高于肝硬化組、健康組。在臨床病理因素方面，HOTAIR表達(dá)與肝癌患者的TNM分期、Child-Pugh肝功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、肝外轉(zhuǎn)移、血管侵犯、癌栓形成、腫瘤大小顯著相關(guān)。說(shuō)明PLC惡性程度越高，lncRNA HOTAIR表達(dá)水平越高，提示lncRNA HOTAIR可能參與了PLC的惡性轉(zhuǎn)化及增殖擴(kuò)散過(guò)程。而腫瘤大小一定程度上反映了腫瘤負(fù)荷情況，當(dāng)腫瘤體積較大時(shí)，其合成及釋放的lncRNA HOTAIR會(huì)越多。此外，ROC分析結(jié)果顯示血清HOTAIR對(duì)肝癌診斷的敏感性和特異性分別為95.7%、95.0%，提示了其對(duì)PLC診斷具有較高的潛在價(jià)值；而結(jié)合PLC患者血清lncRNA HOTAIR表達(dá)量明顯高于慢性肝硬化患者的結(jié)果，提示其也可用于慢性肝硬化發(fā)展至肝癌的早期預(yù)防診斷。而血清lncRNA HOTAIR對(duì)肝癌TNM分期的ROC分析結(jié)果顯示敏感性和特異性分別為78.3%、60.5%，當(dāng)HOTAIR表達(dá)量>0.000 151時(shí)，預(yù)示腫瘤惡性程度可能更高。

綜上所訴，本研究結(jié)果提示了血清lncRNA HOTAIR高表達(dá)對(duì)PLC的診斷及慢性肝硬化患者的預(yù)防肝癌監(jiān)測(cè)具有較好的臨床價(jià)值。因本次研究受試者隨訪數(shù)據(jù)不夠充分，尚未對(duì)血清lncRNA HOTAIR對(duì)PLC患者預(yù)后意義作分析，后續(xù)隨著樣本量擴(kuò)大、隨訪時(shí)間及數(shù)據(jù)更加完善，會(huì)進(jìn)一步研究血清lncRNA HOTAIR能否成為PLC患者預(yù)后監(jiān)測(cè)的有效指標(biāo)。

[1] Yang JD, Hainaut P,Gores GJ，

. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2019, 16(10): 589-604.

[2] Anwanwan D, Singh SK, Singh S，

. Challenges in liver cancer and possible treatment approaches[J]. Biochim Biophys Acta Rev Cancer,2020,1873(1):188314-188325.

[3] Lao Y, Li Q,Li N,

. Long noncoding RNA ENST00000455974 plays an oncogenic role through up-regulating JAG2 in human DNA mismatch repair-proficient colon cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2019, 508(2):339-347.

[4] Yang Z, Zhou L, Wu LM,

. Overexpression of long non-coding RNA HOTAIR predicts tumor recurrence in hepatocellular carcinoma patients following liver transplantation[J]. Ann Surg Oncol,2011, 18(5):1243-1250.

[5] 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)醫(yī)政醫(yī)管局.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)[J].中華肝臟病雜志, 2020, (2): 112-128.

[6] Sia D, Villanueva A, Friedman SL,

. Liver Cancer Cell of Origin, Molecular Class, and Effects on Patient Prognosis[J]. Gastroenterology, 2017, 152(4): 745-761.

[7] Shiani A,Narayanan S,Pena L,

.The role diagnosis and treatment of underlying liver disease for the prognosis of primary liver cancer[J].Cancer Control,2017,24(3):27-41.

[8] Mehinovic L, Islamagic E, Husic SA,

. Evaluation of diagnostic efficiency of alpha-fetoprotein in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma: single-center experience[J]. Open Access Maced J Med Sci, 2018, 6(9): 1668-1673.

[9] Ayuso C, Rimola J, Vilana R,

. Diagnosis and staging of hepatocellular carcinoma (HCC): current guidelines[J]. Eur J Radiol, 2018, 101: 72-81.

[10] Gao YX, Yang TW, Yin JM,

. Progress and prospects of biomarkers in primary liver cancer (Review)[J]. Int J Oncol, 2020, 57(1): 54-66.

[11] Amaral PP, Leonardi T, Han N,

. Genomic positional conservation identifies topological anchor point RNAs linked to developmental loci[J]. Genome Biol, 2018, 19(1): 32-40.

[12] Wang S, Jiang J, Zhang C,

. Serum lincRNA-p21 expression in primary liver diseases and liver metastatic diseases[J]. Pathol Res Pract, 2019, 215(4): 779-783.

[13] Yu J, Han J, Zhang J,

. The long noncoding RNAs PVT1 and uc002mbe.2 in sera provide a new supplementary method for hepatocellular carcinoma diagnosis[J]. Medicine (Baltimore), 2016, 95(31):4436-4447.

[14] Zheng C, Hao H, Chen L,

. Long noncoding RNAs as novel serum biomarkers for the diagnosis of hepatocellular carcinoma: a systematic review and meta-analysis[J]. Clin Transl Oncol, 2017, 19(8):961-968.

[15] Rajagopal T, Talluri S, Akshaya RL,

. HOTAIR lncRNA: A novel oncogenic propellant in human cancer[J]. Clin Chim Acta, 2020, 503: 1-18.

[16] Zhong DN, Luo YH, Mo WJ,

. High expression of long noncoding HOTAIR correlated with hepatocarcinogenesis and metasta-sis[J].Mol Med Rep, 2018, 17(1): 1148-1156.

[17] Gao JZ, Li J, Du JL,

. Long non-coding RNA HOTAIR is a marker for hepatocellular carcinoma progression and tumor recurrence[J]. Oncol Lett, 2016, 11(3): 1791-1798.

[18] Fujisaka Y, Iwata T, Tamai K,

. Long non-coding RNA HOTAIR up-regulates chemokine (C-C motif) ligand 2 and promotes proliferation of macrophages and myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma cell lines[J]. Oncol Lett, 2018, 15(1): 509-514.