不同病因肝硬化患者腸道菌群變化研究*

肝硬化(LC)是由多種原因引起的肝纖維化，嚴(yán)重危害患者身體健康

。研究表明，腸道菌群與多種肝臟疾病密切相關(guān)

，腸道菌群可通過肝腸軸對肝臟代謝產(chǎn)生影響。肝臟疾病患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)受飲食、營養(yǎng)狀況、酒精攝入、膽汁酸代謝受損等影響

。為了解不同病因肝硬化腸道菌群的特點(diǎn)，本研究應(yīng)用高通量測序方法分析不同病因肝硬化患者及健康受試者的腸道菌群，旨在闡明各組間菌群結(jié)構(gòu)的差異，發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物以及進(jìn)一步研究菌群功能，探討差異菌屬及代謝通路與肝硬化病因的相關(guān)性，為肝硬化的診療提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2018年3月至2019年1月就診于山西省中醫(yī)院符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)的肝硬化患者66例，同時收集健康成年人10例作為健康對照組。肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員修訂的《肝硬化中西醫(yī)結(jié)合診療共識》

。各原發(fā)病分別參考相關(guān)指南和標(biāo)準(zhǔn)

。所有病例資料均經(jīng)過山西省中醫(yī)院倫理委員會審查通過(省中醫(yī)倫字：2016-05006)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的肝硬化患者；健康對照組納入健康自愿者，排除急慢性肝膽及其他消化道疾病，常規(guī)檢查未見異常；自愿參加研究并表示知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠或哺乳期婦女；入院前4周內(nèi)使用抗生素及微生態(tài)制劑者；合并有其他系統(tǒng)性疾病者；有胃腸道感染、潰瘍病及腎功能異常者。

1.3 分組及測序方法 將肝硬化按照病因分為乙型肝炎(HBV)組、丙型肝炎(HCV)組、原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)組和酒精性肝病(ALD)組。

所有糞便樣品均于排便后迅速收集至密閉糞便儲存盒內(nèi)，保存于-80℃的冰箱內(nèi)，統(tǒng)一送至上海派森諾公司檢測。提取糞便樣本總DNA，根據(jù)細(xì)菌16S rRNA V3-V5區(qū)設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，利用Illumina Miseq平臺進(jìn)行高通量測序；測序結(jié)果經(jīng)過Reads拼接，OTUs聚類，物種注釋等，最終得到樣品物種信息。

2.2 測序質(zhì)量評價及多樣性分析 采用高通量測序方法，共測出序列3 121 675條，其中肝硬化患者平均46 194條，健康對照組平均63 202條。代表序列 98 908條，平均長度為435.69 bp，表明當(dāng)前測序深度已足夠反映肝硬化患者及健康對照組腸道菌群多樣性及豐度。

2 結(jié)果

2.4.1 門水平物種分析 門水平分析結(jié)果顯示，各組均以厚壁菌門(

)、放線菌門(

)、變形菌門(

)、擬桿菌門(

)為主，約占總體的90%。放線菌門在各組間具有顯著差異(

<0.05)。HBV組患者腸道放線菌門相對豐度低于健康對照組，擬桿菌門相對豐度高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

<0.05)，見表3。

在當(dāng)?shù)卣凸劫Q(mào)易組織的共同協(xié)作下，在當(dāng)?shù)亟⒉乩C合作社。一方面，請專業(yè)的有經(jīng)驗(yàn)的繡娘，對傳統(tǒng)的、新穎的刺繡技藝進(jìn)行培訓(xùn)；另一方面，為繡娘提供固定的勞作場所，創(chuàng)造人際往來的空間，吸引更多的繡娘加入合作社，在實(shí)現(xiàn)藏繡的量產(chǎn)和質(zhì)量監(jiān)控的同時，有效帶動當(dāng)?shù)貗D女就業(yè)。除此以外，合作社還是一個社區(qū)互助組織，可以充分使用公平貿(mào)易公益反饋資金在當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)開展“藏繡傳承人計劃”、教育反哺和困難幫扶等項(xiàng)目。

13段第2句，句式比較簡單,但需要區(qū)分兩個介詞to的用法和含義，to whom he was faithful和to the day of his death，兩者的含義不同，前者是prep+關(guān)系代詞，詞組be faithful to忠實(shí)于某人某物，后者prep表示直到某個時間為止。

2.3 菌群多樣性分析 Alpha多樣性指數(shù)(Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、simpson指數(shù)及shannon指數(shù))比較，健康對照組均高于肝硬化各組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

>0.05)，見表2。其中，chao1指數(shù)及ACE指數(shù)反映菌群豐富度；simpson指數(shù)及shannon指數(shù)反映菌群多樣性。說明肝硬化組各組患者菌群多樣性及豐度較健康對照組有所下降，以丙型肝炎和酒精性肝病下降最為顯著。

2.4.3 功能分析 對差異菌屬進(jìn)行代謝功能預(yù)測，結(jié)果顯示KEGG二級通路中，與健康對照組相比，HBV組聚糖的生物合成與代謝上調(diào)，心血管疾病與循環(huán)系統(tǒng)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(

<0.05)；與健康對照組相比，HCV組氨基酸代謝上調(diào)，免疫系統(tǒng)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(

<0.05)；PBC組遺傳信息復(fù)制與修復(fù)通路上調(diào)，與健康對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(

<0.05)，見圖2。

2.4.2 屬水平差異物種分析 屬水平共篩選出18種差異物種，分別為費(fèi)桿菌屬(

)、腸球菌(

)、柯林式菌屬(

)、腸桿菌(

)、 乳球菌(

)、乳酸菌(

)、桿菌屬(

)、毛螺菌屬(

)、棒桿菌科(

)、雙歧桿菌(

)、致病桿菌屬(

)、亮粘菌(

)、伯克霍爾德氏菌(

)、迷走球菌(

)、嗜果菌(

)、短v屬(

)、腸球菌(

)、不動桿菌(

)，見圖 1。

2.4.4 優(yōu)勢菌群分析 為了進(jìn)一步篩選出篩選出各組的優(yōu)勢物種，本研究采用LEfSe對所有分類單元物種進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，基于屬水平的潛在生物標(biāo)志物主要有6種。健康對照組優(yōu)勢菌屬為柯林斯氏菌(

)；HBV組優(yōu)勢菌屬為毛螺菌屬(

)、桿菌屬(

)；HCV組優(yōu)勢菌群為腸球菌(

)、乳球菌(

)；ALD組優(yōu)勢菌屬為致病桿菌屬(

)；尚未發(fā)現(xiàn)PBC組中屬水平優(yōu)勢物種，見圖3。

2.1 患者基線情況 肝硬化各組年齡性別與健康對照組(HC)相比無統(tǒng)計學(xué)意義(

>0.05)，肝硬化各組間年齡性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

>0.05)。見表1。

2.4 差異物種分析

2.3.1 爾雅通識課程選課情況。爾雅通識課程作為公共選修課程的補(bǔ)充，學(xué)生按培養(yǎng)方案要求在指定的學(xué)期內(nèi)完成公共選修課程學(xué)習(xí)，醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生主要在通科培養(yǎng)階段即基礎(chǔ)學(xué)習(xí)階段完成公共選修課程學(xué)習(xí)，為臨床通科學(xué)習(xí)階段打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。

成功的品牌定位是服務(wù)價值被認(rèn)同的助推劑。品牌定位是一種創(chuàng)造性的思維活動，它不是針對閱讀推廣服務(wù)本身，而是對潛在讀者的心理所采取的行動。即將服務(wù)定位在讀者的心目中，使其在讀者心中占據(jù)一個有利位置，并與其建立一種內(nèi)在的聯(lián)系，這樣，當(dāng)讀者的需求一旦產(chǎn)生，首先就會想到這個品牌[2]。

2.5 代謝通路-菌群相關(guān)性分析 將優(yōu)勢菌群與差異代謝通路做相關(guān)性分析得出，桿菌屬和毛螺菌屬與心血管疾病呈負(fù)相關(guān)，與免疫系統(tǒng)呈正相關(guān)。腸球菌與免疫系統(tǒng)呈負(fù)相關(guān)，與循環(huán)系統(tǒng)及心血管疾病呈正相關(guān)。致病桿菌屬與遺傳信息復(fù)制和修復(fù)、免疫系統(tǒng)呈負(fù)相關(guān)，見圖4。

近些年來，玉米種植區(qū)玉米粗縮病發(fā)病面積一直上升，危害逐年加重，成為玉米生產(chǎn)的主要病害之一。通過近些年對玉米粗縮病發(fā)生的影響因素做了分析，了解了玉米粗縮病的發(fā)生原因，并找到了防治該病的有效措施。

3 討論

本研究通過高通量測序獲得代表序列有98 908條，平均測序長度為435.69 bp，說明采用該方法適用于肝硬化及健康人群腸道菌群的差異分析。Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示相較于健康對照組，肝硬化患者腸道菌群多樣性及豐度有所下降，與文獻(xiàn)報道一致

，以丙型肝炎和酒精性肝病下降最為明顯。研究表明

，相比其他慢性肝硬化，丙型肝炎導(dǎo)致的肝硬化腸道菌群多樣性下降更為明顯，這與本研究結(jié)果相一致。

從菌群結(jié)構(gòu)上看，各組在門水平均以厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門為主。與健康對照組相比，HBV組放線菌門相對豐度降低，擬桿菌門相對豐度增高。屬水平上差異物種共有18種，經(jīng)優(yōu)勢物種篩選，最終確定6種潛在生物標(biāo)志物。健康對照組中柯林斯氏菌相對豐度較肝硬化組明顯增多。HBV組患者桿菌屬和毛螺菌屬具有優(yōu)勢。相關(guān)研究表明，毛螺菌屬可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，具有抗炎作用

。本研究中對于菌群功能的分析發(fā)現(xiàn)，桿菌屬和毛螺菌屬可提高機(jī)體免疫，降低心血管疾病風(fēng)險，從功能上屬有益菌，可能對乙型肝炎病毒的清除具有積極作用。HCV組中腸球菌和乳球菌相對豐度增加，為潛在生物標(biāo)志物，這與以往研究結(jié)果相一致

。腸球菌為條件致病菌，過度增多會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，對機(jī)體代謝產(chǎn)生影響。ALD組患者中致病桿菌屬具有優(yōu)勢，推測致病桿菌屬可能與體內(nèi)乙醇代謝有關(guān)。本研究中致病桿菌屬可影響機(jī)體免疫系統(tǒng)和遺傳信息的復(fù)制與修復(fù)，以往研究表明酒精性肝病與遺傳因素相關(guān)

，而腸道菌群是否通過遺傳因素來影響酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展仍有待進(jìn)一步探討。

對于菌群代謝通路的分析發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，肝硬化組與生物系統(tǒng)、代謝、疾病相關(guān)代謝通路出現(xiàn)顯著差異，表明肝硬化患者出現(xiàn)明顯代謝失調(diào)，循環(huán)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂，從而增加了某些疾病發(fā)生的風(fēng)險。這些研究為肝硬化病機(jī)的闡明及相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)測提供了一定的理論基礎(chǔ)。腸道菌群失調(diào)可能是肝硬化相關(guān)并發(fā)癥如肝性腦病、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎等發(fā)生的重要因素

。

綜上所述，肝硬化組中顯著上調(diào)的細(xì)菌主要為致病菌，可在腸黏膜屏障受損、機(jī)體免疫力降低及菌群失調(diào)時對人體產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致或加重疾病的發(fā)生發(fā)展。不同病因所致肝硬化患者與健康受試者的腸道菌群存在顯著差異。腸道菌群失調(diào)是導(dǎo)致肝硬化的一個重要原因。相關(guān)研究表明調(diào)節(jié)腸道菌群可降低肝硬化患者血漿內(nèi)毒素水平，改善肝功能

。本研究通過分析不同病因肝硬化患者腸道菌群的差異性，提出不同病因肝硬化的潛在生物標(biāo)志物。通過相關(guān)性分析揭示了肝硬化病因-菌群-代謝通路的相互關(guān)聯(lián)，闡明了腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能的改變在肝硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了潛在的致病或治療作用。同時為尋找肝硬化的生物學(xué)標(biāo)志物和預(yù)測相關(guān)并發(fā)癥提供了新的思路，以及為后續(xù)以腸道菌群或代謝通路為靶點(diǎn)干預(yù)肝硬化的發(fā)生發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。

[1] 徐增銀,雷欣博鵬,雷陵.雷陵主任醫(yī)師分型辨治肝硬化的經(jīng)驗(yàn)[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2020,30(5):462-464.

[2] 盧峪霞,楊長青.腸道微生態(tài)與慢性肝病研究進(jìn)展[J].肝臟,2019,24(1):92-95.

[3] Yang R, Xu Y, Dai Z,

. The immunologic role of gut microbiota in patients with chronic HBV infection[J]. J Immunol Res，2018,25(7):2018:2361963.

[4] 中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會.肝硬化中西醫(yī)診療共識[J].中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2011,19(4):277-279.

[5] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會,中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會. 慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版) [J]. 臨床肝膽病雜志, 2015, 31(12): 1941-1960.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會,中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會. 丙型肝炎防治指南(2015年更新版) [J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志, 2015, 31(12): 1961-1979.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組. 酒精性肝病診療指南[J]. 中國肝臟病雜志(電子版), 2010, 2(4):49-53.

[8] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會,中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會,中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會. 原發(fā)性膽汁性肝硬化(又名原發(fā)性膽汁性膽管炎)診斷和治療共識(2015) [J].肝臟,2015,20(12):960-968.

[9] Borrelli A, Bonelli P, Tuccillo FMU,

. Role of gut microbiota and oxidative stress in the progression of non-alcoholic fatty liver disease to hepatocarcinoma:Current and innovative therapeutic approaches[J]. Redox Biol, 2018, 15:467-479.

[10] Heidrich B, Vital M, Plumeier I,

. Intestinal microbiota in patients with chronic hepatitis C with and without cirrhosiscompared with healthy controls[J].Liver Int，2018,38,50-58

[11] 王藝璇,李煒,程丹穎,等.乙型肝炎失代償期肝硬化患者腸道菌群特征[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版),2019,13(2):110-116.

[12] Inoue T, Nakayama J, Moriya K,

. Gut dysbiosis associated with hepatitis C virus infection[J].Clin Infect Dis, 2018，67(6):869-877．

[13] Wei X,Zhao J,Jia X,

.Abnormal gut microbiota metabolism specific for liver cirrhosis[J].Front Microbiol, 2018,12(10):3051.

[14] Tilg H, Cani PD, Mayer EA. Gut microbiome and liver diseas-es[J]. Gut, 2016, 65(12):2035-2044.

[15] 王文君,高沿航.中國日益增加的酒精性肝病負(fù)擔(dān)[J].臨床肝膽病雜志, 2019, 35(9):2044.

[16] Bajaj JS, Heuman DM, Hylemon PB,

. Altered profile of human gut microbiome is associated with cirrhosis and its complications[J]. J Hepatol,2014，60(5):940-947.

[17] 岳貴紅,曹海芳.腸道菌群調(diào)節(jié)對肝硬化患者血漿內(nèi)毒素及肝功能的影響[J].肝臟,2018,23(12):1096-1099.