百菌清對(duì)楊樹爛皮病的抑制機(jī)理初步分析

紀(jì)純陽

（遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213）

楊樹作為主要的造林樹種，在遼寧省內(nèi)栽培廣泛，品種多樣[1]。近些年，因受自然因素和人為因素的影響，導(dǎo)致楊樹用材林和防護(hù)林病蟲害發(fā)生嚴(yán)重，直接影響楊樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]，如何安全有效的防治楊樹病蟲害，仍是目前需要深入研究的課題。

楊樹爛皮病是楊樹重要的枝干病害之一[4]，病原菌無性階段為金黃殼囊孢菌Cytospora chrysosperma（Pers.）Fr.，有性階段為污黑腐皮殼Valsa sordidaNit.[3,5]。楊樹生長(zhǎng)過程中發(fā)生凍害、日灼、干旱等自然災(zāi)害時(shí)，就會(huì)引起楊樹樹勢(shì)衰弱、干部創(chuàng)傷，爛皮病大面積發(fā)生，甚至枯死，嚴(yán)重時(shí)造成楊樹大片死亡[6-7]。通常采用化學(xué)農(nóng)藥來防治楊樹爛皮病，而且抑制機(jī)理研究報(bào)道很少。本研究選用了一種保護(hù)型殺菌劑—百菌清，初步分析其對(duì)楊樹爛皮病病原菌的抑菌機(jī)理，為楊樹爛皮病病害科學(xué)防治提供一定的理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌株

楊樹爛皮?。?8513），購自中國林業(yè)科學(xué)院林業(yè)菌種保存中心。

1.2 藥劑

百菌清（有效成分75%，利民化學(xué)有限責(zé)任公司），丙二醛試劑盒（南京建成A003-1），考馬斯亮藍(lán)G-250（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），牛血清白蛋白（BioFroxx）。

1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲生長(zhǎng)量和生物量的影響試驗(yàn)

2.1.1 帶藥培養(yǎng)基的制備

將配置好的PDA 培養(yǎng)基等量分裝于大三角瓶中，高壓滅菌，在無菌條件下將預(yù)先稱好的不同質(zhì)量百菌清藥劑加入到冷卻至40 ℃左右的培養(yǎng)基中，使藥劑在培養(yǎng)基中最終稀釋1 000、800、600 和400倍液。固體培養(yǎng)基在加入藥劑后混合均勻直接倒入無菌平皿中，冷卻后封口備用。液體培養(yǎng)基待接種后完全冷卻備用。每組處理5次重復(fù)[8-9]。

2.1.2 接種及培養(yǎng)

在無菌條件下，用直徑為5 mm的打孔器在預(yù)培養(yǎng)菌株平面上打成圓形的菌絲片，取一片菌絲片接種于帶藥固體培養(yǎng)基的中間，使菌絲表面與固體培養(yǎng)基表面接觸，用封口膜封口，放置于25 ℃生物培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)。當(dāng)對(duì)照菌絲生長(zhǎng)至平皿邊緣時(shí)停止生長(zhǎng)，采用十字交叉法測(cè)量菌絲的生長(zhǎng)直徑，并做數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析[10-11]。

取兩片菌絲片接種于帶藥液體培養(yǎng)基中，封口并放置于25 ℃搖床中暗培養(yǎng)。以不加藥劑為對(duì)照組，當(dāng)對(duì)照組長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基時(shí)，終止培養(yǎng)，取出菌絲用無菌蒸餾水沖洗干凈，用8層紗布過濾擰干，冷凍干燥后稱量干重，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析[12-13]。

2.2 百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響試驗(yàn)

采用TBA 法進(jìn)行MDA 含量測(cè)定。取對(duì)照和帶藥處理組的干菌絲0.1 g，加入到冷凍研缽中，再加液氮研磨成粉末狀，放于10 mL無菌離心管中，用冷生理鹽水稀釋至10 mL,4 ℃條件下2 500 r/min超低溫離心5 min，取適量上清液按照南京建成A003-1試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定丙二醛的含量[14-15]。

2.3 百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響試驗(yàn)

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定菌絲內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量[16]，以牛血清白蛋白為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。取對(duì)照和帶藥處理組的干菌絲0.1 g 放于冷凍的研缽中，迅速加液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至無菌10 mL離心管中，用冷生理鹽水稀釋至10 mL，取各樣品液0.1 mL，加入0.9 mL無菌去離子水，再加入5mL考馬斯亮藍(lán)溶液，混勻后放置2 min，以加等量無菌去離子水為對(duì)照，每組3次重復(fù)。測(cè)量各樣品OD595nm，用對(duì)照管調(diào)零，并通過蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量[17-18]。

3 結(jié)果與分析

3.1 百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲生長(zhǎng)及生物量的影響

楊樹爛皮病病原菌在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)比較慢，8 d 時(shí)對(duì)照菌絲長(zhǎng)至平皿邊緣，而帶藥培養(yǎng)基上的菌絲幾乎向外未延伸。此時(shí)采用十字交叉法測(cè)量各組的菌絲生長(zhǎng)直徑并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如表1。1 000 倍稀釋液的抑制率為78.81 %±3.46 %b，而600 倍稀釋液的抑制率為85.04 %±2.12 %ab。各組間菌絲生長(zhǎng)直徑和抑制率在P＜0.05水平上存在顯著性差異。確定不同稀釋倍數(shù)的百菌清藥劑對(duì)楊樹爛皮病有不同程度的抑制作用。抑制率隨稀釋倍數(shù)的增加（濃度降低）而降低。

楊樹爛皮病菌在液體PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d時(shí)，對(duì)照組菌絲已長(zhǎng)滿整個(gè)液體發(fā)酵培養(yǎng)基。結(jié)果如表1。對(duì)照組100 mL 發(fā)酵液中菌絲干重為76.08±1.89a mg，而處理組菌絲干重明顯低于對(duì)照組，800倍稀釋液處理組100 mL發(fā)酵液的菌絲干重為8.79±1.59c mg，而400倍稀釋液的為3.84±1.34e mg?？梢姴煌♂尡稊?shù)百菌清藥劑對(duì)楊樹爛皮病菌絲生長(zhǎng)及生物量都有影響，能顯著抑制菌絲的生長(zhǎng)。

表1 百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲生長(zhǎng)及生物量的影響結(jié)果

3.2 百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響

MDA 含量是菌絲細(xì)胞膜過氧化程度的體現(xiàn)，MDA 含量高，說明細(xì)胞膜過氧化程度高，細(xì)胞膜受到的傷害嚴(yán)重。百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)MDA 含量結(jié)果見圖1。爛皮病菌發(fā)酵培養(yǎng)12 d 后，對(duì)照組菌絲體內(nèi)MDA 含量為1.10±0.19 mmol/g，800倍百菌清稀釋液的菌絲體內(nèi)MDA含量為1.91±0.35 mmol/g，而400 倍百菌清稀釋液的菌絲體內(nèi)MDA 含量為2.07±0.41 mmol/g。處理組的MDA 含量明顯高于對(duì)照組，并隨著藥劑的稀釋倍數(shù)的減少（藥劑濃度增大）而增多，并在P＜0.05 水平上呈現(xiàn)顯著性差異?？梢姉顦錉€皮病菌絲受到百菌清藥劑脅迫時(shí)，膜質(zhì)過氧化程度加劇，細(xì)胞膜受到損傷，導(dǎo)致MDA含量增多。

圖1 百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)丙二醛含量的影響

3.3 百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：蛋白質(zhì)含量（Y）與吸光值OD595（x）的回歸方程為：Y=0.006 6x+0.012 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9。根據(jù)試驗(yàn)測(cè)得的各處理組OD595計(jì)算出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量。結(jié)果見圖2。爛皮病菌絲發(fā)酵培養(yǎng)12 d后，對(duì)照菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量為6.29±0.96 μg/mL，800倍百菌清稀釋液的菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量為1.21±0.57 μg/mL，而400倍百菌清稀釋液的菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量為0.33±0.14 μg/mL，處理組的可溶性蛋白質(zhì)含量明顯低于對(duì)照組，并隨著稀釋倍數(shù)減小菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量也隨之減少?？梢姲倬迥苊黠@抑制楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)含量降低。

圖2 百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

4 結(jié)論與討論

百菌清作為一種保護(hù)性殺菌劑，被廣泛應(yīng)用于林木病害防治。本研究主要從百菌清對(duì)楊樹爛皮病菌絲的生長(zhǎng)和生物量的影響，及對(duì)菌絲體內(nèi)丙二醛和可溶性蛋白質(zhì)含量四個(gè)方面初步分析了百菌清對(duì)楊樹爛皮病的抑菌機(jī)理。通過試驗(yàn)表明，百菌清能明顯抑制楊樹爛皮病菌絲的生長(zhǎng)和生物量；破壞菌絲細(xì)胞，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度增大，細(xì)胞受損嚴(yán)重，導(dǎo)致丙二醛含量增大；能顯著抑制楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)含量降低。

在今后試驗(yàn)中，還要開展更深層次的抑菌機(jī)理研究，主要從對(duì)菌絲體內(nèi)各種合成與代謝相關(guān)酶活性的影響以及分子水平進(jìn)行相關(guān)研究。期待為楊樹爛皮病的防治提供科學(xué)依據(jù)，為百菌清在林業(yè)病蟲害防治中的推廣與應(yīng)用提供一定的理論支持。