藜麥愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖試驗(yàn)

田 娟 加央多拉 張 曼 孫墨可 董玉迪 王春龍 李春花 賈云峰 郭來(lái)春 魏黎明

（吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 吉林白城 137000）

藜麥屬于雙子葉一年生藜科植物，別稱南美藜、藜谷、奎奴亞藜等，是一種安全的堿性食物，在南美洲大陸有幾千年的栽培歷史[1]。 藜麥?zhǔn)锹?lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的唯一的單體植物就可以滿足人體全部基本物質(zhì)需求的完美全營(yíng)養(yǎng)食品，被譽(yù)為“未來(lái)的超級(jí)谷物”“營(yíng)養(yǎng)黃金”“有機(jī)谷類之王”[2]。 藜麥適應(yīng)環(huán)境能力較強(qiáng)，能夠適應(yīng)鹽堿、寒冷和干旱等惡劣環(huán)境[3]，在世界各地區(qū)的引種栽培面積逐年擴(kuò)大。 國(guó)內(nèi)接連開展了藜麥新品種選育[4]、栽培技術(shù)改進(jìn)[5-6]、抗逆性[7]、病害防治[8]、生物學(xué)特性評(píng)價(jià)[9]、品質(zhì)分析[10]及分子研究[11]等工作。 藜麥為異源四倍體（2n＝4x＝36）[12]，自然異交率為 10%～17%， 群體的基因組成多為雜合型，遺傳不穩(wěn)定。 而植物組織培養(yǎng)技術(shù)能夠保持母本的遺傳性狀， 解決藜麥優(yōu)良品種有性繁殖性狀分離的問(wèn)題。 國(guó)內(nèi)外有關(guān)藜麥組培快繁的研究報(bào)道相對(duì)較少。 2005年，Eisa 等[13]以藜麥下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷組織， 首次實(shí)現(xiàn)了體細(xì)胞胚再生; 2016年，Hesami等[14]以藜麥下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并分化出叢生芽;2021年，王燕芳和宋時(shí)奎[15]對(duì)藜麥愈傷組織誘導(dǎo)和分化條件進(jìn)行初探，吳筱林[16]對(duì)藜麥離體培養(yǎng)無(wú)性繁殖體系進(jìn)行建立。 本研究以白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院系選品系藜麥（編號(hào)：2013-BL113）和臺(tái)灣紅藜為材料，對(duì)藜麥莖段、子葉不同外植體在不同培養(yǎng)基上對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效果進(jìn)行比較， 同時(shí)對(duì)莖段的愈傷組織增殖體系進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)， 旨在為藜麥再生組培和快繁體系的建立提供一定技術(shù)支撐， 為藜麥優(yōu)質(zhì)基因資源的發(fā)掘、 功能驗(yàn)證和藜麥分子遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藜麥來(lái)源于白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 系選品系（編號(hào)為2013-BL113）和臺(tái)灣紅藜。

1.2 藜麥無(wú)菌苗的培育

試驗(yàn)于 2020年10月至 2021年5月在白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 選取成熟籽粒飽滿的藜麥種子，用流動(dòng)的水清洗干凈，清洗時(shí)間1 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用75%乙醇消毒30 s，無(wú)菌水沖洗 5 min，再用 10% 次氯酸鈉(NaClO，有效氯濃度≥10%)處理22 min，用無(wú)菌水沖洗5 min。無(wú)菌條件下，將消毒過(guò)的種子整齊地?cái)[在滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿里放入2 張濾紙， 倒入無(wú)菌水浸濕濾紙， 25℃16 h/8 h 光照周期下培養(yǎng)4~6 d，獲得無(wú)菌苗備用。

1.3 愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)

將無(wú)菌苗的莖段和子葉剪成長(zhǎng)0.5 cm 的小段，分別斜插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS 和C17兩種培養(yǎng)基。 加入不同濃度的2,4-D，分別為0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.2 mg/L、1.6 mg/L、2.0 mg/L。每個(gè)處理重復(fù)3 次。在 25℃、16 h/8 h 光照周期下培養(yǎng) 25 d，統(tǒng)計(jì)每個(gè)品種不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)情況。誘導(dǎo)率計(jì)算公式：誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.4 愈傷組織增殖試驗(yàn)

將2013-BL113 和臺(tái)灣紅藜2個(gè)品種培養(yǎng)25 d莖的初代愈傷組織，接種到MS 附加不同激素的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。 每處理接種3 瓶，每瓶接種5 塊愈傷組織，每處理總計(jì)15 塊。20 d 后，取出愈傷組織稱量鮮質(zhì)量， 以愈傷組織增殖率為指標(biāo)進(jìn)行最佳培養(yǎng)基篩選。

愈傷組織增殖率=（m2-m1）/m1×100%。式中，m1為初代愈傷組織質(zhì)量；m2為培養(yǎng)25 d 后的質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用WPS 2019 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，方法參照秦正國(guó)等[17]的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果分析

由表1 可知， 藜麥莖段對(duì)基因型和培養(yǎng)基的包容性非常大，很適合用來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織，在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率都達(dá)到了100.00%。不同品種之間子葉愈傷組織的誘導(dǎo)率存在很大差異， 相同品種在不同激素濃度下子葉愈傷組織誘導(dǎo)率也不同（附圖）。2個(gè)藜麥品種的子葉愈傷組織的誘導(dǎo)率相差很大， 臺(tái)灣紅藜子葉在MS 和C17 上都隨著2,4-D 濃度升高誘導(dǎo)率先升高后降低， 最佳2,4-D 濃度濃度為1.6 mg/L，誘導(dǎo)率能達(dá)到100.00%，2種基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率都很高， 平均分別能達(dá)到96.50%和 95.33%。 2013-BL113 子葉在在MS 和C17 上都隨著2,4-D 濃度升高誘導(dǎo)率也是先升高后降低， 但是2,4-D 最佳濃度為1.2 mg/L， 并且2種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率相差很大，平均分別能達(dá)到88.83%和51.17%。 由此可見，藜麥愈傷組織誘導(dǎo)敏感性存在品種差異， 雖然用莖段、 子葉均能誘導(dǎo)出愈傷組織， 但莖段對(duì)基因型和培養(yǎng)基的包容性非常大， 更適合用作誘導(dǎo)愈傷組織的外植體， 相比C17 培養(yǎng)基， MS 更適合藜麥子葉愈傷組織的誘導(dǎo)。

附圖 不同子葉在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的出愈示意

表1 不同外植體在不同培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率（單位：%）

2.2 愈傷組織增殖結(jié)果分析

將臺(tái)灣紅藜和2013-BL113 莖段愈傷組織接種到不同激素處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d， 稱量接種前后的愈傷組織質(zhì)量， 可以獲得不同激素處理對(duì)愈傷組織增殖的影響。 由表2 可知，不同品種愈傷組織增殖率存在很大差異， 平均增殖率為233.18%～424.46%，愈傷組織的增殖率不僅與培養(yǎng)基激素組分有關(guān)，也與品種特性有關(guān)。 臺(tái)灣紅藜莖段的愈傷組織生長(zhǎng)較快，不同處理下增殖率較高，均值達(dá)424.46%，2013-BL113 莖段的愈傷組織生長(zhǎng)相對(duì)較慢，不同處理下增殖率均值為233.18%。臺(tái)灣紅藜的增殖能力優(yōu)于2013-BL113。 臺(tái)灣紅藜和 2013-BL113 在 2，4-D（A）、6-BA（B）、NAA（C）和 KT（D）四因素三水平正交試驗(yàn)下平均增殖率分別為424.46%和233.18%。 由表 3 可知，臺(tái)灣紅藜主次順序?yàn)?B＞D＞C＞A，最優(yōu)組合為A1B3C1D3， 增殖率為797.89%。 由表4 可知，2013-BL113 主次順序?yàn)?B＞A＞D＞C， 最優(yōu)組合為A1B1C1D1，增殖率為300.00%。 2個(gè)藜麥品種最優(yōu)組合不同， 說(shuō)明不同的藜麥品種有不同的最佳增殖培養(yǎng)基。 但是2個(gè)品種B 都為最主要因素，說(shuō)明 6-BA對(duì)藜麥愈傷組織的增殖影響最大。

表2 不同來(lái)源愈傷組織在不同培養(yǎng)基中的增殖率

表3 臺(tái)灣紅藜正交試驗(yàn)L9（34）正交表及試驗(yàn)結(jié)果

表4 2013-BL113 正交試驗(yàn)L9（34）正交表及試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

開展組織培養(yǎng)研究對(duì)于藜麥優(yōu)良種質(zhì)資源保存、新品種選育及遺傳學(xué)特征研究等具有十分重要的意義[18]。本研究中藜麥莖段對(duì)基因型和培養(yǎng)基的包容性非常大，在不同培養(yǎng)基上2,4-D 濃度在0.4～2.0 mg/L范圍內(nèi)誘導(dǎo)率都達(dá)到了100.00%，但不同品種之間子葉愈傷組織的誘導(dǎo)率存在很大差異， 相同品種在不同激素濃度下子葉愈傷組織誘導(dǎo)率也不同， 藜麥莖段更適合用作誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。這與俞涵譯[19]和曹寧[20]認(rèn)為對(duì)于藜麥而言，子葉和莖段均可作為外植體成功地誘導(dǎo)出愈傷組織并形成再生植株， 但莖段的誘導(dǎo)率明顯優(yōu)的結(jié)果是一致的。 在其他作物中也有相似的結(jié)果，比如安桂花等對(duì)高山紅景天[21]、張勃等對(duì)紫花苜蓿[22]的研究都認(rèn)為莖段比子葉更適合作為外植體。

2,4-D 通常是起決定作用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要作用于誘導(dǎo)愈傷組織形成、促進(jìn)生根等，在植物組織培養(yǎng)中廣泛使用[23]。Kim 研究了在2種基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，只有2,4-D 的適量濃度才會(huì)增加外植體的出愈率， 使用過(guò)量或低濃度少量使用都不利于愈傷組織的形成[24]。本研究2個(gè)藜麥品種的子葉愈傷組織在不同培養(yǎng)基中在2,4-D 濃度0.4～2.0 mg/L 范圍內(nèi)都隨著濃度升高誘導(dǎo)率先升高后降低，同一品種在不同培養(yǎng)基中隨著2,4-D 濃度的變化誘導(dǎo)率的變化趨勢(shì)一致，但是不同品種的最佳2,4-D 濃度不同。 臺(tái)灣紅藜子葉的最佳2,4-D 濃度為1.6 mg/L，2013-BL113子葉2,4-D 最佳濃度為1.2 mg/L，這與俞涵譯[19]的研究結(jié)果MS+0.5 mg/L 2,4-D 為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同，可能是因?yàn)樗玫耐庵搀w為藜麥莖段， 本研究外植體為藜麥子葉，并且所選用的藜麥品種也不同。 所以在藜麥子葉誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，2,4-D 的濃度要根據(jù)基因型不同適量選擇，建議濃度在1.2～1.6 mg/L。

常用的基本培養(yǎng)基有多種，田娟等[25]在燕麥成熟胚培養(yǎng)中對(duì)比了W14 和MS 2種基本培養(yǎng)基， 結(jié)果顯示，在其他情況都相同的情況下，基本培養(yǎng)基W14要比MS 出愈率高，并且基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織出愈率的影響差異顯著。 本研究中藜麥莖段對(duì)培養(yǎng)基的包容性很大，但是子葉就有所不同。 臺(tái)灣紅藜子葉在MS 和C17 培養(yǎng)基中的平均誘導(dǎo)率分別為96.50%和95.33%，2013-BL113 子葉愈傷組織的平均誘導(dǎo)率分別為88.83%和51.17%。 2種基本培養(yǎng)相比較，MS 優(yōu)于C17。

組培體系中， 愈傷組織增殖速度關(guān)系到組培體系效率[26]。 高麗麗等[27]的研究表明，秈稻愈傷組織的增殖與品種特性有。 俞涵譯[19]等認(rèn)為，藜麥不同品種愈傷組織增殖率存在很大差異， 增殖率為52%～268%，愈傷組織的增殖率不僅與品種特性有關(guān)，也與培養(yǎng)基激素組分有關(guān)，處理Ⅳ（MS+0.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA） 愈傷組織增殖率最高，達(dá)到268.3%，處理Ⅳ為最優(yōu)增殖培養(yǎng)基。本研究不同藜麥品種愈傷組織增殖率存在很大差異， 平均增殖率為233.18%～424.46%，臺(tái)灣紅藜和2013-BL113 在2，4-D（A）、6-BA（B）、NAA（C）和 KT（D）四因素三水平正交試驗(yàn)下平均增殖率分別為424.46%和233.18%。 臺(tái)灣紅藜的最優(yōu)組合為A1B3C1D3（MS +0.4 mg/L 2，4-D + 2.0 mg/L 6BA +0.1 mg/L NAA+1.2 mg/L KT）， 增殖率為 797.89%，2013-BL113 的最優(yōu)組合為 A1B1C1D1（MS +0.4 mg/L 2，4-D + 1.0 mg/L 6BA+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L KT），增殖率為 300.00%。本研究2個(gè)藜麥品種的增殖率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于俞涵譯選用的藜麥品種的增殖率，可能原因：一是由于基因型的不同；二是對(duì)比激素，本研究多添加了6-BA 導(dǎo)致增殖率高。 在本研究中不同的藜麥品種B 都為最主要因素，也說(shuō)明了6-BA 對(duì)藜麥愈傷組織的增殖影響最大。 這與段鵬慧等[28]認(rèn)為6-BA 對(duì)藜麥腋芽的增殖作用較 KT 好結(jié)果相似。