碳離子束誘變選育高產(chǎn)角鯊烯類酵母及電轉(zhuǎn)化初探

肖 艷，王 璐，王 森，叢培虎，陸 棟，馮銀剛，崔 球，宋曉金

1. 中國科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實驗室/山東省合成生物學(xué)重點(diǎn)實驗室/山東省能源研究院/中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，山東 青島 266101

2. 山東大學(xué) 澳國立聯(lián)合理學(xué)院，山東 威海 264209

3. 山東省科技服務(wù)發(fā)展推進(jìn)中心，山東 濟(jì)南 250101

4. 中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000

角鯊烯 (Squalene, C30H50) 是一種含有6個雙鍵的開鏈線性三萜，主要存在于深海鯊魚肝油中，少部分存在于細(xì)菌、真菌、微藻和植物中[1-2]。角鯊烯具有抗腫瘤、耐缺氧、抗氧化、抗輻射和細(xì)胞保護(hù)等生物活性[3]，已在水產(chǎn)、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[4-5]。在水產(chǎn)領(lǐng)域，提升水產(chǎn)動物體內(nèi)的角鯊烯含量可明顯增強(qiáng)其非特異性免疫細(xì)胞水平和抗病力。給羅非魚 (Oreochromis spp.) 注射角鯊烯可提高其巨噬細(xì)胞增殖量，獲得了更多的非特異性免疫細(xì)胞[6]。此外，角鯊烯被認(rèn)為是優(yōu)良的黏膜免疫佐劑而應(yīng)用于魚類口服疫苗開發(fā)中[7]。

目前，鯊魚肝油仍然是角鯊烯的主要來源，但不同種類鯊魚肝油中的角鯊烯含量差異顯著[8]，隨著海洋污染的加劇和鯊魚資源的過度捕撈，亟需尋找其他可替代的天然資源。微生物發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯是一條綠色可循環(huán)、周期短、可規(guī)?；a(chǎn)的途徑，是工業(yè)化生產(chǎn)角鯊烯的優(yōu)良選擇[9]。裂殖壺菌(Schizochitrium sp.)、大腸桿菌 (Escherichia coli) 和釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 作為經(jīng)典的工業(yè)發(fā)酵微生物，通過基因工程手段提高角鯊烯產(chǎn)量已有報道[9-11]，然而這些微生物自身的角鯊烯產(chǎn)量并不高，選育更具發(fā)酵潛力的微生物菌株[12-13]，利用基因工程手段進(jìn)一步提高角鯊烯產(chǎn)量將是一種更有潛力的手段。Pseudozyma sp. SD301是本項目組自主篩選到的單細(xì)胞海洋類酵母，搖瓶培養(yǎng)時角鯊烯產(chǎn)量達(dá)0.79 g·L-1，具有較高的角鯊烯產(chǎn)量[12]。碳離子 (12C6+) 束輻照誘變育種具有誘變率高、誘變譜寬、突變體穩(wěn)定等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于微生物育種領(lǐng)域[14-16]。本研究以Pseudozyma sp. SD301為出發(fā)菌株，采用12C6+束輻照誘變技術(shù)，選育更加高產(chǎn)角鯊烯的突變株。在此基礎(chǔ)上，以高產(chǎn)突變株為例，開發(fā)高效的電轉(zhuǎn)化方法，用于實現(xiàn)外源基因的表達(dá)，為進(jìn)一步遺傳改良提供了可能，為角鯊烯的微生物發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，并為深海來源的角鯊烯資源提供可能的替代選擇。

1 材料與方法

1.1 菌株

以實驗室自主選育的野生型類酵母Pseudozyma sp. SD301 (CGMCC no. 9687) 作為初始菌株，該野生菌株具有較高的產(chǎn)角鯊烯性能[12]。

1.2 主要試劑

酵母提取物購自英國Oxoid；過氧化氫 (H2O2)和葡萄糖購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉和潮霉素B購自北京索萊寶科技有限公司；角鯊烯購自北京百靈威科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒和膠回收試劑盒均購自O(shè)MEGA生物公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo Scientific公司；2×ES Taq MasterMix購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；2×PCR Besttaq MasterMix購自中國南京愛必夢生物材料有限公司；其余常用生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

GY液體培養(yǎng)基 (1 L)：葡萄糖60 g，酵母提取物20 g，海水晶15 g。

GY固體培養(yǎng)基 (1 L)：葡萄糖60 g，酵母提取物20 g，海水晶15 g，瓊脂粉20 g。

培養(yǎng)條件：菌株在25 ℃、200 r·min-1條件下，使用GY液體培養(yǎng)基活化2次，每次活化2 d(批次培養(yǎng)時，2 d達(dá)指數(shù)生長期，3 d后達(dá)平臺期，此時胞內(nèi)角鯊烯質(zhì)量最高)[12]，然后按照10%接種量轉(zhuǎn)接到搖瓶中培養(yǎng)，在相同條件下繼續(xù)發(fā)酵3 d，之后收集菌體用于菌體干質(zhì)量及角鯊烯質(zhì)量分析。

1.4 12C6+束輻照、突變株的篩選及穩(wěn)定性分析

12C6+束輻照：以SD301為出發(fā)菌株，培養(yǎng)2 d后，將菌液分裝成每管2 mL，用于輻照實驗。12C6+束輻照實驗在中國科學(xué)院近代物理研究所重離子加速器國家實驗室 (Heavy Ion Research Facility in Lanzhou, HIRFL) 進(jìn)行，輻照條件為：采用12C6+束，能量 80 MeV·μ-1，LET 31 keV·μm-1，輻照劑量為0、20、60、90、120、150和180 Gy，每個輻照劑量設(shè)置3個平行樣品。經(jīng)過輻照后的菌液稀釋到1×10-4和 1×10-5，取 100 μL 菌液稀釋液涂布在GY固體平板上，之后25 ℃倒置培養(yǎng)，用于計數(shù)不同輻照劑量對應(yīng)的存活菌落數(shù)。

突變株篩選條件：為了確定產(chǎn)角鯊烯類酵母SD301對H2O2的敏感性，將類酵母SD301菌液稀釋到1×10-5后，涂布在H2O2濃度分別為10、100和1 000 μmol·L-1的平板上培養(yǎng)并記錄菌落數(shù)。

突變株篩選：選擇120、150和180 Gy的12C6+束輻照劑量處理后的菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，進(jìn)行H2O2壓力篩選 (稀釋后的菌液涂布在含有100 μmol·L-1H2O2的 GY 平板上，培養(yǎng) 2 d)，挑取單菌落在25 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)3 d，收集菌體提取角鯊烯，應(yīng)用氣相色譜分析角鯊烯質(zhì)量，每個樣品平行3次測定。

突變株穩(wěn)定性：將獲得的突變株在25 ℃、200 r·min-1條件下，使用50 mL GY液體培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2 d，連續(xù)傳代15次后，測定突變株的角鯊烯質(zhì)量，每個樣品平行3次測定。

1.5 突變株的角鯊烯產(chǎn)量和質(zhì)量分析

將對照菌株SD301和突變株P(guān)S120、PS150和PS180分別接種到GY培養(yǎng)液中25 ℃、200 r·min-1活化2次，之后分別在20 mL培養(yǎng)液和100 mL培養(yǎng)液中批次培養(yǎng)3 d，11 000×g離心2 min收集一定量菌體進(jìn)行冷凍干燥，干燥后稱質(zhì)量計算生物量。稱取 25 mg干菌粉，加入 300 μL 6 mol·L-1鹽酸 (HCl)，在-80 ℃和100 ℃下反復(fù)凍融3次，冷卻后加入 450 μL 氯仿-甲醇溶液 [V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1]、500 μL 飽和氯化鈉 (NaCl) 和 500 μL 正己烷，混勻，10 000×g離心5 min，取上清過有機(jī)濾膜后用于氣相色譜分析角鯊烯質(zhì)量。角鯊烯質(zhì)量根據(jù)角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到。每個樣品平行3次測定。角鯊烯產(chǎn)量根據(jù)角鯊烯質(zhì)量及生物量計算得到。

1.6 質(zhì)粒pYES2-hph和pYES2-hph-egfp的構(gòu)建

以潮霉素B作為遺傳篩選標(biāo)記，潮霉素B的質(zhì)量濃度為300 mg·L-1。以pYES2 (Invitrogen)為初始質(zhì)粒，以HPH(潮霉素B抗性基因) 的DNA為模板，用引物Hph-F/Hph-R擴(kuò)增HPH基因，用BamHI和XhoI雙酶切的方式連接到載體pYES2，構(gòu)建質(zhì)粒pYES2-hph，用引物P-C-F/P-C-R進(jìn)行菌落PCR驗證。以EGFP(增強(qiáng)型GFP基因) 的DNA為模板，用引物P-egfp-F/P-egfp-R擴(kuò)增EGFP基因。用XhoI單酶切質(zhì)粒進(jìn)行線性化，將EGFP基因的PCR產(chǎn)物和線性化載體pYES2-hph (XhoI) 在Exnase的催化下進(jìn)行重組反應(yīng)，之后將反應(yīng)產(chǎn)物加入大腸桿菌Top10的感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化完成后，將細(xì)胞液涂布到含有100 mg·L-1氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。用引物P-egfp-C-F/P-C-R對平板上長出的克隆進(jìn)行菌落PCR驗證，在PCR驗證目的片段大小正確后，使用OMEGA公司的膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收并送到北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。本研究中質(zhì)粒構(gòu)建所用引物見表1。

表1 本研究中質(zhì)粒構(gòu)建所用引物Table 1 Oligonucleotides used in vector construction

1.7 電轉(zhuǎn)化方法

已有研究證實使用醋酸鋰和山梨醇處理Pseudozyma屬細(xì)胞制備的感受態(tài)細(xì)胞有利于提高其電轉(zhuǎn)化效率[17-18]，本研究中使用的電轉(zhuǎn)化方法在Marchand等[18]、Masaaki等[19]和Morita等[20]報道的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)和電壓優(yōu)化。

YC 預(yù)處理液 (1 L)：山梨醇 1 mol·L-1，Tris-HCl 10 mmol·L-1，LiAc 100 mmol·L-1，DTT 10 mmol·L-1，pH 6.4。

CX 細(xì)胞重懸液 (1 L)：1 mol·L-1山梨醇-GY 液體培養(yǎng)基 (V∶V=1∶1)。

YP液體培養(yǎng)基 (1 L)：蔗糖60 g，酵母提取物20 g，海水晶15 g，甘油100 g。

GP固體培養(yǎng)基 (1 L)：半乳糖10 g，蔗糖60 g，酵母提取物20 g，海水晶15 g，瓊脂粉20 g，甘油100 g，潮霉素B 300 mg。

感受態(tài)細(xì)胞制備：菌株在25 ℃、200 r·min-1條件下，使用YP液體培養(yǎng)基活化2次，然后取出1 mL菌液稀釋10倍后測定其在600 nm的光密度(OD)，OD600在1左右即可用于感受態(tài)細(xì)胞制備。取1 mL菌液，在4 ℃、4 000×g離心2 min收集菌體，菌體用1 mL預(yù)冷的無菌蒸餾水洗滌2次，之后用1 mL預(yù)冷的YC預(yù)處理液漂洗2次，再用1 mL預(yù)冷的CX細(xì)胞重懸液洗滌2次，最后用預(yù)冷的CX細(xì)胞重懸液將菌液稀釋250倍，使得細(xì)胞個數(shù)約為 1×108個·mL-1。

電擊條件：將50 μL感受態(tài)細(xì)胞液和5 μg質(zhì)?；靹蚝蠹尤腩A(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯 (Bio-Rad)，冰上靜置15 min，之后置于自主研發(fā)的細(xì)胞電穿孔高壓脈沖發(fā)生器 (SW11-3K) 中電擊。參數(shù)設(shè)置：電壓650、900、1 150和1 400 V，頻率2 000 Hz，占空比10%和脈沖數(shù)40個，電擊后立即加入1 mL的CX細(xì)胞重懸液到電轉(zhuǎn)杯中，并將其轉(zhuǎn)至1.5 mL試管，冰上放置15 min，之后于25 ℃、200 r·min-1復(fù)蘇培養(yǎng)1 h，之后取出100 μL涂布GP固體培養(yǎng)板，之后25 ℃倒置培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)化子驗證：挑取GP固體培養(yǎng)板上長出的單菌落，使用引物P-C-F和P-C-R對pYES2-hphegfp的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證，將擴(kuò)增出的大小正確的目的條帶用OMEGA公司的膠回收試劑盒進(jìn)行回收，并將回收到的PCR產(chǎn)物送到北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與目的序列進(jìn)行比對以確證克隆是否正確。選擇驗證正確的含有質(zhì)粒pYES2-hph-egfp的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8 激光共聚焦顯微鏡分析

在載玻片上滴加40 μL無菌水，挑取驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子均勻分散到無菌水中，加上蓋玻片后靜置片刻，之后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，選擇480 nm激發(fā)波長用于增強(qiáng)型熒光蛋白EGFP的觀察[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 12C6+束輻照后的細(xì)胞存活曲線出現(xiàn)馬鞍形波動

應(yīng)用12C6+束對類酵母SD301菌株進(jìn)行輻照，輻照劑量為20、60、90、120、150和180 Gy，細(xì)胞存活數(shù)分別為74、74、65、69、77和33。在輻照劑量為120、150和180 Gy時，細(xì)胞存活數(shù)出現(xiàn)了類似馬鞍形的波動。12C6+束誘變的馬鞍形效應(yīng)在30多個屬的微生物中被觀測到，雖然具體的形成原因還不清楚，但馬鞍形波動可能對應(yīng)著較好的突變效果[15]，因此選擇馬鞍形波動對應(yīng)的經(jīng)過120、150和180 Gy輻照的菌株進(jìn)行突變效應(yīng)篩選 (圖1)。

圖1 類酵母SD301碳離子束輻照誘變后菌落存活情況Fig. 1 Survival colony forming units of yeast-like strain SD301 after carbon-ions mutagenesis

2.2 H2O2可作為篩選壓力篩選高產(chǎn)角鯊烯SD301突變株

研究發(fā)現(xiàn)，在本實驗條件下所有H2O2處理組平板上均有明顯的菌落生成，H2O2濃度達(dá)到100 μmol·L-1時，突變株菌落成活率保持在20%左右，所以選擇 100 μmol·L-1H2O2作為篩選壓力 (圖 2)。后續(xù)培養(yǎng)實驗表明，該篩選壓力下實驗組表現(xiàn)出更高的角鯊烯質(zhì)量 (22.53 mg·g-1vs. 12.52 mg·g-1) 和產(chǎn)量 (267.31 mg·L-1vs. 100.96 mg·L-1)。

圖2 不同濃度的過氧化氫對類酵母SD301生長的影響Fig. 2 Effects of H2O2 with different concentrations on growth of yeast-like SD301

2.3 高產(chǎn)角鯊烯SD301的突變株具有較好的遺傳穩(wěn)定性

經(jīng)12C6+束對類酵母SD301菌株進(jìn)行輻照，最終篩選到3株比出發(fā)菌株具有更高角鯊烯質(zhì)量的突變株P(guān)S120、PS150和PS180。這3株菌株連續(xù)傳代15次后，再次測定了角鯊烯質(zhì)量，數(shù)據(jù)表明傳代前后細(xì)胞內(nèi)角鯊烯的質(zhì)量無顯著變化，獲得的3株突變株經(jīng)過傳代后角鯊烯合成性能較為穩(wěn)定(圖 3)。

圖3 SD301及其突變株的角鯊烯質(zhì)量穩(wěn)定性Fig. 3 Squalene mass stability of SD301 and its mutants

2.4 突變株比出發(fā)菌株具有更高的角鯊烯生產(chǎn)性能

搖瓶實驗證實，突變株P(guān)S120的角鯊烯產(chǎn)量和質(zhì)量均高于出發(fā)菌株 SD301 (1.33 g·L-1vs. 0.82 g·L-1，41.31 mg·g-1vs. 26.82 mg·g-1，圖 4)。突變株 PS120的角鯊烯產(chǎn)量明顯高于同屬菌株P(guān)seudozyma sp.JCC 207 (0.34 g·L-1)[22]，甚至高于經(jīng)過代謝工程改造后的某些解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica )(0.30 g·L-1)[23]、釀酒酵母 (0.21 g·L-1)[24]和大腸桿菌(0.17 g·L-1)[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體雙重調(diào)節(jié)，可進(jìn)一步提高角鯊烯產(chǎn)量，最終通過優(yōu)化發(fā)酵方法，可將角鯊烯產(chǎn)量提至11.00 g·L-1[17]。本文篩選到的突變株P(guān)S120作為遺傳改造的出發(fā)菌株具有角鯊烯產(chǎn)量較高的起始優(yōu)勢，遺傳改造手段的應(yīng)用有望進(jìn)一步大幅提高其角鯊烯產(chǎn)量，因此，本文將優(yōu)先探索并建立穩(wěn)定高效的電轉(zhuǎn)化方法用于菌株的后續(xù)遺傳改造。

圖4 SD301及其突變株P(guān)S120和PS150的角鯊烯生產(chǎn)性能分析Fig. 4 Performance analysis of SD301 and its mutants (PS120 and PS150)

2.5 電轉(zhuǎn)化方法可以成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入突變株P(guān)S120

潮霉素B通常對Pseudozyma屬細(xì)胞具有抑制作用，因此本研究引入潮霉素B抗性基因作為構(gòu)建重組質(zhì)粒的抗性篩選標(biāo)記[18-19]。本研究以半乳糖誘導(dǎo)型質(zhì)粒pYES2為模板，將潮霉素B抗性基因HPH和編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的EGFP基因引入載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES2-hph-egfp。通過菌落PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒中的EGFP基因 (EGFP基因片段的大小為1 014 bp)，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠驗證、回收和測序研究，測序結(jié)果表明EGFP基因正確插入載體，重組質(zhì)粒pYES2-hph-egfp構(gòu)建成功 (圖 5-a)。

以突變株為出發(fā)菌株進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，測試電壓分別為650、900、1 150和1 400 V。通過菌落PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒中的HPH和EGFP基因表達(dá)盒 (該基因表達(dá)盒的大小為2 430 bp)，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠驗證、回收和測序，測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pYES2-hph-egfp成功轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，成功獲得含有質(zhì)粒pYES2-hph-egfp的陽性轉(zhuǎn)化子 (圖5-b)。900 V電壓條件下獲得的陽性轉(zhuǎn)化率 (30%，6個陽性克隆/20個克隆) 較1 400 V電壓更高 (15%，3個陽性克隆/20個克隆)。此外，激光共聚焦顯微鏡觀察也顯示在900 V電壓下獲得的陽性轉(zhuǎn)化子比1 400 V電壓下有更多可以正常表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞 (圖6)。本研究使用的電壓僅為900 V，遠(yuǎn)低于已報道的Pseudozyma屬的電轉(zhuǎn)化電壓 (1 850 V[19]和5 kV[20])，操作上更具安全性。

圖5 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化子的PCR驗證Fig. 5 PCR validation of plasmid and transformants

圖6 激光共聚焦顯微鏡驗證增強(qiáng)型熒光蛋白EGFP在突變株P(guān)S120的表達(dá)水平Fig. 6 Fluorescence intensity of enhanced fluorescent protein (EGFP) in mutant strain PS120 observed by laser scanning confocal microscopy

3 結(jié)論

本研究使用12C6+束輻照誘變產(chǎn)角鯊烯類酵母Pseudozyma sp. SD301，通過篩選初步獲得了高產(chǎn)角鯊烯突變株P(guān)S120，搖瓶培養(yǎng)條件下其角鯊烯產(chǎn)量達(dá)到1.33 g·L-1，高于出發(fā)菌株SD301，是目前已報道過的使用誘變選育獲得的最佳突變株之一[12,26]。PS120以葡萄糖為碳源進(jìn)行1 L搖瓶培養(yǎng)3 d后菌體干質(zhì)量 (干燥后細(xì)胞質(zhì)量) 達(dá)22.10 g·L-1，高于產(chǎn)角鯊烯的南極酵母、釀酒酵母和裂殖壺菌[17,22,26-29]，具備通過高密度發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯的潛力。除了通過誘變選育獲得高產(chǎn)角鯊烯的突變株以外，通過代謝工程改造也可以有效提高角鯊烯的產(chǎn)量[17,30-34]。為了進(jìn)一步提高突變株的角鯊烯產(chǎn)量，本研究改進(jìn)了Pseudozyma屬的電轉(zhuǎn)化條件并優(yōu)化了電壓條件，結(jié)果顯示在900 V電壓下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化可獲得較高的陽性轉(zhuǎn)化率 (30%)，下一步工作重點(diǎn)是提高電轉(zhuǎn)化效率和完善基因編輯系統(tǒng)。本研究結(jié)果可為產(chǎn)角鯊烯類酵母的遺傳改造提供重要的技術(shù)支撐。