產(chǎn)神經(jīng)酸微藻Mychonastes afer的兼養(yǎng)固碳培養(yǎng)

師曉藝，丁曉婷，萬子璇，英 瑜，李福利，高 昕，范 勇

1. 中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266071

2. 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，山東 青島 266101

3. 青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266071

微藻是一種單細(xì)胞光合微生物，因富含蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)，可以作為水產(chǎn)動物的開口餌料和飼料營養(yǎng)強(qiáng)化劑[1-3]。微藻在改善養(yǎng)殖水質(zhì)、凈化養(yǎng)殖廢水方面也有廣泛應(yīng)用，如盧崇德等[4]將小球藻 (Chlorella sp.) 固定后應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體，通過生物增氧的方式改善水體缺氧問題；Ding等[5]將微藻與膜生物反應(yīng)器耦合，對海水對蝦養(yǎng)殖廢水中的氮、磷實(shí)現(xiàn)了較高的清除效率。其中應(yīng)用最廣泛的微藻之一是小球藻。小球藻隸屬綠藻門、綠藻綱、小球藻科、小球藻屬，為一種單細(xì)胞綠藻，廣泛分布在淡水水域中，蛋白質(zhì)含量高，生長速度快。小球藻營養(yǎng)方式多樣，可以自養(yǎng)培養(yǎng)，也可以利用有機(jī)碳源進(jìn)行培養(yǎng)[6-8]，特別在異養(yǎng)條件下可以實(shí)現(xiàn)生物量的快速積累[9-11]。中國科學(xué)院水生生物研究所探究出一種異養(yǎng)超高密度發(fā)酵培養(yǎng)方式，在實(shí)驗(yàn)室和中試發(fā)酵罐放大條件下，小球藻最高細(xì)胞生物量分別達(dá)到271和247 g·L-1[12]，這是目前報道的小球藻最高生物量密度。

開發(fā)多種微藻種質(zhì)資源是更好發(fā)揮微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中積極作用的一種重要方式。2011年中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所篩選到一株Mychonastes afer HSO-3-1微藻[13-15]，其隸屬于綠藻門、綠藻綱、麥可屬，細(xì)胞粒徑約為2～3 μm，屬于超微型浮游藻類。超微型浮游藻類在生態(tài)系統(tǒng)的能量流動和物質(zhì)循環(huán)中起主要作用，是浮游植物總生物量和生產(chǎn)力的主要組成部分，約占總?cè)~綠素a的35%～44%和總初級生產(chǎn)力的42%～55%[16]。超微藻類是微食物環(huán)的重要組成部分，研究表明超微藻具有更高的二氧化碳 (CO2) 固定效率，對富營養(yǎng)化水體中初級生產(chǎn)力的貢獻(xiàn)可達(dá)55%，且對浮游微生物的種群具有調(diào)控作用[17]。另外，該藻種神經(jīng)酸含量可達(dá)到中性脂肪酸含量的6.5%，是世界上首次發(fā)現(xiàn)富含高比例神經(jīng)酸的微藻品種[18]。神經(jīng)酸是大腦神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)組織的核心成分，是公認(rèn)可以促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞、組織修復(fù)和再生的活性物質(zhì)[19-20]，M. afer作為天然神經(jīng)酸的可靠來源[13,21]，可以為水產(chǎn)動物提供更優(yōu)質(zhì)的脂質(zhì)資源，且該藻種蛋白質(zhì)氨基酸模式更合理，易于被水產(chǎn)動物吸收利用。

探究M. afer藻株的高效培養(yǎng)方式，通過加入有機(jī)碳源，加速細(xì)胞生長速度，縮短細(xì)胞生長時間，有利于實(shí)現(xiàn)高生物量和生物活性物質(zhì)的積累。光合系統(tǒng)在加入有機(jī)碳源后所起作用、兼養(yǎng)過程中的通氣以及通入高濃度CO2等問題仍備受爭議。一些學(xué)者認(rèn)為CO2的通入以及光合系統(tǒng)作用會降低有機(jī)碳利用速率，如Sforza等[22]發(fā)現(xiàn)在C. protothecoides和Nannochloropsis salina兼養(yǎng)過程中通入過量 (5%) CO2降低了有機(jī)碳源的同化效率，使得兼養(yǎng)條件的比生長速率基本等同于自養(yǎng)條件；Curien等[23]認(rèn)為在嗜極微藻Galdieria sulphuraria培養(yǎng)基中加入有機(jī)碳源可以緩解CO2缺乏對細(xì)胞生長的抑制，但人為外加0.5% CO2卻將自養(yǎng)與異養(yǎng)之間的協(xié)同效應(yīng)打破，從而抑制了細(xì)胞的快速生長；Oliveira等[24]在研究Choricystis minor var.minor藻株時發(fā)現(xiàn)，兼養(yǎng)和異養(yǎng)條件下的細(xì)胞均比自養(yǎng)表現(xiàn)出更高的生長速率，但在兼養(yǎng)的同時通入CO2卻導(dǎo)致生物量的下降，表明CO2削弱了有機(jī)碳源對細(xì)胞生長的促進(jìn)作用。同時也有另一種觀點(diǎn)，Martinez和Orus[25]在研究普通小球藻藻株UAM 101時發(fā)現(xiàn)，在以葡萄糖作為有機(jī)碳源的同時，通入2% CO2可使細(xì)胞實(shí)現(xiàn)最大的比生長速率。因此，微藻利用有機(jī)碳源生長與其自身光合作用之間的關(guān)系存在著種間差異，發(fā)現(xiàn)并優(yōu)化可同時利用有機(jī)碳源和自身光合作用的藻種，是提高微藻經(jīng)濟(jì)效益的重要途徑之一。本研究主要比較了小球藻C. sorokiniana和M. afer在兼養(yǎng)過程中利用有機(jī)碳源和協(xié)同光合作用的能力，并探索M. afer的最佳兼養(yǎng)培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種與培養(yǎng)

小球藻采樣于山東青島大沽河流域，本實(shí)驗(yàn)室保存，經(jīng)18S測序?yàn)樾∏蛟錍. sorokiniana，保藏編號為xzl；M. afer HSO-3-1保藏于中國典型微生物保藏中心，藻種保藏號為CGMCC No. 4654。

兩種微藻均以BG-11作為基礎(chǔ)自養(yǎng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基通過121 ℃滅菌20 min后使用。進(jìn)行兼養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)時，向BG-11培養(yǎng)基內(nèi)添加過濾除菌的葡萄糖作為有機(jī)碳源。前期研究通過比較葡萄糖、甘油、乙酸鹽等不同濃度有機(jī)碳源對M. afer生長的影響，發(fā)現(xiàn)2 g·L-1葡萄糖最有利于M. afer生長[26]。因此本實(shí)驗(yàn)M. afer兼養(yǎng)培養(yǎng)使用2 g·L-1葡萄糖，小球藻以10 g·L-1葡萄糖作為有機(jī)碳源。

細(xì)胞培養(yǎng)于直徑3 cm、高30 cm的玻璃柱式生物反應(yīng)器中進(jìn)行，培養(yǎng)體系為100 mL，使用白色熒光燈進(jìn)行照明，光照強(qiáng)度為5 000 lx，光暗比16∶8，培養(yǎng)過程中全程通氣，通氣方式分為空氣和高CO2(CO2體積分?jǐn)?shù)為4%，使用流量計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié))，因此本實(shí)驗(yàn)中，對兩種微藻分別設(shè)置4個實(shí)驗(yàn)組：自養(yǎng)-4% CO2、兼養(yǎng)-4% CO2、兼養(yǎng)-空氣、異養(yǎng)-空氣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞生長測定和光合參數(shù)曲線

使用酶標(biāo)儀 (SynergyTMHT, BioTek, Winooski,VT, USA) 測定藻液在λ750下吸光度，取藻液并適當(dāng)稀釋后，取200 μL加入96孔板進(jìn)行測定，以O(shè)D750表征細(xì)胞密度，并繪制藻細(xì)胞生長曲線。

使用IMAGING-PAM調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(Walz, Effeltrich, Germany) 測定細(xì)胞光合電子傳遞效率ETR。加藻液200 μL于黑色96孔板中避光處理30 min后進(jìn)行測定。

1.2.2 細(xì)胞呼吸耗氧和光合放氧水平測定

使用熒光光纖氧氣測量儀 (FireStingO2, PyroS-cience GmbH, Germany) 和呼吸瓶傳感器測定藻液光合放氧和呼吸耗氧水平。該測量儀利用REDFLASH光極O2傳感器技術(shù)，REDFLASH指示劑熒光強(qiáng)度隨接觸的O2分子濃度升高而發(fā)生熒光淬滅，這種熒光變化通過光纖傳輸?shù)綔y量儀，測量儀檢測其相位漂移并據(jù)此換算成O2濃度。

參照儀器說明書，將熒光光纖氧氣測量儀校正后，吸取2 mL藻液于呼吸瓶內(nèi)，將呼吸瓶置于培養(yǎng)光強(qiáng)下，使用Pyro oxygen logger軟件記錄30 min內(nèi)氧氣增加情況，測算其速率，記為表觀放氧速率；30 min后將呼吸瓶暗處理，連續(xù)測定30 min內(nèi)氧氣減少情況，計(jì)算其速率，記為呼吸速率；將表觀放氧速率與呼吸速率相加，記為實(shí)際放氧速率 [mg·(L·h ·OD)-1]。

1.2.3 體系內(nèi)葡萄糖剩余量測定

在培養(yǎng)的第3、第6和第8天取藻液，離心取上清，使用葡萄糖含量檢測試劑盒 (BC2505, Solarbio) 測定培養(yǎng)基中葡萄糖剩余量，待葡萄糖耗盡后向體系中補(bǔ)充經(jīng)過濾除菌的葡萄糖溶液；M. afer培養(yǎng)體系中補(bǔ)充0.2 g，小球藻中補(bǔ)充1.0 g。

1.2.4 細(xì)胞生物量測定

收集30 mL藻液，6 500 r·min-1離心10 min，棄去上清，超純水清洗離心收集后凍干，使用分析天平測定藻細(xì)胞生物量。

1.2.5 M. afer細(xì)胞內(nèi)脂肪酸和神經(jīng)酸含量測定

1) 取30 mg的干藻泥，加入具塞玻璃管中，加入1.5 mL氯仿-甲醇溶液[V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1]和3.5 mL硫酸甲醇溶液 (2%硫酸)，擰緊塞子充分混勻后置于85 ℃烘箱中反應(yīng)2 h，取出后置于冰上冷卻至室溫；

2) 向上述各管中加入2 mL C26烷內(nèi)標(biāo)溶液，充分震蕩混勻，然后加入700 μL 0.9%的氯化鉀溶液，充分混勻，靜置待分層；

3) 取萃取完全后的上清液200 μL于帶內(nèi)插管的氣相小瓶中，使用氣相色譜 (7890A, Agilent technologies, Inc., CA) 進(jìn)行油脂成分分析；氣相色譜升溫程序?yàn)椋?00 ℃，5 min；以10 ℃·min-1升溫14 min，達(dá)到240 ℃，維持6 min，分流比為10∶1。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism軟件進(jìn)行整理及繪制，數(shù)據(jù)顯著性分析采用單因素分析法 (Oneway ANOVA, N=3) 進(jìn)行，P＜0.05代表數(shù)據(jù)差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)條件對細(xì)胞生長和光合參數(shù)的影響

從生長曲線 (圖1-a，1-b) 來看，初始各組OD750為0.8，培養(yǎng)8 d，培養(yǎng)過程中，兩種微藻對于有機(jī)碳源的利用顯著不同，在避光條件下的異養(yǎng)培養(yǎng)過程中 (異養(yǎng)-空氣組)，小球藻生長好于自養(yǎng)培養(yǎng)，而M. afer在異養(yǎng)條件下生長十分緩慢，最終OD750為1.8，表明M. afer不能單純依靠有機(jī)碳源營異養(yǎng)生長。而小球藻在葡萄糖的異養(yǎng)條件下，能夠較好地生長，最終OD750為16。進(jìn)一步在異養(yǎng)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，添加光照處理，即兼養(yǎng)-空氣的培養(yǎng)條件下，兩種微藻均可較快生長，M.afer在該條件下同該藻自養(yǎng)培養(yǎng)的生長速率接近，最終OD750約為9.5；小球藻在該條件下達(dá)到最優(yōu)的生長速率 (OD750達(dá)到25)。再進(jìn)一步將空氣替換成高CO2的混合氣體進(jìn)行通氣，M. afer的生長速率進(jìn)一步提升，該組OD750達(dá)到11.8，因此兼養(yǎng)-CO2條件對M. afer生長有最顯著的促進(jìn)作用。這個過程中僅改變了CO2的濃度，筆者認(rèn)為是高濃度無機(jī)碳源促進(jìn)了細(xì)胞的生長；而小球藻在該條件下，同兼養(yǎng)-空氣相比，生長速率下降，最終OD約為16.5，高濃度的CO2抑制了細(xì)胞對有機(jī)碳源的利用。生長曲線的數(shù)據(jù)說明兩種微藻在兼養(yǎng)條件下的性質(zhì)不同，有機(jī)碳源和無機(jī)碳源的協(xié)同作用也不同。M. afer可以協(xié)同有機(jī)碳源和無機(jī)碳源的利用，而小球藻可以只利用有機(jī)碳源，但在高濃度CO2條件下其生長受到一定的抑制。

圖1 不同培養(yǎng)條件下M. afer (a, c)和小球藻C. sorokiniana (b, d) 的生長曲線和光合電子傳遞效率變化情況Fig. 1 Growth curves and ETR of M. afer (a, c) and C. sorokiniana (b, d) under different culture conditions

對光合系統(tǒng)的參數(shù)進(jìn)行測定也在一定程度上說明了兩種微藻的不同，光合系統(tǒng)的最大電子傳遞效率可以表征光合作用的效率。本研究中選擇生長過程發(fā)生顯著分化的第4天，對不同培養(yǎng)條件下兩種微藻的電子傳遞效率進(jìn)行分析，在M. afer中(圖1-c)，異養(yǎng)培養(yǎng)的光合系統(tǒng)最大電子傳遞速率顯著低于其他組，在光照條件下的不同處理過程中，M. afer的光合系統(tǒng)作用效率呈現(xiàn)梯度變化，高含量CO2通入的處理組，M. afer的光合效率較高，表明CO2的通入對光合效率提高有顯著作用，高濃度CO2處理能提高M(jìn). afer的碳固定作用。在小球藻中 (圖1-d)，異養(yǎng)培養(yǎng)條件下小球藻的最大電子傳遞速率顯著低于其他組，其他光照條件下的該參數(shù)無顯著差異。

2.2 不同培養(yǎng)條件對細(xì)胞有機(jī)碳源利用效率的影響

兼養(yǎng)過程中，兩種微藻在不同濃度CO2條件下，細(xì)胞的生長速率不同，有機(jī)碳源的利用速率也存在差異。在培養(yǎng)第3、第6和第8天取樣測定培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖剩余量，結(jié)果見表1。在兼養(yǎng)條件下，小球藻在通空氣的情況下葡萄糖消耗速率最快，而M. afer在通高濃度CO2的情況下消耗最快，糖消耗速率的快慢與兩株藻的生長情況一致。

表1 培養(yǎng)基中葡萄糖剩余量 ()Table 1 Residual glucose in culture mediumg·L-1

表1 培養(yǎng)基中葡萄糖剩余量 ()Table 1 Residual glucose in culture mediumg·L-1

注：ND為未檢測出葡萄糖，即培養(yǎng)過程中每次添加的2 g·L-1葡萄糖在檢測時已全部利用。Note: ND indicates that no glucose was detected, which means that 2 g·L-1 glucose had been fully utilized.

C. sorokiniana兼養(yǎng)-二氧化碳Mixotrophy-CO2 3 1.50±0.0012.86±0.0100.45±0.030ND 6 0.03±0.0013.60±0.0011.50±0.320ND 8 6.00±0.53010.99±0.2704.02±0.6201.19±0.050時間t/d M. afer兼養(yǎng)-空氣Mixotrophy-air兼養(yǎng)-二氧化碳Mixotrophy-CO2兼養(yǎng)-空氣Mixotrophy-air

2.3 不同培養(yǎng)條件對細(xì)胞光合放氧和呼吸耗氧水平的影響

在微生物發(fā)酵過程中，氧的傳遞非常重要。細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用需要大量氧氣，同時光合微藻進(jìn)行碳固定過程中也釋放氧氣，因此光合作用的效率可以通過氧氣釋放量來表達(dá)。本研究結(jié)合細(xì)胞生長和葡萄糖利用等結(jié)果，對培養(yǎng)系統(tǒng)中溶解氧變化過程進(jìn)行監(jiān)測和分析。圖2-a顯示了培養(yǎng)系統(tǒng)中檢測溶解氧的過程，如方法中所述，首先從培養(yǎng)體系中取出藻液，在同樣光照條件下測定不同培養(yǎng)體系的藻液在光照下30 min的耗氧變化，此過程分析光合作用放氧速率與細(xì)胞呼吸作用耗氧速率之間的差值；隨后將檢測體系避光處理，繼續(xù)檢測在黑暗條件下30 min的氧消耗變化，此過程分析不同條件下細(xì)胞的呼吸速率，溶解氧變化速率單位均為mg·(L·h·OD)-1。結(jié)果如圖 2-b所示，在小球藻中放氧水平依次為自養(yǎng)＞兼養(yǎng)-空氣＞兼養(yǎng)-CO2，而在M. afer中放氧速率為自養(yǎng)＞兼養(yǎng)-CO2≈兼養(yǎng)-空氣，有機(jī)碳源的加入均對兩株藻的放氧水平產(chǎn)生了抑制作用，但小球藻放氧水平還在很大程度上受通氣條件的影響。圖2-c反映了兩株藻在不同培養(yǎng)條件下的呼吸水平，與生長曲線 (圖1-a，1-c) 結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呼吸水平與細(xì)胞生長成正比例關(guān)系。

圖2 溶解氧測定示意圖及M. afer與小球藻 C. sorokiniana 耗放氧情況Fig. 2 Schematic diagram of dissolved oxygen determination and oxygen release, consumption rate of M. afer and C. sorokiniana

結(jié)合以上結(jié)果，小球藻在異養(yǎng)條件下耗氧速率最快且有較高的生長速率，該條件下細(xì)胞生長的全部能量依賴于有機(jī)碳源分解代謝產(chǎn)生的ATP，但在兼養(yǎng)條件下，添加有機(jī)碳源時，細(xì)胞的光合作用相比自養(yǎng)條件受到抑制；在有光的條件下，小球藻啟動光合作用，細(xì)胞的呼吸水平降低，表明這個過程對細(xì)胞利用有機(jī)碳源生長產(chǎn)生抑制。在M. afer的檢測過程中發(fā)現(xiàn)，在兼養(yǎng)通高濃度CO2條件下生長速率最快，同時該條件下細(xì)胞呼吸水平最高；相對于兼養(yǎng)-空氣組，在有高濃度CO2的情況下，細(xì)胞呼吸水平提高，一定程度上說明CO2的吸收促進(jìn)了細(xì)胞對有機(jī)碳源的利用；并且由于實(shí)際放氧速率在兼養(yǎng)條件下無顯著差異，可以認(rèn)為有機(jī)碳源的添加未對M. afer的光合系統(tǒng)造成影響。

2.4 不同培養(yǎng)條件對M. afer生物量、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸和神經(jīng)酸產(chǎn)量的影響

由于M. afer生長過程中積累神經(jīng)酸[13-14,26-27]，因此對該藻在不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞油脂含量進(jìn)行分析。將藻液離心后收集藻泥進(jìn)行烘干，測定細(xì)胞生物量和細(xì)胞內(nèi)脂肪酸、神經(jīng)酸含量，結(jié)果見表2。與自養(yǎng)條件相比，葡萄糖加入后，細(xì)胞生物量、脂肪酸和神經(jīng)酸含量均有顯著提高，兼養(yǎng)-CO2組細(xì)胞生物量最大，為3.26 g·L-1。在兼養(yǎng)-CO2條件下，每克生物量含253.02 mg脂肪酸、5.93 mg神經(jīng)酸，神經(jīng)酸含量占總脂肪酸的2.34%；兼養(yǎng)-空氣組每克生物量含154.01 mg脂肪酸、2.59 mg神經(jīng)酸，脂肪酸占比為1.68%；自養(yǎng)條件下每克生物量僅含132.20 mg脂肪酸、0.93 mg神經(jīng)酸。在最優(yōu)的兼養(yǎng)-CO2組，神經(jīng)酸含量分別為自養(yǎng)、兼養(yǎng)通空氣條件的6.4、2.3倍。

表2 不同條件下M. afer細(xì)胞生物量、脂肪酸和神經(jīng)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) ()Table 2 Biomass, mass fraction of fatty acids and nervonic acids of M. afer cells under different conditions

表2 不同條件下M. afer細(xì)胞生物量、脂肪酸和神經(jīng)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) ()Table 2 Biomass, mass fraction of fatty acids and nervonic acids of M. afer cells under different conditions

神經(jīng)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Mass fraction of nervonic acid/(mg·g-1)自養(yǎng)-二氧化碳 Autotrophy-CO22.458 3±0.000 4132.20±9.680.93±0.02兼養(yǎng)-空氣 Mixotrophy-air2.620 0±0.000 3154.01±16.632.59±0.01兼養(yǎng)-二氧化碳 Mixotrophy-CO2 3.261 7±0.000 1253.02±6.335.93±0.15生物量Biomass/(g·L-1)脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Mass fraction of fatty acid/(mg·g-1)

3 討論

本研究主要比較了小球藻和M. afer在兼養(yǎng)過程中利用有機(jī)碳源和協(xié)同光合作用的能力，并探索M. afer最佳的兼養(yǎng)培養(yǎng)條件。M. afer和小球藻均可以利用有機(jī)碳源和光源進(jìn)行兼養(yǎng)生長，但是兩株藻在利用有機(jī)碳源和協(xié)同光合作用的能力方面存在顯著差異。與M. afer相比，小球藻可以利用更高濃度的葡萄糖，實(shí)現(xiàn)更快速生長；小球藻屬于一種高產(chǎn)蛋白質(zhì)的微藻，而M. afer是一種典型產(chǎn)油微藻，與具有高淀粉或高蛋白含量的微藻相比，產(chǎn)油微藻通常表現(xiàn)出較慢的生長速率和較低的生物量，這一點(diǎn)在多種微藻中得到印證[28-30]。小球藻可以單獨(dú)依靠有機(jī)碳源營異養(yǎng)生長，且在通空氣的條件下生長速率更快，在有機(jī)碳源和光能同時存在時，小球藻更傾向于利用有機(jī)碳源，推測原因可能為有機(jī)碳源的加入抑制了小球藻細(xì)胞的光合作用，降低了光合色素含量[31]。但在培養(yǎng)初期，光合系統(tǒng)的代謝占總代謝的70%以上[32]，仍然有助于細(xì)胞的生長，使兼養(yǎng)培養(yǎng)的生長速率較高?？諝獾某掷m(xù)通入供氧，更有利于葡萄糖的分解代謝，因此相對于兼養(yǎng)-CO2組，在兼養(yǎng)-空氣條件下的生長速率更高。

有機(jī)碳源的引入對兩株藻光合系統(tǒng)活性顯示出不同程度的抑制作用。Vidotti等[33]發(fā)現(xiàn)，小球藻從自養(yǎng)條件轉(zhuǎn)入兼養(yǎng)后，光合系統(tǒng)Ⅱ和光合系統(tǒng)Ⅰ活性及效率均下降，光合色素含量減少，細(xì)胞內(nèi)光合相關(guān)基因如psbA、psbC、psaB等顯著下調(diào)，同時檢測到在光照條件下，培養(yǎng)基中葡萄糖的存在導(dǎo)致光合結(jié)構(gòu)的降解以及類囊體膜蛋白豐度的降低。劉曉娟[34]研究不同營養(yǎng)方式對三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum) 的影響，發(fā)現(xiàn)有機(jī)碳源加入后，細(xì)胞內(nèi)光合色素含量下降，PSⅡ系統(tǒng)活性/光合放氧速率等均下降，即有機(jī)碳降低了三角褐指藻的光合能力。外源葡萄糖通過分解代謝，為藻細(xì)胞生長提供所需能量及小分子碳骨架，從而降低了細(xì)胞對光能的依賴，因此兼養(yǎng)條件下細(xì)胞光合電子傳遞效率 (ETR)、光合放氧水平等均低于自養(yǎng)水平。

不同于小球藻，當(dāng)切斷光源后，M. afer幾乎不能生長，表明M. afer不能完全擺脫對光源的依賴，完全營異養(yǎng)生長。M. afer在有機(jī)碳源和高濃度CO2共同存在時，具有最高的生長速率、最快的葡萄糖消耗速率、更高的呼吸水平，且積累了更多的生物活性物質(zhì)。通常在自養(yǎng)條件下，高濃度CO2的引入，緩解了CO2缺乏對細(xì)胞生長的抑制，提高碳固定途徑關(guān)鍵酶Rubisco (核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶) 的活性[35]，增加碳固定效率，積累更多生物量。本研究發(fā)現(xiàn)，在M. afer中，通過光合參數(shù)和放氧速率檢測，通入高濃度的CO2并未使得光合系統(tǒng)的速率得到提升，但是細(xì)胞呼吸速率和葡萄糖的利用速率顯著提高。該過程的分子機(jī)制仍有待通過轉(zhuǎn)錄組等數(shù)據(jù)闡明。推測在CO2通入細(xì)胞后，細(xì)胞的CO2通過類碳-4途徑進(jìn)行了初步的固定，首先丙酮酸在磷酸丙酮酸雙激酶的作用下生成了磷酸烯醇式丙酮酸，然后在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下與CO2結(jié)合，進(jìn)入中心碳代謝途徑，進(jìn)而與有機(jī)碳利用的糖酵解過程相偶聯(lián)，促進(jìn)了有機(jī)碳的利用。今后的工作中將進(jìn)一步證明這個過程。

綜上所述，兩種微藻在兼養(yǎng)過程中協(xié)同有機(jī)碳源和光合作用的機(jī)制存在差異，M. afer在有機(jī)碳源存在的情況下仍可固定CO2，在這種培養(yǎng)模式下，期待能夠一方面添加有機(jī)碳源提高微藻的生長速率，一方面固碳減排，使微藻快速積累生物量，為碳中和碳達(dá)峰的目標(biāo)提供重要解決途徑。