接種戊糖乳桿菌和釀酒酵母菌對(duì)低鹽發(fā)酵鳊魚(yú)品質(zhì)的影響

田旭艷，高 沛，夏文水，許艷順

江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

鳊魚(yú) (Parapraxis pekinensis) 富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和維生素D等物質(zhì)[1]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。根據(jù)《2021年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》數(shù)據(jù)，2020年鳊魚(yú)產(chǎn)量達(dá)78.1737萬(wàn)噸。目前，鳊魚(yú)主要以鮮活或加工成干腌魚(yú)等形式銷售，加工方式比較單一。

發(fā)酵作為食品加工和保存的傳統(tǒng)方法之一，已廣泛應(yīng)用于易腐肉類和魚(yú)類產(chǎn)品的加工，包括發(fā)酵火腿[2]、香腸[3]和發(fā)酵魚(yú)[4]等。發(fā)酵過(guò)程中，在微生物和內(nèi)源酶的作用下蛋白質(zhì)分解成多肽和氨基酸，同時(shí)導(dǎo)致生物胺的積累[5]。生物胺與發(fā)酵水產(chǎn)品的食用安全密切相關(guān)，生物胺的過(guò)量攝入對(duì)人體健康有害，容易導(dǎo)致高血壓、心悸、頭痛，嚴(yán)重者甚至危及生命[6-8]?，F(xiàn)有腌制發(fā)酵魚(yú)加工通常采用高鹽或低溫密閉發(fā)酵。高鹽條件下可抑制有害微生物的生長(zhǎng)，但長(zhǎng)期的高鈉攝入會(huì)增加腎臟負(fù)擔(dān)，易引起高血壓、中風(fēng)等心血管疾病。低鹽條件下通過(guò)微生物發(fā)酵降低pH可以抑制病原及腐敗菌的生長(zhǎng)，形成濃郁的酸香風(fēng)味，但在酸性條件下蛋白發(fā)生變性，持水性下降，導(dǎo)致在熟制過(guò)程中水分流失嚴(yán)重，口感改變，且過(guò)酸的魚(yú)或肉影響了部分消費(fèi)者的接受度。如何在低鹽和低酸條件下賦予魚(yú)肉良好的發(fā)酵風(fēng)味和保障產(chǎn)品安全是一個(gè)挑戰(zhàn)。前期已研究了發(fā)酵溫度對(duì)低鹽發(fā)酵鳊魚(yú)風(fēng)味、微生物和理化特性的影響[9]，發(fā)現(xiàn)采用兩段式階段控溫發(fā)酵的方式有利于改善低鹽發(fā)酵鳊魚(yú)的風(fēng)味及品質(zhì)，但采用自然發(fā)酵方式，易受有害微生物污染，生物胺含量較高，難以保證產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定性和安全性。采用有益的微生物發(fā)酵劑接種發(fā)酵是提升發(fā)酵食品品質(zhì)的重要技術(shù)手段，已被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類發(fā)酵食品加工中。Bao等[10]研究發(fā)現(xiàn)接種乳酸菌可提高臭鱖魚(yú)產(chǎn)品品質(zhì)和增加風(fēng)味，同時(shí)縮短了發(fā)酵時(shí)間；Zeng等[11]研究顯示接種發(fā)酵可降低酸魚(yú)pH，抑制產(chǎn)品中有害微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)蛋白降解并改善風(fēng)味；Zaman等[12]在魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中接種具有胺氧化酶活性的發(fā)酵劑有效減少了魚(yú)露中生物胺的積累。因此，本文在前期建立的鳊魚(yú)階段控溫發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，將戊糖乳桿菌 (Lactiplantibacillus pentosus) 和釀酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)作為發(fā)酵劑接種于發(fā)酵鳊魚(yú)中，探討接種發(fā)酵對(duì)鳊魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中生物胺形成及其風(fēng)味品質(zhì)的影響，為微生物發(fā)酵技術(shù)在魚(yú)類加工中的應(yīng)用和提高發(fā)酵水產(chǎn)食品質(zhì)量安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鮮活鳊魚(yú) [體質(zhì)量為 (700±100) g]、食鹽、白酒、糖、花椒、香葉，生姜均購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?(中國(guó)江蘇無(wú)錫)；發(fā)酵菌株：戊糖乳桿菌Lactiplantibacillus pentosus (Lp-1) 和釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae (Sc-2018)，由本研究室于中國(guó)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵酸魚(yú)中分離純化制備；保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (武漢大學(xué))，菌種編號(hào)分別為：戊糖乳桿菌(CCTCC AB 2022072)，釀酒酵母菌 (CCTCC AY 2022001)；色胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺、精胺、亞精胺和苯乙胺標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 (PCA)、乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基 (MRS)、酵母浸出粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (YPD) 均購(gòu)自青島海博有限公司；2,4,6-三甲基吡啶 (TMP, 98%) 購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；其余試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

EL20型pH計(jì) (上海Mettler)；IKA-T10高速分散機(jī) (德國(guó)IKA集團(tuán)股份有限公司Toledo公司)；4K15型冷凍離心機(jī) (德國(guó)Sigma Laborzentrifugen公司)；Alpha-1900S型紫外分光光度計(jì) (上海譜元儀器有限公司)；BM-400P型拍打機(jī) (上海Truelab Lab-Sci)；TSQ 8000氣質(zhì)聯(lián)用儀 (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Ultimate 3000高效液相色譜 (德國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

原料魚(yú)→預(yù)處理→腌制→發(fā)酵劑制備→接種發(fā)酵→成品。

1.2.2 操作要點(diǎn)

原料預(yù)處理：平均質(zhì)量為 (700±100) g的新鮮鳊魚(yú)去鱗、去內(nèi)臟并清洗干凈。腌制輔料準(zhǔn)備：以魚(yú)質(zhì)量為基準(zhǔn)，腌制料配比為：食鹽2%、酒0.5%、糖1%、花椒0.1%、香葉0.1%，生姜3%，混合均勻，備用。低溫腌制：將上述混合均勻的腌制料均勻涂抹在瀝干水分的魚(yú)體上，置于腌制桶并密封，0～4 ℃條件下腌制24 h。發(fā)酵劑制備：選用從傳統(tǒng)發(fā)酵魚(yú)中篩選分離的微生物菌株戊糖乳桿菌 (Lp-1)和釀酒酵母 (Sc-2018)，活化后制備成菌懸液備用，2種菌株活化擴(kuò)大培養(yǎng)后的懸浮液最終濃度均為 7～9 log CFU·g-1。階段控溫發(fā)酵：分別采用浸漬方式接種活化的發(fā)酵菌株Lp-1和Sc-2018，在特定溫度下懸掛進(jìn)行發(fā)酵，20 ℃條件下發(fā)酵2 d，然后10 ℃再發(fā)酵2 d。以未接種發(fā)酵作為對(duì)照組，每天取樣并貯存于-50 ℃條件下用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 pH 測(cè)定

取樣品 (2.0 g) 于18 mL蒸餾水中，均質(zhì)后用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.2 揮發(fā)性鹽基氮 (TVB-N) 測(cè)定

參照Liao等[13]的方法，并稍作修改，稱取4 g樣品，加入20 mL去離子水，均質(zhì)并離心 (10 000×g,10 min)，取上清液，采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定，結(jié)果表示為 mg·kg-1；

1.3.3 TCA-可溶性肽測(cè)定

參考Wang等[14]的方法，取3 g樣品加入27 mL預(yù)冷的 50 mg·mL-1TCA 溶液，11 000 r·min-1均質(zhì)2 min，4 ℃ 靜置 1 h，然后在 12 000 ×g下離心 10 min，收集上清液，測(cè)定上清液中的TCA-可溶性肽質(zhì)量摩爾濃度，結(jié)果表示為 μmol·g-1。

1.3.4 微生物檢測(cè)

采用Sun等[15]的方法進(jìn)行微生物分析，在無(wú)菌條件下，取5 g剁碎樣品，放入無(wú)菌自封袋中，倒入45 mL無(wú)菌生理鹽水，無(wú)菌均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min。樣品用無(wú)菌生理鹽水連續(xù)稀釋。菌落總數(shù)：PCA培養(yǎng)基30 °C培養(yǎng)72 h；乳酸菌：MRS培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)72 h；酵母菌：PDA培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)72 h。結(jié)果以log CFU·g-1表示。

1.3.5 生物胺含量測(cè)定

參照Xu等[16]的方法測(cè)定生物胺，取2.0 g樣品，加入10 mL 0.6 mol·L-1高氯酸溶液，均質(zhì)并離心 (4 ℃, 10 000×g, 10 min)。取上清液，重復(fù)上述操作，合并2次上清液，最后用0.6 mol·L-1高氯酸溶液定容至25 mL。用1%丹磺酰氯進(jìn)行柱前衍生，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，濾液在0～4 ℃下儲(chǔ)存用于測(cè)定生物胺含量。采用RP-HPLC-UV和安捷倫ZORBAX SB-C18柱 (4.6×150 mm, 5 μm) 進(jìn)行分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積識(shí)別和計(jì)算，結(jié)果以 mg·kg-1表示。

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量測(cè)定

稱取2.0 g樣品，轉(zhuǎn)移至20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，通過(guò)SPME提取揮發(fā)性化合物。揮發(fā)性化合物通過(guò)GC-MS進(jìn)行分析，使用30 mm×0.25 mm×0.25 μm DB-WAX柱。氣相色譜和質(zhì)譜條件參照Gao等[17]的方法。揮發(fā)性風(fēng)味化合物根據(jù)NIST2005和Willey 7標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)進(jìn)行鑒定，并利用內(nèi)標(biāo)2,4,6-三甲基吡啶進(jìn)行半定量。結(jié)果以μg·kg-1表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 接種戊糖乳桿菌和釀酒酵母對(duì)低鹽發(fā)酵鳊魚(yú)中微生物的影響

發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)照組和接種Lp-1、Sc-2018組鳊魚(yú)的微生物變化見(jiàn)圖1。從整體上看，對(duì)照組和接種發(fā)酵組的菌落總數(shù)在發(fā)酵前2 d均顯著增加(P＜0.05)，發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定 (圖1-a)。Lp-1接種組菌落總數(shù)在整個(gè)發(fā)酵期間顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)。Sc-2018接種組菌落總數(shù)在發(fā)酵前期顯著高于自然發(fā)酵組，但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)無(wú)顯著差異。

圖1 鳊魚(yú)發(fā)酵期間微生物變化Fig. 1 Change of microbiological during fermentation of bream

同樣地，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組和接種發(fā)酵組的乳酸菌均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，并在發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定(圖1-b)。乳酸菌快速生長(zhǎng)有利于積累乳酸和產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，抑制致病菌和腐敗菌的生長(zhǎng)，且由脫羧酶陰性乳酸菌引起的pH快速降低可以抑制生物胺的形成，對(duì)產(chǎn)品的安全性有積極影響[11,18]。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中Lp-1接種組樣品中乳酸菌數(shù)量顯著高于Sc-2018接種組和自然發(fā)酵組 (P＜0.05)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)Lp-1接種組、Sc-2018接種組和對(duì)照組樣品中乳酸菌分別為9.87、8.99和8.95 log CFU·g-1，但Sc-2018接種組和對(duì)照組乳酸菌數(shù)量無(wú)顯著差異。

酵母菌對(duì)發(fā)酵魚(yú)的滋味和揮發(fā)性風(fēng)味有積極的影響，有利于提升發(fā)酵制品的品質(zhì)[11]。在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵前期酵母菌均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且Sc-2018接種組酵母菌數(shù)量顯著高于其余兩組 (圖1-c)。但在發(fā)酵后期，所有發(fā)酵組酵母菌生長(zhǎng)均趨于平緩，可能是由于降低發(fā)酵溫度對(duì)酵母菌生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用。

2.2 接種戊糖乳桿菌和釀酒酵母對(duì)低鹽發(fā)酵鳊魚(yú)pH的影響

鳊魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中pH變化見(jiàn)圖2-a。與對(duì)照組相比，Lp-1接種組和Sc-2018接種組樣品pH均有所降低，其中Lp-1接種組降低較顯著，這與Lp-1接種組乳酸菌快速生長(zhǎng)產(chǎn)酸有關(guān)。pH降低能夠有效抑制發(fā)酵食品中腐敗菌和致病菌，提高產(chǎn)品安全性，這可能也是Lp-1接種組生物胺含量顯著低于其余兩組的原因。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)照組、Lp-1接種組和Sc-2018接種組的pH分別為6.86、5.32和6.56。此外，盡管接種Lp-1組在發(fā)酵后期乳酸菌數(shù)量仍較高 (圖1-b)，但pH下降程度較小，這可能與在發(fā)酵后期降低發(fā)酵溫度有關(guān)。Lp-1接種組pH呈先降低后略有增加的趨勢(shì)，發(fā)酵香腸[19]和臭鱖魚(yú)[20]中也報(bào)告了類似的結(jié)果，pH在發(fā)酵過(guò)程中呈波動(dòng)趨勢(shì)，在早期發(fā)酵階段，pH下降，發(fā)酵結(jié)束pH略有增加。此外，在發(fā)酵過(guò)程中，魚(yú)蛋白降解會(huì)逐漸釋放出氨基酸和其他代謝物，氨基酸在微生物作用下形成的堿性氨與酸發(fā)生反應(yīng)[21]，部分導(dǎo)致對(duì)照組和Sc-2018接種組樣品pH變化不明顯。

2.3 接種戊糖乳桿菌和釀酒酵母對(duì)低鹽發(fā)酵鳊魚(yú)TVB-N含量的影響

在發(fā)酵過(guò)程中，魚(yú)蛋白被內(nèi)源酶和微生物分解產(chǎn)生堿性含氮物質(zhì)，TVB-N通常用于肉類或魚(yú)類產(chǎn)品的新鮮度評(píng)估[22]。鳊魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中TVB-N含量變化見(jiàn)圖2-b。在各發(fā)酵組中，TVB-N隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，且對(duì)照組TVB-N增加較顯著。發(fā)酵2 d后，Lp-1接種組和Sc-2018接種組樣品中TVB-N均顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05 )。發(fā)酵結(jié)束后，Sc-2018接種組 (251.81 mg·kg-1) 和對(duì)照組(261.63 mg·kg-1) TVB-N 無(wú)顯著差異 (P＞0.05)。魚(yú)類中TVB-N的可接受范圍不高于300.00 mg·kg-1[23]。發(fā)酵4 d后，自然發(fā)酵組、Lp-1接種組和Sc-2018接種組樣品的TVB-N含量均在可接受范圍內(nèi)。值得注意的是，發(fā)酵結(jié)束后Lp-1接種組 (164.26 mg·kg-1)的TVB-N含量顯著低于其余兩組 (P＜0.05)，表明接種乳酸菌可以有效抑制TVB-N的增加。

圖2 鳊魚(yú)發(fā)酵期間pH、揮發(fā)性鹽基氮和TCA-可溶性肽含量變化Fig. 2 Changes of pH, TVB-N and TCA-soluble peptide content during fermentation of bream

2.4 接種戊糖乳桿菌和釀酒酵母對(duì)低鹽發(fā)酵鳊魚(yú)TCA-可溶性肽的影響

TCA-可溶性肽是蛋白降解產(chǎn)生的低分子肽，可作為表征魚(yú)肉蛋白降解的指標(biāo)[24]。鳊魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中TCA-可溶性肽變化見(jiàn)圖2-c。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，各發(fā)酵組樣品TCA-可溶性肽持續(xù)增加，表明鳊魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生了蛋白降解。微生物接種對(duì)鳊魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中TCA-可溶性肽有較大影響。發(fā)酵過(guò)程中Lp-1接種組和Sc-2018接種組樣品TCA-可溶性肽均顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)。發(fā)酵4 d后，Lp-1接種組和Sc-2018接種組樣品TCA-可溶性肽含量分別是對(duì)照組的1.28和1.51倍。蛋白質(zhì)的降解程度可能與接種發(fā)酵劑中微生物的種類相關(guān)，接種發(fā)酵促使酵母菌和乳酸菌快速生長(zhǎng)并成為發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌，分泌更多的蛋白水解酶，促進(jìn)蛋白質(zhì)降解。華倩[18]研究發(fā)現(xiàn)接種不同發(fā)酵劑制備的魚(yú)醬酸具有不同的蛋白水解程度。此外，可溶性肽可進(jìn)一步代謝為氨基酸，可直接作為滋味化合物或風(fēng)味前體[25]。TCA-可溶性肽含量較高的發(fā)酵鳊魚(yú)中檢測(cè)到更多香氣物質(zhì)的結(jié)果也支持了這一點(diǎn) (圖3-b)。

圖3 鳊魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中生物胺和揮發(fā)性風(fēng)味化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig. 3 Change of mass fraction of biogenic amine and volatile flavor compounds during fermentation of bream

2.5 接種戊糖乳桿菌和釀酒酵母對(duì)低鹽發(fā)酵鳊魚(yú)生物胺含量的影響

鳊魚(yú)發(fā)酵4 d后生物胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)圖3-a。發(fā)酵4 d后的樣品中檢測(cè)到6種生物胺，包括腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。此外，所有樣品中都未檢測(cè)到色胺和苯乙胺。

腐胺、尸胺和組胺是影響發(fā)酵魚(yú)安全性和質(zhì)量的重要因素，可用作魚(yú)肉微生物腐敗的指標(biāo)[8,26]。發(fā)酵4 d后，所有發(fā)酵組中腐胺、尸胺和組胺含量均較高，酪胺和亞精胺含量相對(duì)較低。發(fā)酵4 d后，對(duì)照組樣品腐胺、組胺和尸胺含量顯著高于Lp-1接種組和Sc-2018接種組 (P＜0.05)。Sc-2018接種組和Lp-1接種組腐胺含量無(wú)顯著差異，但顯著低于對(duì)照組樣品腐胺含量 (P＜0.05)。另外，各發(fā)酵組中酪胺、精胺和亞精胺含量均無(wú)顯著差異。與對(duì)照組相比，Lp-1接種組 (122.41 mg·kg-1) 和Sc-2018接種組 (138.10 mg·kg-1) 的總生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低了34.78%和26.42%。上述結(jié)果表明，接種發(fā)酵有利于抑制生物胺的形成，其中Lp-1接種組對(duì)生物胺的抑制效果更佳。據(jù)報(bào)道，食品中產(chǎn)脫羧酶微生物生長(zhǎng)繁殖，分泌脫羧酶進(jìn)而對(duì)氨基酸進(jìn)行脫羧作用會(huì)導(dǎo)致生物胺的積累，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)降低pH等方式可抑制產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)，從而減少生物胺的生成[8]。朱容新等[27]研究發(fā)現(xiàn)腌制鲅魚(yú)加工貯藏過(guò)程中，添加戊糖乳桿菌可快速降低pH，有效抑制生物胺的形成。Lp-1接種組生物胺含量顯著減少可能與乳酸菌在鳊魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸抑制產(chǎn)脫羧酶微生物生長(zhǎng)有關(guān)，從而降低生物胺的累積。Lp-1接種組pH較低也支持了這一點(diǎn) (圖2)。

2.6 接種戊糖乳桿菌和釀酒酵母對(duì)低鹽發(fā)酵鳊魚(yú)揮發(fā)性風(fēng)味成分含量的影響

揮發(fā)性化合物是發(fā)酵食品獨(dú)特氣味的主要來(lái)源，在發(fā)酵過(guò)程中，內(nèi)源酶和微生物酶誘導(dǎo)魚(yú)蛋白質(zhì)、脂肪等成分發(fā)生一系列復(fù)雜的理化和生化反應(yīng)，形成產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味[28]。鳊魚(yú)發(fā)酵4 d后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量見(jiàn)圖3-b和表1。在3組樣品中共鑒定出95種揮發(fā)性化合物，包括8種酯、29種醇、12種醛、4種酸、8種酮、17種烷烴、8種烯烴和9種其他化合物。對(duì)照組、Lp-1接種組和Sc-2018接種組樣品中分別檢測(cè)到62、62和72種揮發(fā)性化合物。其中有40種成分在3種發(fā)酵魚(yú)中共同檢出。對(duì)照組樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量較高(＞100 μg·kg-1) 的為乙醇、異戊醇、壬醛、3-羥基-2-丁酮、正己醛、對(duì)二甲苯、乙酸、正己醇、1-辛烯-3-醇、丙酮、芳樟醇；在Lp-1接種組樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高 (＞100 μg·kg-1) 的是乙醇、3-羥基-2-丁酮、芳樟醇、乙酸、1-辛烯-3-醇、十二烷、壬醛、4-萜烯醇、苯乙烯、對(duì)二甲苯、丙酮、2-茨醇、2,6,11-三甲基-十二烷、?-松油烯、桉葉油醇、2,5-辛二酮、乙酸乙酯、乙苯、異戊酸、正己烷；Sc-2018接種組樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高 (＞100 μg·kg-1) 的是乙醇、異戊醇、2-丁酮、壬醛、3-羥基-2-丁酮、苯乙醇、1-辛烯-3-醇、異戊酸、乙二醇苯醚、二甲苯、十二烷、芳樟醇、正己醛、桉葉油醇、2,6,10-三甲基-十二烷、2-甲基丁酸、丙酮、2-甲基丁醇。

表1 鳊魚(yú)發(fā)酵過(guò)程揮發(fā)性風(fēng)味化合物變化Table 1 Change of volatile flavor compounds during fermentation of bream μg·kg-1

酯類是影響發(fā)酵魚(yú)風(fēng)味的重要化合物。一般來(lái)說(shuō)，它們是由具有高糖酵解或脂解活性的微生物通過(guò)酸和醇酯化形成的，為產(chǎn)品貢獻(xiàn)果味香氣[28]。發(fā)酵4 d后，Lp-1接種組和Sc-2018接種組中總酯類化合物分別是對(duì)照組的3.68和3.60倍，尤其是乙酸乙酯的含量顯著高于對(duì)照組。發(fā)酵4 d后，Lp-1接種組和Sc-2018接種組中總酯類化合物含量無(wú)顯著差異，但Sc-2018接種組酯類化合物種類最多。其中乙酸乙酯具有檸檬油氣味，結(jié)果表明，接種發(fā)酵可促進(jìn)酯類風(fēng)味物質(zhì)的形成，對(duì)發(fā)酵鳊魚(yú)的風(fēng)味起著重要作用。

多數(shù)醇類化合物具有令人愉快的香氣，是發(fā)酵魚(yú)主要的揮發(fā)性化合物[29]。發(fā)酵4 d后，各發(fā)酵組中，醇類揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量最高，占總揮發(fā)性物質(zhì)的40.23%～53.78%。發(fā)酵4 d后，Sc-2018接種組醇類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是Lp-1接種組和對(duì)照組的1.40和2.50倍。其中，主要的醇類化合物為乙醇，Lp-1接種組 [(1 382.67±70.23) μg·kg-1] 和 Sc-2018接種組乙醇 [(2 491.16±270.71) μg·kg-1] 質(zhì)量分?jǐn)?shù)尤其高，接種組乙醇含量較高的原因可能是釀酒酵母能夠通過(guò)酒精發(fā)酵途徑利用碳水化合物產(chǎn)生大量乙醇，而戊糖乳桿菌為兼性異型乳酸發(fā)酵菌，可通過(guò)乳酸發(fā)酵途徑產(chǎn)生乙醇[29]。Sc-2018接種組中檢測(cè)到較高的苯乙醇 [(378.51±28.74) μg·kg-1]，苯乙醇是一種重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，具有甜香、玫瑰花香和蜂蜜香[29]。苯乙醇是芳香族氨基酸——苯丙氨酸的代謝產(chǎn)物，Sc-2018接種組苯乙醇含量較高可能與釀酒酵母降解苯丙氨酸生成苯乙醇有關(guān)。另外，一些來(lái)源于香料的揮發(fā)性化合物也有助于鳊魚(yú)香氣的形成，如芳樟醇等。

對(duì)照組總?cè)┵|(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其余兩組，主要是己醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高 [(155.74±31.57) μg·kg-1]。己醛呈草腥味和脂肪味等不愉悅氣味[30]。相較于對(duì)照組[(322.67±64.43) μg·kg-1]，Lp-1接種組 [(97.99±25.76) μg·kg-1] 和 Sc-2018接種組 [(210.73±56.37)μg·kg-1] 中己醛顯著降低，表明接種發(fā)酵后鳊魚(yú)的腥味、草腥味和脂肪味等不良?xì)馕队兴档汀?/p>

酮主要由不飽和脂肪酸氧化、微生物代謝或氨基酸降解產(chǎn)生[31]。發(fā)酵4 d后，Lp-1接種組和Sc-2018接種組酮類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是對(duì)照組的2.36和2.48倍。各發(fā)酵組中均檢測(cè)出3-羥基-2-丁酮，其中 Lp-1接種組 [(832.38±22.65) μg·kg-1] 尤其高 (P＜0.05)，占總酮類物質(zhì)的67.17%。3-羥基-2-丁酮 (乙偶姻) 呈水果香和木香及令人愉悅的奶香，在丁二醇脫氫酶作用下可逆地轉(zhuǎn)換成2,3-丁二醇，或在丁二酮還原酶作用下可逆轉(zhuǎn)換成具有奶酪、黃油味的2,3-丁二酮 (雙乙酰)[32-33]。王蔚新[29]研究發(fā)現(xiàn)接種不同微生物菌株的發(fā)酵酸魚(yú)中含有的3-羥基-2-丁酮存在較大差異。Lp-1接種組中3-羥基-2-丁酮含量顯著高于Sc-2018接種組和對(duì)照組，由此可見(jiàn)，戊糖乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中可代謝產(chǎn)生3-羥基-2-丁酮，對(duì)鳊魚(yú)特殊風(fēng)味形成具有促進(jìn)作用。

在發(fā)酵4 d后，對(duì)照組、Lp-1接種組和Sc-2018接種組中酸類化合物存在顯著差異(P＜0.05)，Lp-1接種組中酸類化合物顯著高于其余兩組，分別是對(duì)照組和Sc-2018接種組樣品的2.85和1.49倍。所有樣品中共5種酸類化合物，包括乙酸、異丁酸、壬酸、異戊酸和2-甲基丁酸。乙酸是發(fā)酵魚(yú)中重要的酸類化合物，與乙酸乙酯的生成存在關(guān)聯(lián)。Lp-1接種組發(fā)酵過(guò)程中檢出最多乙酸 [(664.65±31.31) μg·kg-1]，顯著高于另外兩組 (P＜0.05)，占總酸類化合物的75.84%。乙酸作為乳酸菌異型乳酸發(fā)酵的產(chǎn)物，與乳酸菌的快速生長(zhǎng)有關(guān) (圖1)。發(fā)酵結(jié)束后，Lp-1接種組烷烴類化合物和烯烴類化合物均高于對(duì)照組和Sc-2018接種組。樣品中檢測(cè)出多種烯烴化合物和其他物質(zhì)，包括姜黃烯、(+)-檸檬烯和花椒素等。這些化合物主要來(lái)源于香料，如生姜、香葉等，這可能是鳊魚(yú)香氣形成的另一個(gè)重要因素。

續(xù)表 1

綜上，接種發(fā)酵后酯類、酮類和醇類含量均有不同程度的增加，接種戊糖乳桿菌Lp-1和釀酒酵母菌Sc-2018可通過(guò)降低呈草腥味和脂肪味等不愉悅氣味化合物的含量和增加令人愉悅化合物的含量來(lái)提高發(fā)酵鳊魚(yú)的風(fēng)味品質(zhì)。

3 結(jié)論

微生物接種發(fā)酵有利于提升發(fā)酵鳊魚(yú)的風(fēng)味和安全品質(zhì)。從食品安全角度來(lái)看，接種戊糖乳桿菌Lp-1 和釀酒酵母 Sc-2018 發(fā)酵顯著降低了發(fā)酵鳊魚(yú)中尸胺、腐胺、組胺和總生物胺含量，抑制了TVB-N 的累積，其中戊糖乳桿菌 Lp-1 接種發(fā)酵抑制效果更佳。從風(fēng)味角度來(lái)看，接種乳酸菌和酵母菌發(fā)酵促進(jìn)了蛋白降解和風(fēng)味的形成，接種發(fā)酵能有效抑制呈草腥味和脂肪味等不愉悅氣味的己醛生成，促進(jìn)乙酸乙酯、乙醇、3-羥基-2-丁酮等令人愉悅的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生，提升發(fā)酵鳊魚(yú)的風(fēng)味；且接種戊糖乳桿菌 Lp-1 對(duì)形成乙酸乙酯、3-羥基-2-丁酮等風(fēng)味物質(zhì)的促進(jìn)效果優(yōu)于釀酒酵母 Sc-2018。因此，在兩段式階段控溫發(fā)酵方式的基礎(chǔ)上，接種戊糖乳桿菌和釀酒酵母可進(jìn)一步提高低鹽發(fā)酵鳊魚(yú)的產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全，為開(kāi)發(fā)低鹽和酸度適中的發(fā)酵魚(yú)制品提供了可能的解決思路，具有良好的應(yīng)用潛力。