巖藻黃質(zhì)關鍵前體新黃質(zhì)的代謝工程合成

張桂林，張亞亭，姜 宏，劉 振，毛相朝,

1. 中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266003

2. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237

巖藻黃質(zhì)是一種類胡蘿卜素，在自然界中分布廣泛，主要存在于藻類、貝類中，尤其在褐藻、硅藻中含量較高。巖藻黃質(zhì)可以與葉綠素、蛋白質(zhì)形成捕光復合體，是硅藻中發(fā)揮捕光作用的重要化合物[1]。目前有關巖藻黃質(zhì)活性的報道較多，研究表明巖藻黃質(zhì)具有抑菌、抗炎、抗肥胖、抗糖尿病、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腸道菌群和抗器官纖維化等生理活性[2-6]。

目前巖藻黃質(zhì)的最主要來源依舊是海藻[7]，例如海帶 (Laminaria japonica)、三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum)[8]。巖藻黃質(zhì)是一種優(yōu)質(zhì)的海洋來源功能因子，但由于其合成途徑目前尚未得到完全解析，其生產(chǎn)及產(chǎn)量調(diào)控尚缺乏理論依據(jù)[9-12]，合成生物學是發(fā)掘未知合成途徑的重要手段，通常需要首先在微生物中異源構(gòu)建目標化合物的上游已知中間物的合成途徑，然后利用合成該中間物的工程菌株探索下游未知途徑[13]。目前已知合成途徑且結(jié)構(gòu)上最接近巖藻黃質(zhì)的中間物是新黃質(zhì)[14]。作為巖藻黃質(zhì)的可能前體物質(zhì)，新黃質(zhì)的結(jié)構(gòu)與巖藻黃質(zhì)很相似 (圖1)，兩者均含有1條多烯鏈，2個六元環(huán)和1個累積雙鍵，但存在著雙鍵、羥基和羰基、乙酰氧基的區(qū)別。

圖1 新黃質(zhì)與巖藻黃質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formula of neoxanthin and fucoxanthin

新黃質(zhì)的合成途徑見圖2。甲羥戊酸 (MVA)途徑主要存在于真核生物、古生菌和植物的細胞質(zhì)中，甲基赤蘚糖醇-4-磷酸 (MEP) 途徑主要存在于細菌和植物葉綠體中，丙酮酸、甘油醛-3-磷酸和乙酰輔酶A分別通過MEP途徑和MVA途徑生成MEP和MVA，再經(jīng)由其他酶催化生成異戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸 (DMAPP)[15-17]。大腸桿菌中含有MEP途徑，并有法尼基焦磷酸 (FPP)可以作為巖藻黃質(zhì)的底物[15,18]。

圖2 新黃質(zhì)合成途徑Fig. 2 Synthetic pathway of neoxanthin

目前尚未見以微生物宿主生產(chǎn)新黃質(zhì)的報道，因此構(gòu)建合成新黃質(zhì)的微生物細胞工廠成為發(fā)掘巖藻黃質(zhì)的未知途徑，并進一步成為海藻高效生產(chǎn)巖藻黃質(zhì)提供理論依據(jù)的關鍵環(huán)節(jié)。本研究以大腸桿菌 (Escherichia coli ) 為宿主，按照代謝途徑逐步構(gòu)建番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)的合成途徑，最終實現(xiàn)了新黃質(zhì)的代謝工程合成，為進一步發(fā)掘巖藻黃質(zhì)合成的未知途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

本文所用菌株的基因型、功能及來源見表1，質(zhì)粒的基因型、功能及來源見表2。

表1 本文所用菌株Table 1 Strains in this study

表2 本文所用質(zhì)粒Table 2 Plasmids in this study

1.1.2 生化試劑及藥品

番茄紅素標準品、β-胡蘿卜素標準品、玉米黃質(zhì)標準品、紫黃質(zhì)標準品和新黃質(zhì)標準品購于Sigma-Aldrich公司。高保真DNA聚合酶試劑Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、DNA聚合酶試劑2×Taq Master Mix (Dye Plus)、重組克隆試劑ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit購于諾唯贊生物公司。凝膠萃取試劑盒E.Z.N.A?Gel Extraction Kit購于Omega Bio-Tek公司。細菌基因組DNA提取試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒購于天根生化科技公司。酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、氨芐青霉素、氯霉素購于索萊寶科技公司。SSCS Solution感受態(tài)制備液購于上海捷瑞生物公司。其他試劑及藥品未作特殊說明均為國藥化試分析純。PCR引物合成及測序由青島擎科公司提供。

1.1.3 試劑及培養(yǎng)基配方

LB培養(yǎng)基：0.5%酵母粉，1%蛋白胨，1%的氯化鈉(NaCl，固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂粉)，115 ℃ 滅菌 30 min。

ZYP-5052培養(yǎng)基：0.5%酵母粉，1%蛋白胨，8.1 g·L-1磷酸氫鈉 (Na2HPO4)，6.8 g·L-1磷酸二氫鉀(KH2PO4)，3.3 g·L-1磷酸銨 [(NH4)2SO4]，0.2% 的0.5 mol·L-1硫酸鎂 (MgSO4)，2% 的 50×5052母液(50×5052母液：25%甘油，2.5%葡萄糖，10%的α-乳糖)，115 ℃ 滅菌 30 min。

氨芐青霉素溶液：溶劑為水，在培養(yǎng)基中使用的終質(zhì)量濃度為 100 μg·mL-1。

氯霉素溶液：溶劑為乙醇，在培養(yǎng)基中使用的終質(zhì)量濃度為 25 μg·mL-1。

1.2 方法

1.2.1 DNA 目的片段 PCR 擴增

考慮到一個質(zhì)粒上需要加入多個目的片段，為了保證每個片段能夠正確表達，本研究在構(gòu)建質(zhì)粒的過程中會在2個目的片段的中間加入一段核糖體結(jié)合位點 (RBS)。在NCBI查找了菠蘿泛菌中crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ目的片段的CDS序列[19]。設計引物見表3，從菠蘿泛菌基因組中通過PCR擴增得到了這5個基因。ZEP3基因來自三角褐指藻[20]，NSY基因來源于番茄[21]，由華大基因全基因合成。

表3 引物序列Table 3 Primer sequence

1.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

同源重組法構(gòu)建質(zhì)粒：利用高保真DNA聚合酶PCR擴增目的基因片段與質(zhì)粒片段，使得各片段連接處留有15～20 bp同源序列，使用重組克隆試劑進行重組連接，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coliTrelief?5α感受態(tài)中，涂布至對應抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。12 h后對固體培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證并選取樣品進行測序。LB培養(yǎng)基培養(yǎng)測序正確的菌株，使用快速質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.3 工程菌的構(gòu)建

單質(zhì)粒工程菌的構(gòu)建：將pTrc99a-crtEBI、pTrc99a-crtEBIY和pTrc99a-crtEBIYZ質(zhì)粒分別利用熱激法直接轉(zhuǎn)入E. coliBL21感受態(tài)細胞中。

雙質(zhì)粒工程菌的構(gòu)建：將E. coliBL21 pTrc99acrtEBIYZ工程菌制備成感受態(tài)細胞，再利用熱激法將pACYCDuet-1-QZEP3、pACYCDuet-1-QZEP3-NSY質(zhì)粒轉(zhuǎn)入。感受態(tài)制備方法為：將需制成感受態(tài)的菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 h (OD600達到0.6左右)，取菌液在 4 000 r·min-1、4 ℃ 條件下離心5 min，棄上清后加入10%原菌液體積的10%無菌甘油洗滌菌體，再次離心棄上清，再重復一次甘油洗滌和離心棄上清，加入2%原菌液體積的SSCS Solution感受態(tài)制備液，即得到感受態(tài)細胞。

1.2.4 工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

將工程菌在含有對應抗生素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再挑取菌落在含有抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，得到種子液。按2%接菌量將種子液接入50 mL ZYP-5052培養(yǎng)基，20 ℃發(fā)酵48 h。

1.2.5 產(chǎn)物提取

大腸桿菌類胡蘿卜素提取[22]：取2.0 mL的菌液，8 000 r·min-1離心10 min留菌體，加入1 mL丙酮，在40 ℃條件下，萃取至菌體顏色全部變成白色，12 000 r·min-1離心2 min留丙酮上清。萃取液采用氮吹法進行吹干，獲得類胡蘿卜素產(chǎn)物，用200 μL丙酮復溶，0.22 μm尼龍濾膜去除雜質(zhì)，得到待檢測樣品。

1.2.6 高效液相色譜 (HPLC) 和質(zhì)譜法 (MS) 對產(chǎn)物的鑒定及定量分析

C30檢測方法[23]：使用YMC Carotenoid類胡蘿卜素分析色譜柱 (250×4.6 mm) 對提取產(chǎn)物進行分析，進樣量20 μL，吸光值476 nm，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1。具體的液相檢測條件見表4。用該方法繪制標準曲線 [y為峰面積，x為質(zhì)量濃度(mg·L-1)]。番茄紅素：y=52.505x-1.670 7,R2=0.999；β-胡蘿卜素：y=1 312.9x-12.668,R2=0.999；玉米黃質(zhì)：y=129.92x-39.204,R2=0.999；紫黃質(zhì)：y=130.76x-33.414,R2=0.999。

表4 YMC Carotenoid流動相條件Table 4 YMC Carotenoid mobile phase conditions

上述C30色譜柱檢測方法無法分離紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)，所以我們采用了另一種C18檢測方法來達到分離目的。C18檢測方法[24]：使用C18 (250×4.6 mm, 5 μm)色譜柱檢測，流動相是V(乙腈)∶V(乙酸乙酯)∶V(水)=74∶16∶10，采用等度洗脫，進樣量20 μL，吸光值440 nm，柱溫42 ℃，流速1.0 mL·min-1。用該方法繪制標準曲線 [y為峰面積，x為質(zhì)量濃度 (μg·L-1)]。紫黃質(zhì)：y=76.889x-140.93，R2=0.997；新黃質(zhì)：y=357.07x+2.392，R2=0.991。

四極桿飛行時間質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源 (ESI)；電離化方式為ESI+；毛細管溫度為350 ℃；霧化器壓力為276 kPa；干燥氣流速為10 L·min-1；掃描范圍為 m/z 20～1 000。

1.2.7 細胞干質(zhì)量的測量方法

取2 mL發(fā)酵后的菌液，12 000 r·min-1離心3 min，置于85 ℃烘箱烘干24 h，測量細胞干質(zhì)量[25]。根據(jù)產(chǎn)物濃度與細胞干質(zhì)量，計算出產(chǎn)量單位 (細胞干質(zhì)量，下同) 為 mg·g-1或 μg·g-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄紅素、 β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)工程菌的構(gòu)建

質(zhì)粒pTrc99a-crtEBI、pTrc99a-crtEBIY和pTrc99a-crtEBIYZ成功轉(zhuǎn)入E. coliBL21后，對應的工程菌E. coliBL21 pTrc99a-crtEBI、E. coliBL21 pTrc99a-crtEBIY和E. coliBL21 pTrc99a-crtEBIYZ發(fā)酵后菌體發(fā)生了顏色變化，對菌體內(nèi)物質(zhì)進行HPLC分析 (圖3)，結(jié)果表明成功產(chǎn)出了番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)。根據(jù)標準曲線及細胞干質(zhì)量計算出各產(chǎn)物濃度，其中E. coliBL21 pTrc99a-crtEBI的番茄紅素產(chǎn)量為3.20 mg·g-1；E.coliBL21 pTrc99a-crtEBIY的β-胡蘿卜素產(chǎn)量為1.35 mg·g-1；E. coliBL21 pTrc99a-crtEBIYZ 的玉米黃質(zhì)產(chǎn)量為 0.70 mg·g-1。

圖3 番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)工程菌的構(gòu)建Fig. 3 Construction of lycopene, β-carotene and zeaxanthin engineered bacteria

在T7啟動子的作用下，基因crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ成功表達，產(chǎn)出目標產(chǎn)物。根據(jù)HPLC結(jié)果，E. coliBL21 pTrc99a-crtEBIY和E. coliBL21 pTrc99a-crtEBIYZ中并沒有發(fā)現(xiàn)中間產(chǎn)物的積累，可能原因是產(chǎn)物濃度較低，CRTI、CRTY和CRTZ蛋白水平相較于低濃度產(chǎn)物來說催化能力較強，導致沒有中間產(chǎn)物的積累，也可能與菌株本身以及生長狀況有關，不同菌株在不同生長狀況下產(chǎn)物積累量存在差異。

2.2 紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)工程菌株的構(gòu)建

以產(chǎn)玉米黃質(zhì)的菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ為宿主菌株，轉(zhuǎn)入pACYCDuet-1-ZEP3質(zhì)粒，構(gòu)建產(chǎn)紫黃質(zhì)菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-ZEP3。但HPLC檢測結(jié)果顯示并無紫黃質(zhì)產(chǎn)生。分析原因可能為ZEP3基因來源于三角褐指藻，是真核生物來源的基因，可能存在信號肽或葉綠體轉(zhuǎn)運肽的編碼區(qū)，但原核生物無法實現(xiàn)真核生物對蛋白的加工，導致蛋白折疊錯誤，使活性減弱甚至消失。

因此利用網(wǎng)站http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/預測葉綠體轉(zhuǎn)運肽，預測前54個氨基酸為cTP區(qū)域。去除ZEP3基因的cTP后得到QZEP3，重新構(gòu)建pACYCDuet-1-QZEP3質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入產(chǎn)玉米黃質(zhì)的工程菌中，HPLC分析菌體內(nèi)產(chǎn)物有紫黃質(zhì)存在 (圖4)，進一步證實了以上猜想。

圖4 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3工程菌發(fā)酵產(chǎn)物HPLC結(jié)果Fig. 4 HPLC results of fermentation products of E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3

根據(jù)標準曲線及細胞干質(zhì)量計算出產(chǎn)物濃度，E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3的紫黃質(zhì)的產(chǎn)量為114.70 μg·g-1, 玉米黃質(zhì)產(chǎn)量為289.45 μg·g-1。該工程菌中不僅有紫黃質(zhì)生成，還有β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)中間產(chǎn)物的積累，但并未檢測到番茄紅素的積累，可能原因是QZEP3的蛋白水平并不高，使得玉米黃質(zhì)有較多積累，而番茄紅素和β-胡蘿卜素的積累可能與菌株生長狀況相關，在不同生長狀況下產(chǎn)物積累量存在差異，致使菌體內(nèi)存在中間產(chǎn)物的積累。進一步分析HPLC結(jié)果，該工程菌不僅產(chǎn)出預期的β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)，還有未知的產(chǎn)物 (保留時間6.2和10.6 min) 被檢測到，猜測可能是QZEP3催化玉米黃質(zhì)生成紫黃質(zhì)時還生成了中間體產(chǎn)物。

以產(chǎn)紫黃質(zhì)的菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3為宿主菌株，轉(zhuǎn)入pACYCDuet-1-QZEP3-NSY質(zhì)粒，構(gòu)建產(chǎn)新黃質(zhì)菌株E. coli BL21 NEO。用C30和C18色譜柱的方法對E. coli BL21 NEO菌體內(nèi)產(chǎn)物進行檢測 (圖5)。紫黃質(zhì)與新黃質(zhì)是同分異構(gòu)體，分子式為C40H56O4，分子量為600.417 9。E. coli BL21 NEO中的新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)質(zhì)譜結(jié)果 (圖6) 顯示，新黃質(zhì)對應分子離子峰的m/z為600.414 6，紫黃質(zhì)對應分子離子峰的m/z為600.413 8，這與紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)分子量基本相當。HPLC與MS結(jié)果表明E. coli BL21 NEO成功產(chǎn)出新黃質(zhì)。根據(jù)標準曲線及細胞干質(zhì)量計算出各產(chǎn)物濃度，其中新黃質(zhì)的產(chǎn)量為99.27 μg·g-1，紫黃質(zhì)的產(chǎn)量為150.30 μg·g-1，玉米黃質(zhì)的產(chǎn)量為119.77 μg·g-1。E. coli BL21 NEO 不僅產(chǎn)出預期的新黃質(zhì)，還有β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的積累，也有未知的中間體產(chǎn)物生成。

圖5 E. coli BL21 NEO工程菌HPLC檢測結(jié)果Fig. 5 Detection of E. coli BL21 NEO by HPLC

圖6 E. coli BL21 NEO工程菌新黃質(zhì) (a) 和紫黃質(zhì) (b) 的質(zhì)譜檢測結(jié)果Fig. 6 Detection results of neoxanthin (a) and violaxanthin (b) in E. coli BL21 NEO by MS

本文以產(chǎn)玉米黃質(zhì)的工程菌為宿主，并將QZEP3和NSY導入，實現(xiàn)了新黃質(zhì)的合成，但是QZEP3和NSY基因?qū)牒蟮淖宵S質(zhì)和新黃質(zhì)產(chǎn)量濃度不高，可能是上游途徑的底物含量少，酶的催化效果不高，后續(xù)可以通過理性設計或定向進化對QZEP3和NSY進行改造，提高QZEP3和NSY在大腸桿菌中的活性來提高紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)的產(chǎn)量，或者通過更換啟動子，調(diào)節(jié)MEP上游通路途徑，基因的過表達等方法[26-29]，進一步提升紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

本文以大腸桿菌為表達菌株，進行了新黃質(zhì)合成途徑的構(gòu)建。以含有crtEBIYZ基因的產(chǎn)玉米黃質(zhì)的E. coli BL21為宿主，引入了QZEP3和NSY基因，成功在大腸桿菌中建立了新黃質(zhì)合成途徑。有關新黃質(zhì)本身的生理活性研究并不多[30-32]，以微生物生產(chǎn)新黃質(zhì)可提供新的生產(chǎn)途徑，為研究新黃質(zhì)的生理活性等提供便利，也為進一步探究巖藻黃質(zhì)的合成途徑奠定了基礎。巖藻黃質(zhì)的合成途徑可以指導褐藻等海藻中巖藻黃質(zhì)等物質(zhì)的高值化利用，如通過理性設計改造獲得高產(chǎn)巖藻黃質(zhì)的藻類。