貝萊斯芽胞桿菌次生抗生物質(zhì)的研究進(jìn)展

楊 冰，杜春梅*

（1. 黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2. 黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis廣泛分布于自然界，具有重要的研究?jī)r(jià)值，但自發(fā)現(xiàn)以來(lái)其“身份”一直飽受爭(zhēng)議。2005年，Ruiz-García等[1]從貝萊斯河的環(huán)境樣本中首次分離出兩株新的芽胞桿菌（CR-502T和CR-14b）并命名為貝萊斯芽胞桿菌。2008年，根據(jù)gyrB基因相似性和DNA雜交值，將解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens和貝萊斯芽胞桿菌認(rèn)定為同物異名，貝萊斯芽胞桿菌因此失去命名地位[2]。2011年，解淀粉芽胞桿菌被劃分為兩個(gè)亞種，即解淀粉芽胞桿菌解淀粉亞種B. amyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciens和解淀粉芽胞桿菌植物亞種B. amyloliquefacienssubsp.plantarum。2015年，基于全基因組分析認(rèn)定甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌B. methylotrophicus和解淀粉芽胞桿菌植物亞種的基因組相似度高達(dá)95%，差異微小，因此確定二者為同物異名，解淀粉芽胞桿菌植物亞種失去命名地位[3,4]。2016年，Dunlap等[5]通過(guò)全基因組比較法認(rèn)定貝萊斯芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌不是同一物種，把解淀粉芽胞桿菌植物亞種、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌重新歸類為貝萊斯芽胞桿菌，貝萊斯芽胞桿菌重新獲得命名地位。據(jù)此，B.amyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42、B. amyloliquefaciensFR203A、B. amyloliquefaciensSQR9、B.amyloliquefaciensNJN-6、B. amyloliquefaciensSQRT3、B. methylotrophicusKACC 13105T、B. subtilisGB03等菌株在分類學(xué)上均為貝萊斯芽胞桿菌[6]。清楚地認(rèn)知貝萊斯芽胞桿菌的分類地位為深入挖掘貝萊斯芽胞桿菌在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用潛力奠定了基礎(chǔ)。

目前，貝萊斯芽胞桿菌及其代謝產(chǎn)物主要被用作生物防控劑、植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、醫(yī)療殺菌劑和抗癌藥劑。已發(fā)現(xiàn)許多貝萊斯芽胞桿菌菌株能夠抑制病原體的生長(zhǎng)和繁殖，對(duì)番茄青枯病[7]、水稻條紋病[8]、炭疽病[9]、火疫病[10]、菊花軟腐病[11]等多種植物病害，魚類癤病[12]等動(dòng)物病害以及人類宮頸癌[13]和乳腺癌[14]等臨床疾病呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。然而，不同來(lái)源的貝萊斯芽胞桿菌菌株在不同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有很大的差異，對(duì)已發(fā)現(xiàn)的貝萊斯芽胞桿菌次生抗菌物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、合成調(diào)控機(jī)制等進(jìn)行總結(jié)，有助于深入研究其代謝調(diào)控通路并通過(guò)組合生物學(xué)等手段挖掘新的代謝產(chǎn)物。本文對(duì)貝萊斯芽胞桿菌的次生抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、生物合成基因簇、合成調(diào)控機(jī)制、及其在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)和回顧，以期為今后利用貝萊斯芽胞桿菌及其代謝產(chǎn)物研發(fā)生防制劑或臨床藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 部分已知次生抗生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)

已知的貝萊斯芽胞桿菌產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)主要是環(huán)脂肽類化合物桿菌霉素 D（Bacillomycin-D）和豐原素（Fengycin），而其抗細(xì)菌活性物質(zhì)類型較多，如環(huán)脂肽類化合物表面活性素（Surfactin），多烯類化合物桿菌烯（Bacillaene）、大環(huán)內(nèi)酯類化合物大環(huán)內(nèi)酰亞胺（Macrolactin）和艱難菌素（Difficidin），以及多肽類細(xì)菌素兒茶酚型桿菌巴?。˙acillibactin）、二肽類環(huán)狀結(jié)構(gòu)化合物桿菌溶素（Bacilysin）、環(huán)狀肽結(jié)構(gòu)廣譜細(xì)菌素淀粉環(huán)霉素（Amylocyclicin）和噁唑/噻唑型窄譜抗線蟲細(xì)菌素車前唑霉素（Plantazolicin）[15]。一些已知次生抗生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 部分貝萊斯芽胞桿菌次生抗生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)圖[6,18]Fig. 1 Structure diagram of part of secondary antibiotic substance procuced byBacillus velezensis[6,18]

2 次生抗生物質(zhì)的生物合成基因簇

在貝萊斯芽胞桿菌的眾多菌株中，生物合成基因簇研究最清楚的是B. velezensisFZB42，其基因組中存在9個(gè)巨大的抗生物質(zhì)合成基因簇，分別是srf、bmy、fen、dhb、bac、mln、bae、dfn和nrs，約占整個(gè)基因組的10%，這些生物合成基因簇分別編碼多種抗生物質(zhì)的生物合成酶，包括表面活性素、桿菌霉素-D、豐原素、桿菌巴汀、桿菌溶素、大環(huán)內(nèi)酰亞胺、桿菌烯、艱難菌素和一種未知功能的推定肽[16]。在九個(gè)基因簇中，有5個(gè)基因簇（srfABCD、bmyCBAD、fenABCDE、dhbABCDEF和nrsABCDEF）負(fù)責(zé)編碼相應(yīng)的非核糖體肽合成酶（Nonribosomal peptide synthetases，NRPSs），這些酶組成大型復(fù)合酶，負(fù)責(zé)三個(gè)主要的脂肽亞家族—Surfactins、Bacillomycin-D和Fengycins的合成[17]；有3個(gè)基因簇編碼聚酮化合物合酶（Polyketide synthases，PKSs），分別是指導(dǎo)Macrolactin合成的mlnABCDEFGHI、指導(dǎo)Bacillaene合成的baeBCDE,acpK,baeGHIJLMNRS和指導(dǎo)Difficidin合成的dfnAYXBCDEFGHIJKLM[18]。這3個(gè)基因簇覆蓋近200 kb，是貝萊斯芽胞桿菌FZB42基因組中最大的基因簇[19]。PKSs和NRPSs既可以單獨(dú)合成某些抗生物質(zhì)，也可以協(xié)同作用，Bacillaene就是PKSs和 NRPSs協(xié)同作用的結(jié)果。PKSs和NRPSs分別負(fù)責(zé)結(jié)合丙二酰衍生物和氨基酸，且均以多酶復(fù)合物的形式發(fā)揮作用，從而通過(guò)不同的構(gòu)件來(lái)合成各種具有治療潛力的次生物質(zhì)[20]。在貝萊斯芽胞桿菌中，3種脂肽和3種PKS型聚酮化合物都是通過(guò)4′-磷酸泛酰轉(zhuǎn)移酶（Sfp）途徑生物合成的[21]，而Bacilysin的產(chǎn)生與該途徑無(wú)關(guān)，而是由bac基因簇指導(dǎo)合成。另外，貝萊斯芽胞桿菌還通過(guò)核糖體途徑產(chǎn)生細(xì)菌素，目前已被鑒定的兩種細(xì)菌素為淀粉環(huán)霉素和車前唑霉素，二者對(duì)近緣的革蘭氏陽(yáng)性菌顯示出高抗菌活性[22,23]。2011年，Rueckert 等[24]將 FZB42與非植物相關(guān)的解淀粉芽胞桿菌 DSM7T的基因組序列進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著差異。值得注意的是，非核糖體合成抗菌聚酮化合物大環(huán)內(nèi)酰亞胺和艱難菌素的能力是植物亞種即貝萊斯芽胞桿菌的獨(dú)特特征，而合成脂肽的能力是與解淀粉芽胞桿菌解淀粉亞種共有的，而且這些特點(diǎn)與枯草芽胞桿菌物種復(fù)合體的其他成員不一致[25]。

3 抗生物質(zhì)合成的調(diào)控

3.1 脂肽類抗生物質(zhì)合成的調(diào)控

3.1.1 表面活性素 表面活性素是具有兩親性結(jié)構(gòu)的生物表面活性分子，是由β-羥基脂肪酸鏈（C-13～C-16）和親水性七肽環(huán)連接而成，肽環(huán)的氨基酸序列為Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu[26]。貝萊斯芽胞桿菌能產(chǎn)生少量表面活性素（＜其生物量的 10%），不僅具有抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，而且可以在種間或種內(nèi)相互作用中作為信號(hào)分子[27]。表面活性素是由srfA操縱子編碼的非核糖體肽合成酶的復(fù)雜相互作用合成的。srfA操縱子由srfAA、srfAB、srfAC和srfAD四個(gè)開放閱讀框（ORFs）組成。其中，srfAA、srfAB、SrfAC負(fù)責(zé)編碼模塊化酶，模塊化酶負(fù)責(zé)將7個(gè)氨基酸整合到肽環(huán)中。srfAD是一種修復(fù)酶，負(fù)責(zé)編碼硫酯酶/?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)表面活性素生物合成的起始[28]。

表面活性素的生物合成取決于細(xì)胞密度，群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）阻止細(xì)菌細(xì)胞的持續(xù)生產(chǎn)進(jìn)而限制表面活性素的總產(chǎn)量[29]。從圖2可以看出，芽胞桿菌細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中能持續(xù)分泌細(xì)胞外信號(hào)因子ComX信息素（10-氨基酸修飾的肽），當(dāng)其濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，組氨酸激酶受體ComP檢測(cè)到ComX，隨后自動(dòng)磷酸化其同源受體調(diào)控因子ComA。ComA是ComQXPA信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)（該系統(tǒng)在幾種芽胞桿菌屬中負(fù)責(zé)QS）的一部分。隨后，磷酸化的ComA（ComA～P）通過(guò)與啟動(dòng)子結(jié)合觸發(fā)srfA操縱子的轉(zhuǎn)錄，并啟動(dòng)表面活性素的生物合成[18]。表面活性素間接與傳感器激酶 KinC相互作用，促進(jìn)主反應(yīng)調(diào)控因子Spo0A（芽胞桿菌產(chǎn)孢開始的主控元件，也是芽胞桿菌生物膜形成的正調(diào)控因子）的磷酸化。磷酸化的Spo0A誘導(dǎo)SinI（一種小肽，與SinR結(jié)合會(huì)使SinR蛋白活性受到抑制）的表達(dá)，SinI與阻遏物SinR（生物膜形成的負(fù)調(diào)控因子）會(huì)發(fā)生拮抗從而導(dǎo)致參與生物膜形成的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。除了依賴ComX調(diào)節(jié)之外，芽胞形成刺激因子（CSF）和天冬氨酸磷酸酶蛋白（Rap）也調(diào)節(jié)表面活性素的生物合成[30]。CSF是一種由芽胞桿菌分泌的物種特異性胞外肽，由寡肽滲透酶（Opp，也稱為Spo0K）轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)，并與Rap蛋白結(jié)合，使ComA～P去磷酸化，失去激活srfA操縱子轉(zhuǎn)錄的功能。而抑制ComA～P的去磷酸化能保證srfA基因的轉(zhuǎn)錄和表面活性素的生物合成[31]，如敲除ComA抑制了表面活性素的產(chǎn)生，過(guò)表達(dá)ComA會(huì)誘導(dǎo)表明活性素的生成[32]。

圖2 貝萊斯芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌的群體感應(yīng)調(diào)控表面活性素的產(chǎn)生Fig. 2 Quorum sensing inB. velezensisandB. subtilisregulates the production of sufactin

3.1.2 豐原素 豐原素的結(jié)構(gòu)是由β-羥基脂肪酸鏈（C12-C19）和環(huán)狀十肽通過(guò)內(nèi)酯鍵組成的，肽環(huán)的氨基酸序列為（Glu-Ora-Tyr-Thr-Glu-Ala（Val）-Pro-Gln-Tyr-Ile）[33]。由于在第六個(gè)位置存在Ala/Val二形態(tài)，因而有兩種不同的豐原素Fengycin A和Fengycin B，且二者在結(jié)構(gòu)上也有所不同。豐原素的操縱子由五個(gè)閱讀框FenA-E組成[34]。FenC是起始模塊，負(fù)責(zé)激活并組裝第一個(gè)和第二個(gè)氨基酸。豐原素的啟動(dòng)子位于FenC轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游86 bp處，其UP元件是包括A和T的一個(gè)17 bp的序列，在啟動(dòng)子-35區(qū)和RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的上游，對(duì)啟動(dòng)子活性至關(guān)重要，UP元件突變能使轉(zhuǎn)錄頻率降低85%，大大抑制了豐原素的合成[35,36]。FenB負(fù)責(zé)組裝最后一個(gè)氨基酸，位于肽合酶基因簇的C端，敲除FenB則合成的豐原素不能被釋放[37]。內(nèi)源性因素，如雙組分調(diào)節(jié)因子（ComA/ComP）、Sigma A因子和信號(hào)蛋白（DegU，DegQ），也調(diào)節(jié)豐原素合成酶基因的表達(dá)，sigA上調(diào)可增加豐原素的產(chǎn)量[38]。在低磷條件下，PHR/PhoP通過(guò)控制豐原素合成酶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)豐原素的產(chǎn)生[39]。

3.1.3 桿菌霉素-D 桿菌霉素結(jié)構(gòu)是由β-氨基脂肪酸鏈（C15-C18）和環(huán)狀七肽兩部分組成的，環(huán)七肽的氨基酸序列為Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu-Ser-Thr。編碼桿菌霉素-D肽部分生物合成的是bmyDABC基因簇，在貝萊斯芽胞桿菌FZB42基因組中與豐原素基因簇僅相差25 kb，與枯草芽胞桿菌RB14中iturin-A基因簇的位置完全相同[40]。三個(gè)多效性調(diào)節(jié)因子（DegU、DegQ和ComA）和兩個(gè)σ因子（σB和σH）正向調(diào)節(jié)bmy啟動(dòng)子對(duì)桿菌霉素-D合成的轉(zhuǎn)錄。另一項(xiàng)研究證明編碼DegU和ComA蛋白的基因失活會(huì)導(dǎo)致bmy操縱子的啟動(dòng)子功能受損，失活突變體的bmy操縱子的轉(zhuǎn)錄效率比野生型菌株低3～4倍。Wang等[41]研究表明AbrB通過(guò)與桿菌霉素合成酶操縱子PbacA的啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)抑制桿菌霉素的生物合成，而Spo0A通過(guò)抑制AbrB的表達(dá)間接促進(jìn)桿菌霉素的生物合成。

3.2 聚酮類抗生物質(zhì)合成的調(diào)控

聚酮化合物屬于次級(jí)抗生物質(zhì)的一個(gè)大家族，包括許多具有抗菌、免疫抑制、抗腫瘤等相關(guān)生物活性的化合物。聚酮化合物是由短鏈的?；鶈卧鸩矫擊瓤s合反應(yīng)合成的，然后經(jīng)由PKSs修飾結(jié)構(gòu)域催化進(jìn)行修飾。在新的一輪鏈延伸之前，一組可變的修飾酶可以局部引入結(jié)構(gòu)多樣性，如β-還原、脫水或烯?；€原反應(yīng)等[42]。類似于肽的非核糖體合成，PKS多酶系統(tǒng)使用經(jīng)翻譯后修飾的?；d體蛋白（ACPs）在延伸過(guò)程中引導(dǎo)增長(zhǎng)的聚酮中間體[43]。在解淀粉芽胞桿菌FZB42中鑒定出3個(gè)反式酰基轉(zhuǎn)移酶類型的巨大模塊化PKS系統(tǒng)，其中pks1是模式菌株枯草芽胞桿菌168的pksX操縱子的直系同源物，F(xiàn)ZB42的pks1具有枯草芽胞桿菌168的pksX所不具有的功能，而pks2和pks3簇是新的基因簇。根據(jù)質(zhì)譜分析，pks1（bae）和pks3（dif）基因簇分別編碼多烯類抗生素桿菌素和艱難菌素的生物合成酶。pks1是模塊化組織的巨型合酶，每個(gè)模塊通常包含一個(gè)β-酮酰基合酶（KS）、?；D(zhuǎn)移酶（AT）和ACP?；d體蛋白作為必需和基本的結(jié)構(gòu)域，可以由一組可變的額外結(jié)構(gòu)域來(lái)補(bǔ)充。模塊的順序決定了生物合成事件的順序，并且通常觀察到的 PKS結(jié)構(gòu)和生物合成步驟之間的共線性被證明允許對(duì)I型PKSs進(jìn)行組合操作以產(chǎn)生新化合物[44]。

當(dāng)編碼4′-磷酸泛酰轉(zhuǎn)移酶的sfp基因突變時(shí)，枯草芽胞桿菌168的pksX系統(tǒng)也無(wú)法合成聚酮化合物，因?yàn)镾fp不僅磷酸化表面活性素和其他脂肽類的肽基載體蛋白，而且對(duì)其他載體蛋白，包括聚酮化合物合酶的酰基載體蛋白也顯示出廣泛的底物特異性[45]。

4 貝萊斯芽胞桿菌抗生物質(zhì)的應(yīng)用研究

4.1 防治植物病害

盡管已經(jīng)對(duì)貝萊斯芽胞桿菌的抗生物質(zhì)進(jìn)行了大量的研究，然而在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中，多數(shù)使用的還是活體菌劑，尤其是在動(dòng)植物病害的防治方面。因此，人們推測(cè)抗生物質(zhì)的產(chǎn)生是活體菌劑發(fā)揮效力的關(guān)鍵因素之一。

4.1.1 作用于病原體 表面活性素作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致病原菌細(xì)胞死亡。Surfactin對(duì)青枯菌Ralstonia solanacearum、丁香假單胞菌Pseudomonas syringae、苜蓿萎蔫菌Clavibacter michiganensis等多種病原微生物有抗菌活性。Xiong等[46]從健康番茄植株根際土壤中分離出一株解淀粉芽胞桿菌JK6，對(duì)番茄青枯病的溫室生防效果達(dá)到52.9%以上，且JK6處理的根際土壤中的srfAB、fenD和yndJ的拷貝數(shù)明顯高于對(duì)照，srfAB參與表面活性素的合成，fenD和yndJ參與豐原素的合成，表面活性素主要抗細(xì)菌活性，豐原素主要抗真菌活性，因此，推測(cè)表面活性素的產(chǎn)生可能在JK6保護(hù)植物免受病原體攻擊的生物控制機(jī)制中起主要作用。Grady等[47]通過(guò)體外試驗(yàn)表明，貝萊斯芽胞桿菌9D-6產(chǎn)生的Surfactin B和Surfactin C能抑制苜蓿萎蔫菌的生長(zhǎng)，但不能抑制丁香假單胞菌DC3000 的生長(zhǎng)，但是其活體菌劑能顯著降低DC3000的根定殖。

Fengycins主要是通過(guò)與真菌細(xì)胞膜相互作用改變細(xì)胞滲透性而導(dǎo)致目標(biāo)微生物的細(xì)胞死亡，可被用來(lái)防治多種植物病害。Chen等[48]研究表明，貝萊斯芽胞桿菌FJAT-46737的粗脂肽對(duì)多種病原菌（包括青枯菌、大腸桿菌和尖孢鐮刀菌）具有顯著的拮抗活性，并檢測(cè)出Fengycins是該粗脂肽的主要抗真菌成分，而有機(jī)氮源豐富促進(jìn)Fengycin和Surfactin的產(chǎn)生。Adeniji等[49]研究表明貝萊斯芽胞桿菌NWUMFkBS10.5能產(chǎn)生Fengycin、Iturin和Surfactin，對(duì)兩種玉米真菌病原體禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum和黃色鐮孢菌F. culmorum具有生物防治潛力。

Bacillomycin-D屬于伊枯草素家族脂肽[18]。Gu等[21]研究表明貝萊斯芽胞桿菌FZB42產(chǎn)生的Bacillomycin-D對(duì)禾谷鐮孢菌F. graminearum具有顯著的抗菌活性，能引起菌絲和分生孢子的質(zhì)膜和細(xì)胞壁發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，誘導(dǎo)活性氧的積累造成細(xì)胞死亡。Jin等[9]研究表明貝萊斯芽胞桿菌HN-2產(chǎn)生的桿菌霉素D對(duì)炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides的作用效果比咪鮮胺（Prochloraz）和代森錳鋅（Mancozeb）更強(qiáng)，可損傷炭疽病菌菌絲和孢子的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器滲出，細(xì)胞呈現(xiàn)空洞。Xu等[41]研究表明，Bacillomycin-D可以作為信號(hào)分子通過(guò)促進(jìn)鐵的獲得來(lái)促進(jìn)生物膜的形成，并通過(guò)與其轉(zhuǎn)錄因子Btr結(jié)合來(lái)促進(jìn)鐵 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 FeuABC的轉(zhuǎn)錄，從而增加細(xì)胞內(nèi)鐵濃度，并激活生物膜基質(zhì)成分 KinBSpo0A-SinI-SinR的合成。這些結(jié)果揭示了一種抗生素依賴的信號(hào)機(jī)制，并且此試驗(yàn)基于植物促生長(zhǎng)菌熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescensPF-5與貝萊斯芽胞桿菌SQR9的競(jìng)爭(zhēng)模型系統(tǒng)，證明了Bacillomycin-D有助于SQR9與PF-5的競(jìng)爭(zhēng)，此作用機(jī)制是將鐵的獲取與生物膜的形成和生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)聯(lián)系起來(lái)。

Difficidin及其氧化形式Oxydifficidin由pks3（dif）基因簇編碼的酶負(fù)責(zé)合成[43]。Seong等[7]的研究表明甲基營(yíng)養(yǎng)芽胞桿菌DR-08對(duì)番茄青枯病病原菌有較強(qiáng)的抗菌活性，其發(fā)酵液提取物中含有Difficidin和Oxydifficidin兩種抗菌物質(zhì)，能完全抑制14種植物病原菌的生長(zhǎng)，對(duì)青枯菌的最低抑菌濃度為12.62 μg/mL。Wu等[8]研究表明，貝萊斯芽胞桿菌FZB42能通過(guò)產(chǎn)生Difficidin和Bacilysin而顯示出對(duì)水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzaepv.oryzae和水稻細(xì)菌性條斑病X. oryzaepv.oryzicola的生物控制活性。Difficidin 和Bacilysin可引起質(zhì)壁分離、細(xì)胞裂解，進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)成分流出。二者混合施用，能顯著降低水稻植株的病斑長(zhǎng)度和疾病嚴(yán)重程度，防效穩(wěn)定在 58.82%～72.31%之間，并且使病原細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞壁合成相關(guān)基因（rpfF、gumD、ftsZ、rrlA和glmS）的表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，且rrlA和glmS的下調(diào)水平最顯著。Bacilysin是一種二肽抗菌素，其抗菌活性取決于培養(yǎng)基的組成，其活性可以通過(guò)使用一些拮抗劑如N-乙酰氨基葡萄糖、幾種二肽和氨基酸來(lái)逆轉(zhuǎn)，這些物質(zhì)可能會(huì)抑制Bacilysin向微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。貝萊斯芽胞桿菌FZB42合成的Bacilysin對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌具有拮抗活性。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽胞桿菌HD01產(chǎn)生的脂肽、抗菌蛋白和聚酮類化合物對(duì)馬鈴薯瘡痂病菌Streptomyces scabies均具有一定的抑菌效果，其中聚酮類化合物的抑制作用最強(qiáng)，能顯著下調(diào) Thaxtomin毒素的產(chǎn)毒基因（txtAB、tomA、nec1以及txtH）的表達(dá)。且該化合物對(duì) pH、溫度、紫外線、有機(jī)溶劑具有良好的穩(wěn)定性，對(duì)馬鈴薯瘡痂病的防治具有良好的應(yīng)用潛力。今后將對(duì)該化合物進(jìn)一步純化并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并通過(guò)工程菌株的構(gòu)建及單因素和響應(yīng)面法發(fā)酵條件優(yōu)化等方法提高抗菌代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，為深入探討其抗馬鈴薯瘡痂病的機(jī)制和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

貝萊斯芽胞桿菌FZB42和SQR9可以在鐵限制條件下通過(guò)分泌Bacillibactin與有害微生物競(jìng)爭(zhēng)鐵元素來(lái)保護(hù)植物免受病原菌的侵害[50]。SQR9合成的Bacillibactin與脂肽（即桿菌霉素D、豐原素和表面活性素）一起作用時(shí)，能展現(xiàn)出對(duì)尖孢鐮孢菌、茄病鐮孢菌和寄生鐮孢菌的拮抗作用，且脂肽類物質(zhì)能促進(jìn)Bacillibactin的產(chǎn)生，二者同時(shí)存在時(shí)顯示出良好的抗菌效果。然而，同時(shí)缺乏脂肽和Bacillibactin的突變菌株受到真菌病原體的挑戰(zhàn)時(shí)，突變菌株不能顯示出明顯的抗真菌效果，且在只有 Bacillibactin單獨(dú)存在（缺乏已知的脂肽或聚酮化合物）的情況下，也沒(méi)有試驗(yàn)證據(jù)證明純化的 Bacillibactin具有抗菌活性，因此這些結(jié)果表明，Bacillibactin在抑制微生物病原體中可能是通過(guò)剝奪病原微生物所必需的鐵離子來(lái)抑制其生長(zhǎng)的，而不是直接拮抗病原菌[51]。

Macrolactin是細(xì)菌肽去甲?；傅囊种苿?，已鑒定出約17種不同類型的Macrolactin。而在貝萊斯芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)了其中的4種，分別是Macrolactin-A、Macrolactin-D、7-O-malonyl-macrolactin-A和7-O-succinyl-macrolactin[52,53]。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)Macrolactin-A是解淀粉芽胞桿菌D2WM抗菊花軟腐病原菌的關(guān)鍵物質(zhì)。Chen等[45]發(fā)現(xiàn)由貝萊斯芽胞桿菌 FZB42合成的 Bacillaene對(duì)火疫病病原菌歐文氏菌Erwinia amylovora和白蟻菌（Termitomyces）表現(xiàn)出一定的抑菌效果[10]。

4.1.2 作用于植物—誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性 作為一種植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR），貝萊斯芽胞桿菌FZB42顯示的生物防治效果可能依賴于幾種生物活性次生物質(zhì)的潛在抗菌活性。然而，除Surfactin外，在植物中測(cè)定的抗真菌脂肽的濃度相對(duì)較低。此外，到目前為止，在PGPR桿菌定居的植物根部附近沒(méi)有檢測(cè)到抗菌聚酮化合物和其他生物活性化合物，因此，研究人員推測(cè)，由Surfactin、微生物揮發(fā)性有機(jī)化合物以及可能的其他迄今未被發(fā)現(xiàn)的次生物質(zhì)所引發(fā)的 ISR（Induced systemic resistance，ISR）是 PGPR抑制植物病原體的主要因素，植物通過(guò)這一過(guò)程保護(hù)自己免受有害微生物的反復(fù)攻擊[25]。Chowdhury等[54]為了研究Surfactin和聚酮類化合物在調(diào)節(jié)植物對(duì)立枯絲核菌R. solani防御反應(yīng)中的作用，用貝萊斯芽胞桿菌FZB42野生型和兩個(gè)突變株CH1（不產(chǎn)Surfactin）和CH5（不產(chǎn)脂肽和聚酮化合物）接種萵苣幼苗，使幼苗細(xì)菌化，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)分析表明，野生型FZB42-細(xì)菌化植株的植物防御素因子（Plant defensin factor, PDF）的表達(dá)上調(diào)，但在突變菌株細(xì)菌化的植株中未上調(diào)，表明脂肽類化合物和聚酮類化合物可增強(qiáng)植物的防御反應(yīng)，具有誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的作用。

4.2 防治動(dòng)物病害

一種從水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中分離的貝萊斯芽胞桿菌V4菌株對(duì)沙門氏菌氣單胞菌亞種Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida具有控制活性，可顯著減少魚的死亡率，且能促進(jìn)魚的生長(zhǎng)，具備用作水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌和抗真菌劑的潛力，其產(chǎn)生的活性代謝物主要是伊枯草素、艱難菌素和大環(huán)內(nèi)酰亞胺[55]。Hien等[12]用植物乳桿菌N11和貝萊斯芽胞桿菌H3.1的益生菌混合物作為飼料添加劑處理尼羅羅非魚時(shí)，這些益生菌能夠提高尼羅羅非魚的黏膜免疫和血清免疫功能，增強(qiáng)抗病能力。但是，增強(qiáng)魚類免疫的益生菌的活性代謝物成分及其與益生菌其他成分協(xié)同作用的機(jī)制尚不清楚。

4.3 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

Magally等[56]研究發(fā)現(xiàn) 7-O-malonyl-macrolactin-A對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和多藥耐藥細(xì)菌病原體具有抑菌作用，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬(wàn)古霉素腸球菌和洋蔥伯克霍爾德氏菌的小菌落變體。Bacillaene對(duì)多重耐藥細(xì)菌分離株也具有抗菌活性，但其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，一直沒(méi)能商品化[57]。貝萊斯芽胞桿菌FZB42合成的Bacilysin對(duì)金黃色葡萄球菌具有拮抗活性[58]。另一項(xiàng)研究表明Bacilysin對(duì)銅綠假單胞菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗細(xì)菌活性，然而，單個(gè)基因bacB的破壞或生物測(cè)定板中N-乙酰氨基葡萄糖的補(bǔ)充能消除Bacilysin的抑制作用。掃描電鏡和透射電鏡分析表明，Bacilysin是通過(guò)引發(fā)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化以及細(xì)胞內(nèi)成分的流出來(lái)抑制病原微生物的[8]，用15 mg/L的Bacilysin處理銅綠假單胞菌2 h，其細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞質(zhì)濃縮，發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象[59]。Yoo等[60]從傳統(tǒng)的韓國(guó)發(fā)酵食品中分離到的貝萊斯芽胞桿菌 K68可能具有預(yù)防由變異鏈球菌引起的齲齒的用途，該菌株通過(guò)產(chǎn)生一種糖代謝酶抑制劑脫氧野尻霉素（Deoxynojirimycin, DNJ）來(lái)抑制變異鏈球菌生物膜的形成、粘附和GTF基因的表達(dá)。

另外，Moghannem 等[61]和 Mahgoub等[62]分別報(bào)道貝萊斯芽胞桿菌 KY498625和貝萊斯芽胞桿菌MHM3能產(chǎn)生胞外多糖EPS，且EPS在非常低的濃度下具有極高的抗癌能力（MCF-7癌細(xì)胞），對(duì)健康宿主細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性作用。Meena等[13]研究表明，從一種新的貝萊斯芽胞桿菌菌株KLP2016中提取的脂肽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hep2-C顯示出高于90%的細(xì)胞毒性。此外，Rehman等[14]從貝萊斯芽胞桿菌RA5401提取的五種化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞系有抗增殖活性，有兩種通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)癌蛋白酶發(fā)揮作用，另外3種通過(guò)抑制癌細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用。

5 展望

化學(xué)合成農(nóng)藥的長(zhǎng)期不合理使用導(dǎo)致了環(huán)境中殘留化合物的積累，使致病微生物產(chǎn)生了耐藥性。醫(yī)藥的持續(xù)過(guò)度和不當(dāng)使用也使多重耐藥性病原菌株引發(fā)疾病的治療成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。貝萊斯芽胞桿菌能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，其實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景引起了廣泛的重視。一些菌株已經(jīng)在生產(chǎn)中得到了一定的應(yīng)用，其基因組和抗菌物質(zhì)等相關(guān)信息也取得了較大的研究進(jìn)展。但是，目前還存在一些亟待解決的問(wèn)題：（1）很難從貝萊斯芽胞桿菌的發(fā)酵液中提取或純化生物活性化合物，尤其是新物質(zhì)。這一方面是由于菌株生長(zhǎng)條件的次優(yōu)化、提取溶劑的選擇不當(dāng)以及新化合物獲取的難度所影響，而那些低濃度產(chǎn)物的可獲得性更加低下。另一方面，是由于對(duì)貝萊斯芽胞桿菌的有益代謝產(chǎn)物的分析方法還存在局限，盡管目前采用的分析方法，如誘變、比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等，對(duì)于表征菌株的生理生化特性和代謝通路起到了積極的作用，但對(duì)于如何產(chǎn)生和獲得新的抗生物質(zhì)還存在許多未解之謎。因此，迫切需要使用一些更行之有效的研究方法來(lái)解決上述問(wèn)題，或許多組學(xué)聯(lián)用將能進(jìn)一步挖掘貝萊斯及其同類芽胞桿菌的應(yīng)用價(jià)值，組合生物學(xué)的發(fā)展則為新物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)帶來(lái)了希望，高產(chǎn)基因工程菌株的構(gòu)建和下游提取工藝的提高是解決貝萊斯芽胞桿菌生物活性物質(zhì)產(chǎn)量較低這一瓶頸問(wèn)題的主要策略。（2）對(duì)貝萊斯芽胞桿菌的生物安全性研究較少，作為其廣泛商業(yè)化和應(yīng)用化的重要前提，翔實(shí)的安全評(píng)估數(shù)據(jù)必不可少。盡管已經(jīng)獲得了貝萊斯芽胞桿菌的全基因組序列，但目前還缺乏其產(chǎn)生的抗生物質(zhì)對(duì)靶標(biāo)生物的毒性、致病性以及對(duì)環(huán)境影響的研究。另外，與化學(xué)合成抗菌劑相比，許多微生物來(lái)源的有益抗菌劑在體外檢測(cè)時(shí)明顯不能優(yōu)于在體內(nèi)所發(fā)揮的作用。因此，對(duì)于貝萊斯芽胞桿菌及其抗生物質(zhì)的抗菌效果和應(yīng)用潛力的評(píng)估應(yīng)當(dāng)以體內(nèi)效果為準(zhǔn)。深入開展貝萊斯芽胞桿菌及其抗生物質(zhì)的體內(nèi)抗菌機(jī)理研究和應(yīng)用效果研究有助于推進(jìn)其商品化和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。