三株球孢白僵菌的分離鑒定與其對(duì)粘蟲的室內(nèi)毒力

程 茵，鄭吉陽，王 敦

（西北農(nóng)林科技大學(xué)昆蟲學(xué)研究所，楊凌 712100）

粘蟲Mythimna separate(Walker)又名剃枝蟲，屬于鱗翅目，夜蛾科，因其遷飛性、暴食性、群聚性等特點(diǎn)[1]，成為糧食作物的毀滅性害蟲。粘蟲在世界范圍內(nèi)分布廣泛，除了我國以外，印度、孟加拉國、日本、澳大利亞和新西蘭等國家也都經(jīng)歷過由粘蟲危害導(dǎo)致的嚴(yán)重作物損失，早在 20世紀(jì) 50 年代粘蟲就被列為我國農(nóng)業(yè)發(fā)展中的重大害蟲之一[2,3]。蟲害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，會(huì)在短時(shí)間內(nèi)吃光葉片，只剩下葉脈，造成玉米的嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收[4,5]，其可以取食的植物類型多達(dá)14個(gè)科，300多種，特別喜歡取食禾本科植物，例如玉米和水稻等作物[6,7]。在我國，除新疆外全國各地均有粘蟲發(fā)生，間歇猖獗為害、且屬于遷飛性害蟲[8-10]，歷史上粘蟲災(zāi)害曾多次暴發(fā)，其為害面積廣，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11]。目前，粘蟲主要依靠化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，在防治過程中，由于大量使用有機(jī)氯、有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類殺蟲劑，使粘蟲產(chǎn)生了較嚴(yán)重的抗藥性，化學(xué)防治難以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的效果[12]，另外，在化學(xué)防治過程中，濫用、過度使用農(nóng)藥，也造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，危害了人畜健康。因此，探尋高效、環(huán)保的生物防治資源是生產(chǎn)上的迫切需求。

球孢白僵菌Beauveria bassiana是最早發(fā)現(xiàn)的蟲生真菌，在自然界分布廣，寄主多，對(duì)很多農(nóng)林害蟲致病力強(qiáng)，可侵染15目149科的700余種昆蟲和6科的10多種蜱螨類害蟲[13-15]。目前，白僵菌已成功應(yīng)用于大面積防治農(nóng)林業(yè)害蟲，例如亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis[16]、思茅松毛蟲Dendrolimus kikuchii[17]等，不同學(xué)者篩選出了對(duì)多種害蟲具有較高致病力的優(yōu)良菌株，顯示出該菌具有極好的生物防治潛力和應(yīng)用價(jià)值[18]。盡管近些年利用微生物防治害蟲已經(jīng)成為一種重要的生物防治手段，但利用生防真菌防治粘蟲的研究報(bào)道相對(duì)較少，特別是缺乏高毒力的菌株資源。如利用綠僵菌制劑對(duì)草坪禾草上的粘蟲進(jìn)行田間防治，具有一定的防治效果，但殺蟲速度較慢[19]。也有學(xué)者從8株球孢白僵菌菌株中篩選出了一株對(duì)粘蟲具有高毒力的菌株Bb314，其對(duì)粘蟲3齡幼蟲致死率最高才達(dá)69%[20]。因此，迫切需要尋找并篩選出防治粘蟲的高效菌株。本研究報(bào)道了從土壤中分離得到的3株新的球孢白僵菌及其對(duì)3齡粘蟲的室內(nèi)毒力，旨在為粘蟲的生物防治提供新的殺蟲微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：三株供試菌株M-G3，M-G4，Z-G2-5是從土壤中分離得到的。土壤具體采集點(diǎn)位置信息見表1，試驗(yàn)前，將菌株接種于1/4 SDAY平板培養(yǎng)基上，在（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～15 d，獲得分生孢子用于毒力測(cè)定試驗(yàn)[21]。

表1 供試菌株的土壤來源Table 1 The soil origin of tested strains

供試蟲源：粘蟲3齡幼蟲，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院害蟲防治實(shí)驗(yàn)室提供。挑選剛蛻完皮、大小均勻的3齡幼蟲用于生測(cè)。

培養(yǎng)基：半選擇培養(yǎng)基（Semi-selective agar medium）：10 g/L 蛋白胨，40 g/L 葡萄糖，10 g/L 酵母提取物，20 g/L 瓊脂，0.6 g/L CTAB，0.3 g/L四環(huán)素，0.3 g/L卡那霉素；薩氏培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose agar with yeast extract，SDAY）：10 g/L 蛋白胨，40 g/L 葡萄糖，10 g/L 酵母提取物，20 g/L 瓊脂，0.3 g/L四環(huán)素，0.3 g/L卡那霉素。

1.2 菌株的分離

土壤中真菌分離用的是黃粉蟲蟲餌法[22]，將采集的新鮮土樣，倒在干凈的報(bào)紙上，攤成薄層，放于室內(nèi)避免陽光直射的陰涼通風(fēng)處自行風(fēng)干，24 h后收回。每個(gè)土樣大約取180 g裝到250 mL滅菌玻璃組培瓶中，適當(dāng)噴水。每個(gè)組培瓶中放10只6齡或7齡（1.2～1.8 cm）的健康黃粉蟲幼蟲使之與土壤充分接觸，置于（25±2）℃，RH 70%±5%，光周期12L:12D的人工物候培養(yǎng)箱中。每天適當(dāng)噴水保濕并上下倒置至少3次，試驗(yàn)期間不飼喂任何食物。每天觀察黃粉蟲情況，及時(shí)將土壤中被感染的僵蟲取出置于無菌24孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)保濕培養(yǎng)。待僵蟲體表形成分生孢子后，挑取蟲體表面分生孢子和消毒后的蟲體組織接種于半選擇培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待真菌長(zhǎng)出，將單個(gè)菌落上的分生孢子轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基平板，直至無雜菌，即可得到純菌種。

1.3 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

在超凈工作臺(tái)中，用接種針將分離純化得到的菌株點(diǎn)植到滅菌的1/4 SDAY培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約14 d后取出觀察菌落形態(tài)特征。此外配制分生孢子懸液，吸取10 μL至蓋玻片上，待水分蒸發(fā)殆盡，在電子顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)大小。

1.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將分離獲得的昆蟲病原真菌純培養(yǎng)物在SDAY培養(yǎng)基上均勻涂布，置于培養(yǎng)箱（25±2）℃，RH 70%±5%，光周期12L:12D中培養(yǎng)14 d后，待菌絲長(zhǎng)出。參照Abolfazl[23]的方法提取真菌DNA，以菌株基因組DNA為模板，采用不同的引物分別擴(kuò)增菌株的ITS、β-tubulin和Bloc基因片段，其中引物區(qū)域和序列情況見表2[24-26]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生物公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過blast進(jìn)行比對(duì)，得到與目的菌株具有同源性的多個(gè)菌株的相應(yīng)序列，從中下載同源性較高的序列，使用MEGA 7.0軟件，通過鄰接法（Neighbor-Joining method，NJ），運(yùn)行1000次bootstrap 驗(yàn)證，因3個(gè)菌株P(guān)CR擴(kuò)增時(shí)所用引物和擴(kuò)增基因不同，3個(gè)菌株分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析[27]。

表2 PCR擴(kuò)增常用引物Table 2 The primers used to amplify different regions of rDNA inB. bassiana

1.5 孢子懸浮液配制

參照何學(xué)友[28]和吳志鵬[29]的操作方法，稍作改進(jìn)，在1/4 SDY培養(yǎng)基上均勻涂布孢子菌液，置于（25±2）℃，RH 70%±5%，光周期12L:12D的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約14 d后，從菌株的菌落表面獲得分生孢子，用0.03%吐溫-80溶液配制孢子懸浮液，同時(shí)稀釋5個(gè)濃度梯度，用于接種試驗(yàn)。以0.03%吐溫-80的無菌水為空白對(duì)照組。

1.6 毒力測(cè)定

挑選蟲態(tài)一致的健康的3齡粘蟲幼蟲單只放置于24孔昆蟲飼養(yǎng)盒中，每飼養(yǎng)盒放置24頭作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)濃度處理3個(gè)重復(fù)，即每個(gè)濃度處理72頭幼蟲。參照Vandenberg[30]噴霧法，將不同濃度的孢子懸浮液裝入不同的噴瓶中，依次粘蟲處理，確保每頭粘蟲身上沾上孢子懸浮液，等藥液蒸發(fā)殆盡或蟲體沾粉穩(wěn)固后，將試蟲一一放入養(yǎng)蟲盒并置于室內(nèi)自然室溫下，對(duì)照組采用 0.03%吐溫-80的無菌水溶液。養(yǎng)蟲盒內(nèi)使用無菌水潤濕的濾紙保濕。每2 d更換1次新鮮的野小麥葉子，每天記錄處理幼蟲的存活與死亡情況，統(tǒng)計(jì)死亡率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

參照鄧嘉茹等[31]方法，根據(jù)統(tǒng)計(jì)的死亡數(shù)，用SPSS軟件計(jì)算各處理的死亡率、校正死亡率。死亡率＝（處理總數(shù)－存活數(shù)）/ 處理總數(shù)×100%；累計(jì)校正死亡率＝（處理組累計(jì)死亡率－對(duì)照組累計(jì)死亡率）/（1－對(duì)照組累計(jì)死亡率）×100% ；以孢子懸浮液濃度（孢子/mL）的對(duì)數(shù)值為X，死亡率的機(jī)率值Y，按機(jī)率值分析法計(jì)算毒力回歸方程式及致死濃度LC50、LC90。根據(jù)各濃度下侵染天數(shù)和處理1 d開始的累計(jì)死亡率的機(jī)率值，計(jì)算回歸方程和致死中時(shí)間LT50。使用Graphpad Prism 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株M-G3、M-G4和Z-G2-5在1/4 SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后形態(tài)如圖1所示，菌落直徑均在25～30 mm。其中M-G3和Z-G2-5菌落正面均為白色，絨毛狀，菌落背面淡黃色，M-G4菌落正面為淡黃色，呈粉狀，菌落背面為橙黃色。對(duì)分離純化培養(yǎng)的菌株孢子形態(tài)在掃描電鏡下進(jìn)行觀察，由圖1（G、H、I）可以看到3株菌株的分生孢子透明、光滑，球形或近球形，直徑在1.5～2.5 μm。

圖1 三株菌株的形態(tài)特征Fig. 1 The morphological characteristics of three strains

使用PCR擴(kuò)增菌株Z-G2-5的rDNA-Bloc序列片段，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增片段為1450 bp；使用PCR擴(kuò)增菌株M-G4的rDNA-β-tubulin序列片段，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增片段為641 bp；使用PCR擴(kuò)增菌株M-G3的rDNA-ITS序列片段，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增片段為542 bp。使用以上序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)3株菌株的序列與已報(bào)道的多個(gè)球孢白僵菌菌株對(duì)應(yīng)序列的相似性均達(dá)到99%及以上。將得到的序列片段分別提交到GenBank中，獲得登錄號(hào)分別為MW193766、MW200160和MW192804。

選取相關(guān)序列，使用MEGA 7.0將其在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)得到的序列下載構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，因3株菌株選用了不同的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段不同，故三株菌分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（圖2～4）。由圖2可知菌株Z-G2-5與B. bassianaRCEF1491（JQ867109.1）處于進(jìn)化樹最小分支，親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)100%；由圖3可知菌株M-G4與B. bassianaZJ（EF025912.1）處于進(jìn)化樹最小分支，親緣關(guān)系最近，同源性最高；由圖4可知菌株M-G3與B. bassianaBJZF-07（MG345084.1）等多個(gè)球孢白僵菌菌株處于同一分支，親緣關(guān)系最近，同源性最高。再結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定以上3株菌均為球孢白僵菌，編號(hào)依次為Z-G2-5、M-G4、M-G3。

圖2 基于Bloc基因序列構(gòu)建目的菌株與其他球孢白僵菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ法）Fig. 2 Construction of phylogenetic tree of the isolated strain and other relatedB. bassianastrains based on Bloc region sequence(Neighbour-Joining method)

圖3 基于β-tubulin序列構(gòu)建目的菌株與其他球孢白僵菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ法）Fig. 3 Construction of phylogenetic tree of the isolated strain and other relatedB. bassianastrains based onβ-tubulin region sequence(Neighbour-Joining method)

圖4 基于ITS序列構(gòu)建目的菌株與其他球孢白僵菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ法）Fig. 4 Construction of phylogenetic tree of the isolated strain and other relatedB. bassianastrains based on ITS region sequence(Neighbour-Joining method)

2.2 三株球孢白僵菌侵染的粘蟲幼蟲癥狀

在感染初期，幼蟲取食行為、蟲體外部形態(tài)與健康幼蟲無差別。接種2 d后，幼蟲取食明顯減少或停止取食，部分幼蟲死亡。在侵染5～8 d后，被感染死亡的粘蟲幼蟲呈僵蟲狀，并長(zhǎng)滿白色菌絲。試驗(yàn)結(jié)果表明：供試的3株球孢白僵菌菌株皆能侵染粘蟲幼蟲，并隨著菌液濃度的升高，殺蟲效果顯著提高，致死時(shí)間縮短。

2.3 不同球孢白僵菌菌株對(duì)粘蟲幼蟲的累計(jì)校正死亡率

不同孢子濃度下3株球孢白僵菌對(duì)3齡粘蟲幼蟲的致死率變化如圖5所示。由圖5A可知，在孢子濃度為 5×109個(gè)孢子/mL時(shí)，三株菌株在感染第 5～6 d，粘蟲幼蟲的累計(jì)校正死亡率達(dá)到最大值，均接近100%，之后死亡率不再變化。由圖5B可知，在孢子濃度為5×108個(gè)孢子/mL時(shí)，菌株Z-G2-5對(duì)粘蟲幼蟲的致死率明顯高于其他兩株菌，在感染第6 d時(shí)對(duì)粘蟲的致死率達(dá)到最大，累計(jì)校正死亡率為96.77%，而菌株M-G3、M-G4累計(jì)校正死亡率分別為66.67%、71.11%。在孢子濃度為5×107個(gè)孢子/mL時(shí)，明顯能看出菌株Z-G2-5對(duì)粘蟲的毒力作用明顯高于其他兩株菌，在第7 d時(shí)，對(duì)粘蟲幼蟲的致死率為78.57%（圖5C）。在圖5D、E中，3菌株對(duì)粘蟲幼蟲的致死率上升速率相比其他濃度較為緩慢，仍然是菌株Z-G2-5致病力更強(qiáng)。由此可以得出，菌株Z-G2-5相比其他兩菌株對(duì)粘蟲有更強(qiáng)的致病性。菌株Z-G2-5在不同濃度下感染粘蟲幼蟲的校正死亡率見圖6。

圖5 不同濃度下3株球孢白僵菌感染粘蟲幼蟲的校正死亡率Fig. 5 The corrected mortality of larvaeM. separatainfected by three strains ofB. bassianain different concentrations

圖6 菌株Z-G2-5在不同濃度下感染粘蟲幼蟲的校正死亡率Fig. 6 The corrected mortality of larvaeM. separatainfected by Z-G2-5 strains ofB. bassianain different concentrations

2.4 不同球孢白僵菌菌株對(duì)粘蟲幼蟲的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)

由表3、4得知，隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，3株球孢白僵菌對(duì)粘蟲幼蟲的LC50和LC90遞減，在接種后3 d，菌株M-G3、M-G4、Z-G2-5對(duì)粘蟲的LC50分別為8.46×108、1.33×108、5.65×107個(gè)孢子/mL；在接種6 d后，LC50分別為1.18×108、1.13×107、4.95×106個(gè)孢子/mL。結(jié)果表明，菌株Z-G2-5對(duì)3齡幼蟲致死濃度最低，其次是菌株M-G4、M-G3。

表3 球孢白僵菌對(duì)粘蟲幼蟲的劑量效應(yīng)（3 d）Table 3 Toxicity ofB. bassianato larvae ofM. separata(3 d)

表4 球孢白僵菌對(duì)粘蟲幼蟲的劑量效應(yīng)（6 d）Table 4 Toxicity ofB. bassianato larvae ofM. separata(6 d)

由表5得知，隨著孢子濃度的增加，對(duì)粘蟲幼蟲的LT50遞減，在5×105～5×109個(gè)孢子/mL濃度，菌株Z-G2-5對(duì)3齡幼蟲的LT50由6.83 d降至2.23 d。菌株M-G4在5×106～5×109個(gè)孢子/mL濃度，LT50由4.56 d降至1.90 d，在5×105個(gè)孢子/mL濃度時(shí)，幼蟲的死亡率在40%左右，低于50%。菌株M-G3在5×107～5×109個(gè)孢子/mL濃度，LT50由7.82 d降至1.77 d，在孢子濃度低于5×107個(gè)孢子/mL時(shí)，幼蟲的死亡率不到30%，亦低于50%，因此無法計(jì)算LT50。綜上所述，3株球孢白僵菌中以Z-G2-5對(duì)粘蟲幼蟲的毒力最強(qiáng)，M-G4和M-G3次之。

表5 球孢白僵菌對(duì)粘蟲幼蟲的時(shí)間效應(yīng)Table 5 Lethal time ofB. bassianato larvae ofM. separata

3 討論

我國土壤資源豐富，其中含有的真菌種類也多種多樣，可以從中分離多種昆蟲病原真菌，為害蟲防治提供生防資源。本研究從河北采集的土樣中分離出了3株昆蟲病原真菌，根據(jù)該菌株培養(yǎng)形態(tài)特征及序列比對(duì)分析，3株菌均鑒定為球孢白僵菌，且對(duì)3齡粘蟲幼蟲均有防治效果。由統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可得，菌株Z-G2-5比菌株M-G3、M-G4對(duì)粘蟲的致病力更強(qiáng)，致死速度更快。在5×106個(gè)孢子/mL的懸浮液濃度下，對(duì)粘蟲的最大死亡率達(dá)到75%，LC50為4.95×106個(gè)孢子/mL，而張琛等[20]研究篩選出一株對(duì)粘蟲3齡幼蟲高毒力的球孢白僵菌菌株Bb314，在1×107個(gè)孢子/mL濃度下致死率最高為 69%；莊寶龍等[32]從感病致死的暗黑鰓金龜Holotrichia parallelaMotschulsky幼蟲蟲體中獲得一株球孢白僵菌，并測(cè)定了其對(duì)粘蟲 2齡和 5齡幼蟲的致病力，結(jié)果在 2.5×109個(gè)孢子/mL濃度下，對(duì) 2齡、5齡幼蟲的最高死亡率分別為42.35%和54.76%，由此可見本研究中的菌株Z-G2-5對(duì)粘蟲的致死率更高。Mandira[33]研究發(fā)現(xiàn)棒束孢屬的真菌對(duì)粘蟲的毒力遠(yuǎn)高于白僵菌和綠僵菌，其中毒力最強(qiáng)的兩株棒束孢屬分離株，其 LC50分別為1.24×106和 1.71×106個(gè)孢子/mL，與菌株 Z-G2-5毒力相當(dāng)。綜上表明本研究中的菌株Z-G2-5對(duì)粘蟲具有較強(qiáng)的致病力，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

球孢白僵菌雖然作為目前應(yīng)用最廣泛的殺蟲真菌，但在生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問題，例如菌株防治效果不穩(wěn)定，殺蟲活性緩慢等，究其主要原因在于真菌孢子萌發(fā)需要特定的條件，如溫度和濕度，其在農(nóng)業(yè)害蟲生物防治中的應(yīng)用也主要是受到高溫、低濕度等環(huán)境因素的制約。McClatchie等[34]研究表明，在適宜的溫度范圍內(nèi)，白僵菌菌株的產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、生長(zhǎng)速率等各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)會(huì)隨著溫度的升高而增大，但溫度過低或溫度過高，球孢白僵菌的分生孢子萌發(fā)及生長(zhǎng)會(huì)受到明顯抑制。盡管已經(jīng)證明有些菌株能夠在更高的溫度下生長(zhǎng)，但活性會(huì)降低[35,36]，Alali等[37]為了克服這些環(huán)境因素對(duì)球孢白僵菌的限制，并且考慮到全球在逐漸變暖的情況，在敘利亞溫暖地區(qū)采集土壤樣本和感染昆蟲分離出耐熱的球孢白僵菌分離株，為地中海和亞熱帶等高溫地區(qū)農(nóng)業(yè)害蟲防治提供了有效的防治資源。Hegedus和 Khachatourians[38]研究表明在相對(duì)濕度為 95%～100%時(shí)，球孢白僵菌的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)最好，萌發(fā)率、萌發(fā)速度均與相對(duì)濕度呈正相關(guān)。因此在多雨季節(jié)、環(huán)境濕度大、溫度適宜的時(shí)期，使用球孢白僵菌有很好的殺蟲效果。

有研究證明球孢白僵菌菌株具有異核現(xiàn)象（指不同基因型的細(xì)胞核存在于同一細(xì)胞內(nèi)或菌絲體內(nèi)），且球孢白僵菌異核體在繼代培養(yǎng)中極不穩(wěn)定，在人工培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)過程中易存在變異和退化的可能，具有遺傳不穩(wěn)定性[39]，因此從菌株的分離到制成菌劑保持其毒力并在自然環(huán)境條件下進(jìn)行大規(guī)模防治，仍然會(huì)面臨諸多困難。本試驗(yàn)中球孢白僵菌菌株 Z-G2-5對(duì)粘蟲幼蟲雖然具有較強(qiáng)的致病力，但僅限于室內(nèi)的毒力測(cè)定，其田間防治效果仍不確定，且本研究?jī)H測(cè)定了菌株對(duì)3齡粘蟲幼蟲的毒力大小，對(duì)于其他蟲態(tài)的致死效果還未知，后續(xù)我們將繼續(xù)探討菌株對(duì)其他齡期幼蟲的毒力大小、球孢白僵菌液固雙相發(fā)酵條件優(yōu)化[40]、繼代培養(yǎng)以及其田間防治效果等一系列問題，以盡快將新的菌株轉(zhuǎn)化為微生物殺蟲劑，應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。