5個(gè)肝豆?fàn)詈俗冃约蚁档呐R床特征及基因突變分析

程齊齊 楊麗霞 王亮 孫俊 梁佳圓 葛善飛

肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticular degeneration ，HLD)，又名Wilson’s 病(WD)，是一種常染色體隱性遺傳病，其發(fā)病率為1/30 000～1/100 000[1]。ATP7B基因內(nèi)的致病性突變是WD發(fā)病的主要原因，該突變?cè)阢~代謝中起著關(guān)鍵作用，可以直接導(dǎo)致銅的排泄障礙，過(guò)量的銅蓄積在肝、大腦及角膜等器官沉積，從而導(dǎo)致相應(yīng)的病理表現(xiàn)[2]。目前發(fā)現(xiàn)的ATP7B基因突變類型已超過(guò)800種，不同突變可能對(duì)ATP7B功能有著不同的影響，且突變的種類和頻率與種族、地區(qū)分布有著顯著關(guān)系[4]，但突變與疾病的臨床表現(xiàn)、疾病發(fā)作時(shí)間以及嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性尚未明確[3-4]。本研究通過(guò)收集5個(gè)WD家系的ATP7B基因進(jìn)行測(cè)序，分析其突變特征及其臨床特征，并進(jìn)一步探討ATP7B基因突變與WD發(fā)病的關(guān)系，為肝豆?fàn)詈俗冃缘募皶r(shí)診斷、早期干預(yù)治療及家系遺傳診斷提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集5例經(jīng)江西省南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的WD患者以及患者父母和同胞。患者均為漢族，否認(rèn)近親結(jié)婚家族史。

二、診斷和排除標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)第八屆WD疾病國(guó)際會(huì)議上提出的診斷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]：①角膜K-F環(huán)，錐體外系癥狀，血清銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin, CP) <0.1 g/L，24 h尿銅>100 μg或尿銅正常者青霉胺激發(fā)試驗(yàn)?zāi)蜚~> 5倍診斷標(biāo)準(zhǔn)；以上4項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性分別計(jì)算2分。②Coombs陰性溶血性貧血，24 h尿銅40～ 100 μg，肝臟組織銅染色陽(yáng)性，血清銅藍(lán)蛋白0.1～0.2 g/L；以上4項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性分別計(jì)1分，ATP7B基因外顯子測(cè)序檢出純合突變或復(fù)合雜合突變計(jì)4分，單一位點(diǎn)雜合突變計(jì)1分。總分>4分即可診斷為肝豆?fàn)詈俗冃?。排除自身免疫性肝炎、病毒性肝炎等引起的肝功能異常者，排除外傷及其他原因的引起的神?jīng)精神異常者。

三、研究方法

(一) DNA提取 采集患者及其父母、同胞的靜脈抗凝血5 mL，用芮寶生物的全血基因組DNA提取試劑盒抽提患者及其父母和同胞基因組DNA，DNA 濃度大于20 ng/μL。。

(二)PCR擴(kuò)增 對(duì)WD患者的ATP7B基因所有外顯子進(jìn)行PCR，引物序列同F(xiàn)erenci[6]一致，由美國(guó)Life Technologies (美國(guó)Invitrogen 公司)合成。由ABI 9700 PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包括基因組DNA 2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各1 μL，以及1U Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、65～57℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，冷卻至4℃。

(三) DNA測(cè)序 PCR產(chǎn)物純化回收后在ABI 3500XL基因分析儀上對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Ensembl基因數(shù)據(jù)庫(kù)中ATP7B(ENSTO0000242839 )基因標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)。

(四) 臨床資料 收集先證者發(fā)病年齡、臨床癥狀、角膜K-F環(huán)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( ALT) 、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( AST) 、總膽紅素( TBil) 、間接膽紅素(DBil)、總蛋白(TP)、白蛋白( Alb) 、凝血酶原時(shí)間( PT) 、凝血酶原活動(dòng)度(PTA)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)( WBC) 、血紅蛋白( Hb) 、血小板計(jì)數(shù)( PLT) 、血肌酐(Cr)、血清銅藍(lán)蛋白( CER) 、24 h 尿銅、血銅等資料。所有患者隨訪至2021年1月，觀察患者生存情況。

結(jié) 果

一、臨床特征、治療及轉(zhuǎn)歸

5個(gè)家系中，先證者均為女性，發(fā)病年齡6～14歲，除D家系外，其他4個(gè)家系先證者均存角膜K-F環(huán)及血清銅藍(lán)蛋白降低。A、B家系先證者表現(xiàn)為乏力、納差，入院后查膽紅素高，CT提示肝硬化，診斷為WD(肝型)、肝衰竭，予以青霉胺驅(qū)銅、人工肝等治療后好轉(zhuǎn)出院。其中A家系同胞體檢后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高確診為WD，予以青霉胺治療，隨訪中未出現(xiàn)病情進(jìn)展。C、D家系先證者均以轉(zhuǎn)氨酶升高入院，均診斷為WD(肝型)，予以青霉胺治療后出院。但C家系先證者出院后半年內(nèi)病情迅速進(jìn)展，出現(xiàn)肝衰竭，經(jīng)人工肝治療后病情仍進(jìn)展，家屬?zèng)Q定放棄治療自動(dòng)出院。E家系先證者以血小板減少入院，入院后查CT提示肝硬化，MRI表現(xiàn)為豆?fàn)詈思拔矤詈藢?duì)稱性異常信號(hào)，診斷為WD(肝型)，予以青霉胺治療后出院，隨訪中未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。見(jiàn)表1。

表1 5例WD患者臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查

二、ATP7B基因檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)5個(gè)WD先證者及其家系成員進(jìn)行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)7種致病性基因突變，包括5種錯(cuò)義突變(c.2333G>T ，p. R778L；c.2975C>T ，p. P992L；c.2755C>G ，p. R919G；c.1846C>T ，p. R616W；c.3207C>A ，p.H1069Q)，1種無(wú)義突變(c.1531C>T，p.Q511X)和1種插入突變(c.3087_3088insT ，p. G1030Wfs*39)，其中插入突變(c.3087_3088insT ，p. G1030Wfs*39)未見(jiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)的突變(圖1)。此外還檢測(cè)到10種單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)： c.1216T>G、c.1366G>C、c.2310C>G 、c.2495A>G 、c.2855G>A 、c.3419T>C 、c.3889G>A 、c.-119_-118insCGCCG、c.-75C>A、c.3903+6C>T。見(jiàn)表2。

圖1 7種致病性ATP7B基因突變測(cè)序圖(箭頭示突變位置)

表2 5個(gè)WD家系的ATP7B基因突變類型

(續(xù)表)

三、家系遺傳學(xué)特征

5個(gè)先證者的ATP7B基因突變均為復(fù)合雜合突變，其父母均為單一致病突變基因(雜合)攜帶者(圖2)。A家系同胞體檢發(fā)現(xiàn)肝功能異常，無(wú)臨床癥狀，通過(guò)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其ATP7B中存在R778L、P992L兩種突變，分別遺傳自父親和母親，診斷為癥狀前WD，予以青霉胺治療，病情未出現(xiàn)進(jìn)展；D家系同胞ATP7B基因檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)致病性突變；E家系同胞ATP7B中存在Q511X(雜合)一種突變，遺傳自父親，無(wú)臨床癥狀，不足以診斷為WD。

圖2 5個(gè)WD家系的遺傳系譜圖

討 論

WD是一種常染色體單基因遺傳的銅代謝障礙性疾病，也是可治療的單基因疾病[7]。WD患者多以肝臟受累或神經(jīng)精神系統(tǒng)癥狀起病，該病常累及多個(gè)器官系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)多樣，疾病嚴(yán)重程度不一[8]。臨床上WD 療效與開始治療的時(shí)間密切相關(guān)，所以早期診斷與及時(shí)針對(duì)性治療對(duì)WD 患者尤為重要[9]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，ATP7B基因突變檢測(cè)，有助于WD早期診斷，及時(shí)治療，改善患者預(yù)后。

目前，已報(bào)道的ATP7B基因突變超過(guò)800種，以錯(cuò)義或無(wú)義突變最為常見(jiàn)，其次是小片段的插入、缺失和剪切位點(diǎn)突變[10]。本研究共檢測(cè)出7種致病性突變，其中Q511X為無(wú)義突變，G1030Wfs*39為插入突變，R778L、P992L、R919G、R616W、H1069Q均為錯(cuò)義突變，其中以R778L突變頻率最高。而插入突變G1030Wfs*39未見(jiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道，為新發(fā)突變。該變異的攜帶者臨床確診WD，全外顯子檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)除R919G和G1030Wfs*39以外的病理性突變位點(diǎn)，且在其下游有類似變異c.3147delC(p.T1050Hfs*71)為數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道的致病性突變[11-12]。此外，通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)(Mutation Taster)c.3087_3088ins插入突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前終止于突變后的第39位氨基酸，可能為致病突變，根據(jù)ACMG和AMP聯(lián)合共識(shí)建議[13]判斷其為致病性突變。此外還檢測(cè)出10種ATP7B基因多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)遺傳病基因易感性、人群遷徙等研究具有一定的價(jià)值，且應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性單倍型連鎖分析可獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果[2]。然而有文獻(xiàn)報(bào)道，c.1216T>G、c.1366G>C、c.2495A>G、c.2855G>A等單核苷酸多態(tài)性的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)率較低，雖然未從根本上影響ATP7B的功能，但由于個(gè)體和環(huán)境差異的存在，臨床上極少部分單核苷酸多態(tài)性攜帶者仍會(huì)出現(xiàn)明顯的癥狀[14]。

WD臨床表現(xiàn)有很強(qiáng)的異質(zhì)性，其基因型與表型的關(guān)系也一直是研究的熱點(diǎn)，有文獻(xiàn)報(bào)道，R778L、P992L突變往往預(yù)示者較早的發(fā)病年齡及更嚴(yán)重的肝臟損害[15-16]。本研究中的A、B家系先證者均為R778L、P992L復(fù)合突變致病，發(fā)病年齡早，在就診時(shí)均已發(fā)展為肝衰竭，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。C家系先證者雖以轉(zhuǎn)氨酶升高為首發(fā)表現(xiàn)，但在后續(xù)的隨訪中，該患者病情進(jìn)展快，半年內(nèi)出現(xiàn)肝衰竭，其ATP7B基因突變中存在插入突變，而插入突變可導(dǎo)致讀碼框移，使基因表達(dá)提前終止，產(chǎn)物截?cái)啵δ軉适?，致使患者早期發(fā)病，肝臟病變嚴(yán)重[17]。D家系先證者雖發(fā)病早，但診斷、治療及時(shí)，未出現(xiàn)明顯臨床癥狀。E家系先證者雖未出現(xiàn)明顯神經(jīng)精神系統(tǒng)癥狀，但其顱腦磁共振已發(fā)現(xiàn)了異常，而H1069Q突變與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[18]。此外，肝豆?fàn)詈俗冃缘谋硇瓦€可能受修飾基因、表觀遺傳學(xué)、膳食銅攝入量、銅應(yīng)激處理能力和金屬硫蛋白誘導(dǎo)性的影響[19]。雖大部分研究認(rèn)為，基因型與表型存在一定的相關(guān)性，但也有文獻(xiàn)報(bào)道，ATP7B基因突變與個(gè)體臨床表型無(wú)明顯相關(guān)性[20]。因此，基因型與表型的關(guān)系仍有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的ATP7B致病突變(G1030Wfs*39)，探討了基因型與表型的關(guān)系。但本研究未能深入探討ATP7B新突變的致病機(jī)制而存在一些不足。因此，在今后的工作中會(huì)進(jìn)一步明確各個(gè)突變的真實(shí)致病性及致病機(jī)制，進(jìn)而在此基礎(chǔ)上采取針對(duì)性的治療，以提高臨床療效。