木薯鋅指轉(zhuǎn)錄因子MeDi19-1基因克隆及表達(dá)分析

戴晶 顏彥 楊海 胡偉

摘要：【目的】克隆木薯鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因MeDi19-1，分析其編碼蛋白特征、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活活性及在木薯不同組織中的表達(dá)水平，為探究MeDi19-1基因在木薯中的作用機(jī)制提供理論參考?！痉椒ā繌哪臼鞬U50擴(kuò)增MeDi19-1基因編碼區(qū)（CDS）序列，利用生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行預(yù)測分析，并構(gòu)建pNC-Green-SubC-MeDi19-1融合表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染煙草表皮細(xì)胞，觀察熒光信號以確定蛋白的亞細(xì)胞定位情況。利用酵母系統(tǒng)確定其轉(zhuǎn)錄激活活性，并基于木薯不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其組織表達(dá)特性?！窘Y(jié)果】MeDi19-1基因CDS序列（OL620080）長度為618 bp，共編碼205個氨基酸殘基，蛋白分子量為22416.79 Da，理論等電點（pI）為6.10，屬于不穩(wěn)定疏水蛋白，含有Di19蛋白家族典型的鋅指結(jié)構(gòu)域zf-Di19。MeDi19-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)中含有無規(guī)則卷曲（53.66%）、α-螺旋（40.49%）、延伸鏈（4.39%）和β-轉(zhuǎn)角（1.46%）。MeDi19-1蛋白氨基酸序列與橡膠樹（Hevea brasiliensis）Di19蛋白氨基酸序列（XP_021655585.1）相似性最高，為83.50%。MeDi19-1基因啟動子元件含有脫落酸（ABA）、赤霉素和茉莉酸等激素響應(yīng)元件及脅迫響應(yīng)元件和光響應(yīng)元件。MeDi19-1蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，具有轉(zhuǎn)錄激活活性，且活性區(qū)域在C端。MeDi19-1基因在葉、葉中脈和儲藏根中相對表達(dá)量較高。【結(jié)論】MeDi19-1基因?qū)儆贒i19基因家族成員，具有組織表達(dá)特異性，主要在葉、葉中脈和儲藏根中發(fā)揮調(diào)控作用，其編碼蛋白在木薯組織中作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)多項生理活動。

關(guān)鍵詞： 木薯;鋅指轉(zhuǎn)錄因子;基因克隆;轉(zhuǎn)錄激活;表達(dá)分析

中圖分類號： S533.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）01-0115-10

Cloning and expression analysis of zinc-finger transcription factor MeDi19-1 gene in cassava

DAI Jing1，2， YAN Yan1， YANG Hai2*， HU Wei1*

（1Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Haikou? 571101， China; 2College of Life Science and Technology， Huazhong University of Science and Technology，

Wuhan? 430074， China）

Abstract：【Objective】 In this study，a zinc finger transcription factor MeDi19-1 was cloned from cassava. Its coding protein characteristics，subcellular localization，transcriptional activation activity and expression levels in different tissues of cassava were analyzed. This research laid a foundation for further exploration of the function and mechanism of MeDi19-1 in cassava. 【Method】The coding region sequence （CDS） of MeDi19-1 gene was amplified from cDNA of cassava KU50.The bioinformatics analysis predicted the physicochemical properties.The pNC-Green-SubC-MeDi19-1 fusion expression vector was also constructed. By Agrobacterium-mediated transfection of tobacco epidermal cells， and the fluorescence signal was observed to determine the protein subcellular localization.The yeast system was used to determine its transcriptional activation activity， and its tissue expression properties were analyzed based on transcriptomic data from different tissues in cassava. 【Result】The CDS of MeDi19-1 gene（OL620080） was 618 bp in length and encoded 205 amino acids with molecular weight of 22416.79 Da and theoretical isoelectric point （pI） of 6.10. MeDi19-1 protein belonged to an unstable hydrophobin and contained the zinc finger domainzf-Di19 which was typical in Di19 protein family. The se-condary structure of the MeDi19-1 protein contained irregularly coils（53.66%），α-helix（40.49%）， extended chain （4.39%） and β-turn（1.46%）. The amino acid sequence of MeDi19-1 protein had the highest? similarity（83.50%） to the amino acid sequence of Hevea brasiliensis Di19-6 protein（XP_021655585.1）. The promoter of MeDi19-1 contained the cis-acting element involved in the response to abscisic acid （ABA），gibberellin，jasmonic acid，stress? response element and light response element. MeDi19-1 protein was located in nucleus and cytomembrane. MeDi19-1 protein had transcriptional activation activity，and its active region was at the C-terminus. MeDi19-1 showed high expression levels in leaf，mid-veins and storage root. 【Conclusion】The MeDi19-1 gene is a member of the Di19 gene family， has tissue expression specificity and may play a regulatory role in leaves， mid-veins and storage roots， and its encoded protein is involved in the regulation of multiple physiological activities as transcription factors in cassava tissues.

Key words： cassava; zinc-finger transcription factor; gene cloning; transcriptional activation; expression analysis

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31771859）;Research Project of Sanya Yazhou Bay Science and Technology City （SKJC-2020-2-002）

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科塊根作物，是全球熱帶地區(qū)一種重要的糧食作物，具有高產(chǎn)、高淀粉、耐旱、耐貧瘠等特征，目前在飼料、食品及工業(yè)領(lǐng)域均具有良好的產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿Γ–ock，1982;張鵬，2015;顏彥等，2019）。Di19（Drought-induced 19）蛋白屬于Cys2/His2鋅指蛋白家族中的一個亞類，廣泛存在于真核生物中（Kang et al.，2005），通過參與蛋白間的互作或結(jié)合順式作用元件調(diào)控下游基因，進(jìn)而在植物生長發(fā)育和干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)控作用（Li et al.，2010;Qin et al.，2016;張古文等，2020）。因此，克隆木薯Di19基因并分析其表達(dá)模式，對揭示其在木薯應(yīng)答非生物逆境脅迫中的功能和作用機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）是真核細(xì)胞中最豐富的蛋白之一，含有由2個半胱氨酸和2個組氨酸包裹一個鋅原子形成的手指型典型結(jié)構(gòu)，能結(jié)合DNA或RNA（Takatsuji，1999;Laity et al.，2001）。Di19是一類小分子鋅指蛋白，包含2個C2H2型結(jié)構(gòu)域和DPLLSF位點、FVQDLVL位點（Liu et al.，2013）。目前已在擬南芥（Gosti et al.，1995）、棉花（Li et al.，2010）、水稻（Wang et al.，2014）、大豆（Feng et al.，2015）、玉米（Zhang et al.，2019）、毛竹（Wu et al.，2020）等多個物種中鑒定出Di19基因。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥Di19家族基因在各個組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在明顯差異，如AtDi19-3基因在蓮座葉中相對表達(dá)量最高，在莖中最低，而AtDi19-4基因則相反（Milla et al.，2006）。擬南芥Di19家族基因在不同脅迫下的表達(dá)模式也不同，如AtDi19-1和AtDi19-3基因的轉(zhuǎn)錄水平在干旱脅迫處理后上調(diào)，AtDi19-2和AtDi19-4基因被高鹽脅迫誘導(dǎo)（Milla et al.，2006），AtDi19-7基因主要受光信號的調(diào)控（Kang et al.，2005），表明擬南芥Di19家族基因的生物學(xué)功能有所不同。此外，擬南芥Di19基因的T-DNA插入突變體對干旱脅迫高度敏感，而過表達(dá)株系的耐旱性顯著提高，通過生化分析，進(jìn)一步證實Di19作為轉(zhuǎn)錄因子激活下游基因PR1、PR2和PR5表達(dá)，從而提高植物耐旱能力（Liu et al.，2013）。棉花GhDi19-1和GhDi19-2基因在子葉中表達(dá)量較高，而在幼苗的下胚層中表達(dá)量較低，成熟后則在長角果的頂部和花藥中表達(dá)量較高，且受干旱和高鹽誘導(dǎo)表達(dá)（Li et al.，2010）。水稻OsDi19-4通過增強(qiáng)活性氧清除系統(tǒng)能力提高植株的耐旱能力（Wang et al.，2014）。大豆GmDi19-5基因在幼苗中表達(dá)量最高的組織是子葉，特別是子葉維管束，同時對高鹽、干旱、氧化脅迫和脫落酸（ABA）信號敏感（Feng et al.，2015）。玉米ZmDi19-5基因在不同組織中均有表達(dá)，但在莖中表達(dá)量最高（張敏，2017）?！颈狙芯壳腥朦c】Di19家族基因廣泛參與植物生長發(fā)育和逆境應(yīng)答，但至今尚無木薯Di19基因克隆及表達(dá)分析的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于木薯基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆MeDi19-1基因，并分析其亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活活性及在不同組織中的表達(dá)模式，為探究MeDi19-1基因在木薯中的作用機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

木薯KU50由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所保存提供。植物總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA純化（回收）試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司。酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109 Chemically Competent Cell和農(nóng)桿菌GV3101（psoup-p19）感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。酵母培養(yǎng)SD培養(yǎng)基購自酷來搏（北京）科技有限公司。亞細(xì)胞定位載體、酵母雙雜交載體和配套連接酶Nimble cloning試劑盒購自壹田生物科技（海南）有限公司。主要儀器設(shè)備：CT15RT高速冷凍離心機(jī)（TECHCOMP，中國）、PCR儀（Analytikjena，德國）、超微量紫外分光光度計（ThermoFisher Scientific，美國）、EPS300電泳儀（Tanon，上海）、4100凝膠成像儀（Tanon，上海）和FluoView FV1000激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）。

1. 2 樣品采集

選取發(fā)育狀況良好的木薯品種KU50植株，采集其若干葉片，經(jīng)液氮處理后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 RNA提取及cDNA第一鏈合成

按照植物總RNA提取試劑盒說明提取木薯葉片的總RNA，并采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳（0.5×TBE電泳緩沖液;150 V，15 min）檢測其完整性。采用超微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，并于 -80 ℃保存。取完整、純度合格的RNA樣品，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，用ddH2O稀釋10倍于-20 ℃保存，用于后續(xù)試驗。

1. 4 基因克隆及載體構(gòu)建

在Phytozome網(wǎng)站（https：//phytozome.jgi.doe.gov）上查找MeDi19-1基因（cassava4.1_016324m）的編碼區(qū)（CDS）序列，設(shè)計其引物MeDi19-1F/MeDi19-1R和MeDi19-1F’/MeDi19-1R’（表1），其中，引物MeDi19-1F/MeDi19-1R用于擴(kuò)增MeDi19-1基因CDS序列;引物MeDi19-1F/MeDi19-1R’用于擴(kuò)增包含有zf-Di19結(jié)構(gòu)域的N端序列（MeDi19-1N）;引物MeDi19-1F’/MeDi19-1R用于擴(kuò)增包含有Di19_C結(jié)構(gòu)域的C端序列（MeDi19-1C）。以木薯KU50葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25.0 μL：2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）2.5 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，ddH2O補(bǔ)充至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用DNA純化（回收）試劑盒純化回收目的片段。然后使用Nimble Cloning試劑盒將MeDi19-1與載體pNC-Green-SubC連接，將MeDi19-1、MeDi19-1C和MeDi19-1N分別與pGBKT7連接。以上連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含0.1 mol/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌斑，經(jīng)菌液PCR鑒定后將陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，提取重組質(zhì)粒于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）分析MeDi19-1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，利用NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）CDD進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析。利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)。通過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）對MeDi19-1基因進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測及同源序列查找。利用DNAMAN 7.0進(jìn)行CDS序列翻譯及同源比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析MeDi19-1基因的啟動子順式作用元件。

1. 6 亞細(xì)胞定位

將重組質(zhì)粒pNC-Green-SubC-MeDi19-1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101（psoup-p19）感受態(tài)細(xì)胞中。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒分別在健康的煙草葉片中表達(dá)，24 ℃培養(yǎng)3 d后取侵染的葉片，用DAPI染劑染色30 min，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

1. 7 轉(zhuǎn)錄激活活性分析

按照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System說明將重組質(zhì)粒pGBKT7-MeDi19-1、pGBKT7-MeDi19-1N和pGBKT7-MeDi19-1C分別與pGADT7空載體共轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109中，分別涂布到二缺（SD/-Leu/-Trp）培養(yǎng)基和四缺（SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His）培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)72～96 h后觀察酵母生長狀態(tài)，檢測轉(zhuǎn)錄激活活性。

1. 8 組織表達(dá)分析

利用Cassava Atlas數(shù)據(jù)庫（http：//shiny.danforthcenter.org/cassava_atlas/）中木薯組織中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析MeDi19-1基因（Manes.14G060400=cassava4.1_016324m）在木薯11種組織中的表達(dá)水平（Wilson et al.，2017）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 MeDi19-1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用木薯KU50葉片cDNA為模板，以MeDi19-1F和MeDi19-1R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為600 bp的特異條帶（圖1）。經(jīng)回收純化連接至pGBKT7載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并挑取陽性克隆進(jìn)行Sanger測序，將測序結(jié)果與MeDi19-1基因CDS標(biāo)準(zhǔn)序列（XP_021592171.1）進(jìn)行比對，結(jié)果顯示兩者的核苷酸序列相似性達(dá)99.52%，在77～79位缺失3個核苷酸，表明克隆獲得的序列為MeDi19-1基因CDS序列（OL620080）為618 bp，編碼205個氨基酸殘基。

2. 2 MeDi19-1蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果

MeDi19-1蛋白由205個氨基酸組成，化學(xué)式為C969H1500N288O311S8，原子總數(shù)為3076，分子量為22416.79 Da，理論等電點（pI）為6.10。MeDi19-1蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為44.97，脂肪族氨基酸指數(shù)為71.9，親水性指數(shù)的平均值（GRAVY）-0.401，為不穩(wěn)定疏水性蛋白。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，MeDi19-1蛋白含有zf-Di19結(jié)構(gòu)域，證明該蛋白屬于Di19家族（圖2）。MeDi19-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含無規(guī)則卷曲（53.66%）、α-螺旋（40.49%）、延伸鏈（4.39%）和β-轉(zhuǎn)角（1.46%）（圖3）。MeDi19蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致（圖4）。

2. 3 MeDi19-1蛋白的氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

使用NCBI數(shù)據(jù)庫的Smart BLAST檢索MeDi19-1蛋白的同源氨基酸序列，結(jié)果顯示氨基酸相似性在60%以上的物種包括橡膠樹（Hevea brasiliensis）83.50%、麻瘋樹（Jatropha curcas）77.78%、蓖麻（Ri-cinus communis）75.36%、銀白楊（Populus alba）68.75%、毛果楊（Populus trichocarpa）68.27%、美洲黑楊（Po-pulus deltoides）67.31%、可可樹（Theobroma cacao）60.85%、哥倫比亞錦葵（Herrania umbratica）60.65%、土瓶草（Cephalotus follicularis）60.38%和雷公藤（Tripterygium wilfordii）60.09%。對這些同源氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果（圖5）顯示，MeDi19-1氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)序列（XP_021592171.1）相比，在24位缺失一個絲氨酸，在25位丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，在其N端的42～95位氨基酸上均存在保守的zf-Di19結(jié)構(gòu)域。根據(jù)氨基酸序列的相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖6）顯示，MeDi19-1蛋白與橡膠樹（Hevea brasiliensis）、麻瘋樹（Jatropha curcas）和蓖麻（Ricinus communis）Di19蛋白的親緣關(guān)系最近。

2. 4 MeDi19-1基因啟動子元件分析結(jié)果

利用PlantCARE分析MeDi19-1基因上游2000 bp的啟動子序列，結(jié)果（圖7）發(fā)現(xiàn)，該基因啟動子除包含基本元件TATA-box和CAAT-box外，還包含光響應(yīng)元件（I-box和Box 4）、脅迫響應(yīng)元件（TC-rich repeats）、脫落酸（ABA）應(yīng)答元件（ABRE）、赤霉素響應(yīng)元件（TATC-box）、茉莉酸響應(yīng)元件（TGACG-motif）和厭氧感應(yīng)元件（ARE），推測MeDi19-1基因的表達(dá)受到ABA、赤霉素、茉莉酸、光信號和逆境脅迫等多種信號的調(diào)節(jié)。

2. 5 MeDi19-1蛋白亞細(xì)胞定位分析

將攜帶有GFP熒光蛋白基因的質(zhì)粒pNC-Green-SubC與MeDi19-1基因CDS序列連接，成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pNC-Green-SubC-MeDi19-1。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將植物表達(dá)載體在煙草葉片中表達(dá)，使用熒光共聚焦顯微鏡觀察侵染后葉片的熒光信號，結(jié)果顯示煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞膜中有熒光信號（圖8），表明MeDi19-1蛋白可能定位于木薯的細(xì)胞核和細(xì)胞膜中。

2. 6 MeDi19-1蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性鑒定結(jié)果

為探究MeDi19-1蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性及活性區(qū)域，將MeDi19-1蛋白按照結(jié)構(gòu)域分別拆分為N端366 bp區(qū)段（MeDi19-1N）和C端255 bp區(qū)段（MeDi19-1C）。將MeDi19-1、MeDi19-1C和MeDi19-1N與pGBKT7載體連接，成功構(gòu)建pGBKT7-MeDi19-1、pGBKT7-MeDi19-1N和pGBKT7-MeDi19-1C酵母表達(dá)載體。將構(gòu)建的酵母表達(dá)載體分別與pGADT7空載體在酵母中共表達(dá)，觀察酵母在SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His培養(yǎng)基上生長情況，結(jié)果表明含pGBKT7-MeDi19-1和pGBKT7-MeDi19-1C的酵母及陽性對照在2種培養(yǎng)基上生長良好（圖9），表明MeDi19-1具有轉(zhuǎn)錄激活活性，且其活性區(qū)域在C端。

2. 7 MeDi19-1基因組織表達(dá)分析結(jié)果

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析MeDi19-1基因在松散性胚性愈傷組織（FEC）、組織化胚性結(jié)構(gòu)（OES）、根尖分生組織（RAM）、纖維根（FR）、儲藏根（SR）、莖尖分生組織（SAM）、側(cè)芽（Lateral.Bud）、莖（Stem）、葉柄（Petiole）、中脈（Mid.Vein）和葉（Leaf）共11種木薯組織中的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖10所示。MeDi19-1基因在木薯11個組織中均有表達(dá)，在葉片、葉中脈和儲藏根中的相對表達(dá)量較高，在松散型胚性愈傷組織和組織化胚性結(jié)構(gòu)中的相對表達(dá)量較低，表明MeDi19-1基因具有組織表達(dá)特異性，可能主要在葉片和儲藏根中發(fā)揮調(diào)控作用。

3 討論

Di19家族基因編碼一種小分子鋅指蛋白，已在多種植物中被識別，其可能參與植物生長發(fā)育（Milla et al.，2006）、光信號應(yīng)答（Kang et al.，2005）和非生物逆境脅迫應(yīng)答（Liu et al.，2013），且受生長素、脫落酸等多種激素的調(diào)控（Liu et al.，2013）。木薯是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物之一，也是全球三大薯類作物之一（張鵬等，2014;趙思涵等，2019），研究木薯Di19基因的序列特征和表達(dá)模式可為進(jìn)一步揭示其功能和作用機(jī)制提供理論參考。本研究對MeDi19-1基因進(jìn)行克隆和生物信息分析，結(jié)果表明MeDi19-1蛋白含有Di19蛋白家族特有的zf-Di19結(jié)構(gòu)域，且在MeDi19-1基因啟動子上含有響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的核心元件ABRE。擬南芥AtDi19-3基因啟動子區(qū)域也含有核心元件ARBE，該基因已被證實受ABA信號調(diào)控（Qin et al.，2014），故推測MeDi19-1基因受ABA信號的調(diào)控。酵母雙雜交系統(tǒng)分析結(jié)果表明，MeDi19-1蛋白在C端具有轉(zhuǎn)錄激活活性，與大豆和擬南芥的Di19蛋白研究結(jié)果一致（趙娟瑩等，2017），推測MeDi19-1蛋白在木薯中作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多項生理活動。而亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，MeDi19-1蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜，與擬南芥（Qin et al.，2014）和棉花（Qin et al.，2016）的Di19蛋白僅定位于細(xì)胞核的結(jié)論不同，其原因可能是由于MeDi19-1與擬南芥和棉花中Di19蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其功能存在一定的差異。由于植物蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位結(jié)果可暗示其功能特性（邢浩然等，2006）。故推測定位于細(xì)胞核中的MeDi19-1蛋白可作為轉(zhuǎn)錄因子參與下游蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，亞細(xì)胞定位與其功能相符。細(xì)胞膜的主要功能是能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運輸、信息識別與傳遞等（武春飛等，2009），定位于細(xì)胞膜上的MeDi19-1蛋白則可能參與細(xì)胞膜相關(guān)功能，結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果推測其參與細(xì)胞膜上的信息傳遞。

此外，對MeDi19-1基因在木薯不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeDi19-1基因在葉片、葉中脈和儲藏根中的表達(dá)量較高。葉片是植物主要的光合作用器官（Nikolov et al.，2019），通過多種信號通路參與調(diào)控葉片的生長發(fā)育、衰老和應(yīng)激反應(yīng)（Du et al.，2018）;葉脈主要負(fù)責(zé)水、營養(yǎng)和糖的運輸并提供機(jī)械支撐（Sack et al.，2013）;木薯儲藏根的形成和發(fā)育則包含細(xì)胞的分裂伸長和營養(yǎng)物質(zhì)的積累（Sojikul and Scoffoni，2015）。結(jié)合MeDi19-1基因的啟動子順式作用元件分析結(jié)果，推測MeDi19-1作為轉(zhuǎn)錄因子參與木薯葉片發(fā)育、光應(yīng)答、營養(yǎng)運輸和儲藏根發(fā)育。目前擬南芥、水稻等模式植物中Di19蛋白均被證實響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫（Milla et al.，2006）。木薯作為一種耐貧瘠的作物，生存環(huán)境中存在多種非生物逆境脅迫，MeDi19-1蛋白可能參與木薯抗逆的多個生理生化過程，故在后續(xù)研究中需進(jìn)一步深入解析MeDi19-1蛋白在木薯抗逆中的生物學(xué)功能，尤其是響應(yīng)干旱脅迫過程中的功能。

4 結(jié)論

MeDi19-1基因?qū)儆贒i19基因家族成員，具有組織表達(dá)特異性，主要在葉、葉中脈和儲藏根中發(fā)揮調(diào)控作用，其編碼蛋白在木薯組織中作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)多項生理活動。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）