頸動(dòng)脈斑塊超聲血管造影分級(jí)與病理微血管密度的相關(guān)性

何烜亞，陳兆耀，張 琳，劉 牛，李 輝

0 引 言

頸動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的常見病因，既往對(duì)于卒中風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估多集中在腦動(dòng)脈狹窄程度以及臨床癥狀，但是對(duì)于無癥狀的患者僅憑狹窄程度無法為預(yù)測卒中風(fēng)險(xiǎn)提供充分的依據(jù)，對(duì)斑塊性質(zhì)即斑塊易損性的評(píng)估對(duì)于減少動(dòng)脈粥樣硬化性的腦卒中發(fā)生率、致殘率、死亡率具有重要意義[1]。目前關(guān)于“易損斑塊”(vulnerable plaque )的定義還是基于病理檢測結(jié)果，臨床上對(duì)于易損斑塊的診斷尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[2]。越來越多的證據(jù)表明，斑塊內(nèi)新生血管(intraplaque neovascularization, IPN)與斑塊破裂出血、炎癥密切相關(guān)，是導(dǎo)致斑塊生長和易損的重要因素[3,4]。因此，臨床上準(zhǔn)確地識(shí)別斑塊內(nèi)新生血管，有助于易損斑塊的識(shí)別與診斷，對(duì)于指導(dǎo)心腦血管疾病的預(yù)防有著重要的意義。

頸動(dòng)脈血管彩超由于其無創(chuàng)性與快捷性是目前臨床最常用的辨別頸動(dòng)脈易損斑塊的臨床方法，但是檢查結(jié)果有時(shí)依賴檢查者的主觀判斷與操作時(shí)超聲探頭的角度、方向與位置，特異性較差。超聲血管造影(contrast-enhanced ultrasound, CEUS)是識(shí)別頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)新生血管的超聲新技術(shù)，其利用發(fā)射聲波與造影劑微氣泡諧振所產(chǎn)生的二次諧波信號(hào)進(jìn)行成像，能敏感獲取斑塊內(nèi)微小血管的灌注特征[5]。本研究擬通過對(duì)比頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊CEUS分級(jí)與斑塊病理標(biāo)本新生血管密度，確認(rèn)CEUS識(shí)別斑塊內(nèi)新生血管的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1 一般資料前瞻性入組2017年11月至2019年12月在南京市鼓樓醫(yī)院的神經(jīng)外科接受頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)(carotid endarterectomy,CEA)的患者，手術(shù)適應(yīng)證為狹窄程度>70%無癥狀或有癥狀的頸動(dòng)脈粥樣硬化。如果患者曾經(jīng)出現(xiàn)過缺血性中風(fēng)或短暫腦缺血發(fā)作，則被定義為有癥狀的頸動(dòng)脈粥樣硬化。排除標(biāo)準(zhǔn)：感染和(或)敗血癥、高凝狀態(tài)和(或)近期的血栓栓塞以及嚴(yán)重肝、腎功能障礙以及對(duì)超聲造影劑過敏患者。所有患者術(shù)前至江蘇省中醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科行頸動(dòng)脈CEUS檢查并記錄檢查結(jié)果，檢查后1周內(nèi)行CEA。共入組20例患者，其中17例為有癥狀患者，3例為無癥狀患者。本研究經(jīng)江蘇省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2017NL-004-02)，符合《赫爾辛基醫(yī)學(xué)研究倫理原則宣言》，所有患者均給予書面知情同意參與。

1.2 頸動(dòng)脈斑塊CEUS檢查傳統(tǒng)頸動(dòng)脈超聲和CEUS是使用配有L9-3換能器的Philips iU-22超聲儀(美國博塞爾的Philips Medical Systems)進(jìn)行的。使用對(duì)比度為70%的特定于對(duì)比度的軟件設(shè)置。頸動(dòng)脈成像是由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲醫(yī)師根據(jù)美國超聲心動(dòng)圖學(xué)會(huì)共識(shí)聲明使用標(biāo)準(zhǔn)的掃描方案進(jìn)行[6]。患者仰臥姿勢(shì)，該姿勢(shì)朝向檢查的對(duì)側(cè)，并露出脖子。B型和彩色多普勒超聲分別在左右方向上掃描左右頸總動(dòng)脈、頸總叉、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和椎動(dòng)脈[7]。充分評(píng)估所有斑塊，并記錄頸動(dòng)脈狹窄程度。

在常規(guī)頸動(dòng)脈超聲檢查之后，利用第二代回聲造影劑(Bracco，米蘭，意大利)進(jìn)行CEUS，該造影劑由磷脂穩(wěn)定的六氟化硫微泡組成。靜脈通道首先用5 mL等滲鹽水沖洗，然后向左肘淺靜脈注射1.2 mL造影劑，然后立即予以5 mL的0.9%NaCl等滲鹽水沖洗。內(nèi)置定時(shí)裝置和圖像采集同步啟動(dòng)。在CEUS檢查期間，探頭聚焦于先前已確定目標(biāo)斑塊部位，并在低聲壓下通過縱向掃描完成圖像采集。

注射微泡后約15 min內(nèi)，頸動(dòng)脈腔內(nèi)可觀察到增強(qiáng)的對(duì)比效果，持續(xù)時(shí)間約5 min。如果檢測到多個(gè)斑塊，則患者可以重復(fù)接受以上檢查操作，2次檢查之間的間隔時(shí)間必須超過15 min。如果檢測到噬菌斑，則將靜止幀和片段以數(shù)字方式存儲(chǔ)至少10 min以進(jìn)行進(jìn)一步分析。為了降低噪聲并獲得均勻的信號(hào)強(qiáng)度，我們調(diào)制了時(shí)間增益補(bǔ)償。采用0.06的機(jī)械指數(shù)，并且在測試過程中焦點(diǎn)位于屏幕的底部，以減少微氣泡的破壞。同時(shí)，將幀頻和圖像深度分別調(diào)制為12/s和3～5 cm，以適應(yīng)頸動(dòng)脈的直徑。前面提到的所有設(shè)置在每次檢查中都保持不變。

CEUS斑塊分級(jí)：①0級(jí)：斑塊內(nèi)未見增強(qiáng)回聲；②1級(jí)：斑塊內(nèi)小范圍點(diǎn)樣增強(qiáng)回聲；③2級(jí)：點(diǎn)狀、短線樣增強(qiáng)回聲；④3級(jí)：斑塊內(nèi)長線樣或網(wǎng)狀增強(qiáng)回聲。CEUS易損斑塊標(biāo)準(zhǔn)：其中0～1級(jí)為穩(wěn)定斑塊，2～3級(jí)為不穩(wěn)定斑塊。

1.3 頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)(CEA)手術(shù)在全麻下進(jìn)行。患者取仰臥位，肩部墊高、頭偏向?qū)?cè)，切口位于胸鎖乳突肌前緣，以頸動(dòng)脈分叉為中心稍靠上，長5～7 cm。斜行切開皮膚及頸闊肌，乳突撐開器及兩把甲狀腺拉鉤牽開切口。銳性分離頸深筋膜至頸動(dòng)脈鞘，雙重結(jié)扎面總靜脈，充分解剖暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心段。全身肝素化、基礎(chǔ)血壓升高15%后分別阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，測頸內(nèi)動(dòng)脈殘端壓?？v行切開頸內(nèi)動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈。專用神經(jīng)剝離子剝脫斑塊，圈鑷摘除殘留斑塊。分別縫合內(nèi)膜及頸動(dòng)脈壁，吻合完畢后開放阻斷的動(dòng)脈，基礎(chǔ)血壓降低15%。檢查吻合口徹底止血，放置負(fù)壓引流管，全層連續(xù)稀松縫合頸闊肌和皮膚。

1.4 斑塊組織學(xué)檢查行頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后，取出的斑塊用等滲鹽水沖洗，經(jīng)4%甲醛溶液固定、24 h脫鈣處理并石蠟包埋后連續(xù)切片(3～5 μm)。行HE染色及CD31單克隆抗體免疫組化(IHC)染色。HE染色觀察斑塊內(nèi)組織成分及血管。CD31是內(nèi)皮細(xì)胞間連接的組成部分，CD31單克隆抗體免疫組化染色標(biāo)記新生血管，鏡下觀察，40倍低倍鏡下選3～5個(gè)血管豐富的熱點(diǎn)區(qū)域，轉(zhuǎn)至200倍和400倍高倍鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)取均值，通過Image-Pro Plus(IPP)圖像分析軟件進(jìn)行微血管密度(MVD)定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 患者基線數(shù)據(jù)20例患者中，男18例，女2例，高血壓病史13例(85%)，糖尿病病史5例(25%)，腦梗死病史17例(85%)，冠心病病史3例(15%)，外周血管病病史8例(40%)，吸煙病史5例(25%)，長期飲酒史2例(10%)。年齡(64.9±7.1)歲，身高(168.80±7.48)cm，體重(71.11±11.48)kg，收縮壓(142.53±10.90)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒張壓(80.16±12.24)mmHg，總膽固醇(3.85±0.83)mmol/L，三酰甘油(1.73±0.82)mmol/L，低密度脂蛋白(1.73±0.83)mmol/L，高密度脂蛋白(1.15±0.37)mmol/L，C反應(yīng)蛋白(80.12±96.45)mg/l，天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(27.67±23.77)U/L，丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(34.83±41.40)U/L，肌酸激酶(99.71±61.27)U/L，血肌酐(67.92±14.25)μmol/L，尿素氮(5.23±1.72)mmol/L。

2.2 斑塊病理標(biāo)本HE染色及CD31單克隆抗體的免疫組化染色HE染色可以見到斑塊內(nèi)新生血管，并且在血管周圍可以見到大量的紅細(xì)胞，提示斑塊內(nèi)存在出血。CD31單克隆抗體的免疫組化染色(IHC)中，藍(lán)色為細(xì)胞核，黃色、棕黃色或有黃色棕色顆粒是CD31免疫組化陽性反應(yīng)，標(biāo)記為血管內(nèi)皮細(xì)胞，并顯示了斑塊內(nèi)新生血管形態(tài)。見圖1。

a、b：斑塊HE染色(a:100倍，b:200倍)，黑色箭頭示斑塊內(nèi)新生血管；c、d：斑塊CD31標(biāo)記的IHC(c:200倍，d:400倍)，黑色箭頭示斑塊內(nèi)新生血管圖1 頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊HE染色及CD31單克隆抗體免疫組化(IHC)染色

2.3 CEUS新生血管分級(jí)與斑塊組織切片MVD相關(guān)性分析20例患者CEUS成像檢測20個(gè)目標(biāo)斑塊內(nèi)的新生血管，按照0～3級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中1級(jí)2個(gè)(10%)，2級(jí)7個(gè)(35%)，3級(jí)11個(gè)(55%)。CD31免疫組化染色200倍高倍鏡下MVD為(9.37±3.56)條/mm2。Spearman相關(guān)性分析顯示CEUS新生血管分級(jí)與CD31免疫組化染色200倍高倍鏡下組織切片MVD呈正相關(guān)(r=0.662，P=0.001)。

3 討 論

易損斑塊定義主要依賴斑塊的病理特征，如薄的纖維帽、大的壞死核心、膽固醇沉積以及斑塊內(nèi)炎癥等[8]。IPN是對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜增厚及斑塊中需氧量增加的保護(hù)性生理反應(yīng)，起始階期分為芽生和管腔形成，隨后血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的下調(diào)和內(nèi)皮中血管生成因子-1(Ang-1)、血小板衍生因子 (PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (TGF-β1)等的升高介導(dǎo)新生血管消退的過程[9]。生理性新生血管的生成維持了斑塊內(nèi)的氧供，避免了斑塊內(nèi)細(xì)胞的壞死和凋亡。但是病理性新生血管大量生成成為循環(huán)中炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)流入斑塊的主要途徑，加劇斑塊內(nèi)炎癥、脂質(zhì)核心的擴(kuò)張、氧化損傷和蛋白酶活化，促進(jìn)斑塊生長。大量不成熟的IPN由于嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)和功能異常，可以誘導(dǎo)斑塊內(nèi)出血(intra-plaque hemorrhage, IPH)及斑塊破裂，導(dǎo)致各種心腦血管事件的發(fā)生[10]。所以，IPN是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的特征，也是動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的核心標(biāo)志[11]。本研究中，患者手術(shù)切除斑塊HE染色中可以檢測到了大量的新生血管，證實(shí)斑塊內(nèi)存在大量新生血管生成，在血管周圍發(fā)現(xiàn)大量紅細(xì)胞，則提示可能存在新生血管破裂導(dǎo)致了IPH。通過CD31標(biāo)記的IHC染色，進(jìn)一步確認(rèn)斑塊內(nèi)存在大量的新生血管生成。

IPN對(duì)于斑塊生長及易損性的起到?jīng)Q定性作用，所以臨床上對(duì)IPN的準(zhǔn)確識(shí)別是臨床診斷易損斑塊的重要組成部分。目前診斷頸動(dòng)脈易損斑塊的方法有數(shù)字減影血管造影(DSA)、CT動(dòng)脈成像(CTA)、磁共振(MR)血管成像成像等。DSA可以準(zhǔn)確診斷動(dòng)脈硬化血管狹窄程度以及斑塊表面形態(tài)，是易損斑塊重要診斷方法，然而，DSA不能觀察到斑塊內(nèi)部結(jié)構(gòu)，雖然血管內(nèi)超聲 (IVUS)[12]及光學(xué)相干斷層掃描 (OCT)[13]血管內(nèi)成像方法在一定程度上彌補(bǔ)了這個(gè)缺陷，但是其仍然不能準(zhǔn)確顯示IPN，另外，由于其有創(chuàng)性及價(jià)格高昂使得應(yīng)用受到限制，臨床上不作為常規(guī)篩查項(xiàng)目。CTA對(duì)血管狹窄以及鈣化有著良好的識(shí)別，但是對(duì)于血管壁及斑塊內(nèi)部組織成分的識(shí)別準(zhǔn)確性不高[14]。DSA以及CTA均使用含碘造影劑，較高的過敏率以及腎毒性也限制了兩者在臨床上的使用。MR血管成像可以直接觀察血管管壁及斑塊內(nèi)部結(jié)構(gòu)，通過增強(qiáng)劑的作用可以識(shí)別斑塊內(nèi)強(qiáng)化，可以有效且準(zhǔn)確診斷易損斑塊，且可以檢查顱內(nèi)血管，如大腦中動(dòng)脈，在易損斑塊的診斷方面是僅次于病理診斷的準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)[15]。但是，MRI由于檢測時(shí)間時(shí)間較長，受呼吸及運(yùn)動(dòng)偽影影響大，成功率僅有70%左右。另外，MRI分辨率均在0.2～1 mm，不能完全滿足纖維帽厚度測量和斑塊內(nèi)組分成像的要求。同時(shí)，檢測的準(zhǔn)確性容易受到磁共振磁場、線圈及技師操作的干擾，導(dǎo)致準(zhǔn)確性下降，且檢查費(fèi)用較高，這些也限制了其臨床上應(yīng)用。

利用斑塊內(nèi)新血管對(duì)造影劑微泡的攝取，CEUS可提供高時(shí)空分辨率的血管造影樣圖像，以動(dòng)態(tài)可視化頸動(dòng)脈斑塊的新血管形成。本研究通過與病理學(xué)CD31染色標(biāo)記的血管比較，發(fā)現(xiàn)CEUS檢測新生血管分級(jí)與病理檢測斑塊內(nèi)微血管密度有很好的相關(guān)性，證實(shí)CEUS技術(shù)可以精準(zhǔn)識(shí)別頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中新生血管數(shù)量，通過新生血管數(shù)量的分級(jí)可以準(zhǔn)確診斷易損斑塊，與既往國內(nèi)外研究結(jié)果一致[16-19]。與MR斑塊增強(qiáng)成像及CTA相比，CEUS可以提供連續(xù)、動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)斑塊內(nèi)血管成像，不易遺漏某個(gè)增強(qiáng)階段[20]。除了可以準(zhǔn)確識(shí)別斑塊內(nèi)新生生血管，CEUS可以在彩色多普勒超聲(CDUS)的基礎(chǔ)上改善頸動(dòng)脈狹窄分級(jí)的準(zhǔn)確性和斑塊特征(如表面潰瘍)的檢測[21]。此外，CEUS技術(shù)作為一種非侵入性、無創(chuàng)傷性的影像檢查方法，還具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)、便攜性、可重復(fù)性以及更少禁忌證的特點(diǎn)。

總之，CEUS技術(shù)可以安全、可靠地識(shí)別頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的新生血管，準(zhǔn)確診斷易損斑塊。CEUS未來還可用于監(jiān)測頸動(dòng)脈易損斑塊的治療療效，并對(duì)指導(dǎo)腦卒中的二級(jí)甚至一級(jí)預(yù)防有著重要的臨床意義。

本研究樣本量較小，未來需要通過更大樣本量或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)一步證實(shí)相關(guān)結(jié)果。另外，CEUS斑塊易損性分級(jí)依賴檢測到斑塊內(nèi)的造影劑增強(qiáng)情況，并未帶入其他斑塊的特征，如斑塊斑塊表面潰瘍及內(nèi)部信號(hào)特點(diǎn)等，未來應(yīng)進(jìn)一步探索基于CEUS檢測全部內(nèi)容的臨床易損斑塊診斷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。