沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子A參與子癇前期的發(fā)病機(jī)制研究

劉金鈺，陳超，楊星宇，程蔚蔚

子癇前期(preeclampsia，PE)是一類以高血壓為主要特征的妊娠期特有疾病，常伴有蛋白尿和母體器官功能障礙，其全球發(fā)病率約為2%～8%[1]。PE是產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡率升高的主要原因，其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，基于其臨床發(fā)病及預(yù)后特點(diǎn)，胎盤功能障礙被認(rèn)為是PE病理進(jìn)程中的關(guān)鍵因素。在PE中滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲相關(guān)分子及血管生成分子的表達(dá)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足及血管生成受阻，進(jìn)而導(dǎo)致胎盤功能受損[2]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silence information regulator 2 homolog 1，SIRT1)是一種蛋白脫乙?；?，在干細(xì)胞分化及細(xì)胞新陳代謝等多種生理過程中發(fā)揮作用，能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、衰老、增殖、凋亡等功能[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中均有表達(dá)[4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一個家族，包括VEGFA、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子。VEGFA是VEGF家族中最重要、受研究最廣泛的成員，是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子。通常VEGF即指VEGFA。VEGFA可通過增加血管通透性、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移、影響病理性血管形成等方式，參與血管生成依賴性疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。

多項研究表明，SIRT1可通過影響VEGF家族功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。SIRT1可通過影響VEGF的表達(dá)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[6]，SIRT1也可通過抑制VEGF/AKT通路減輕骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨退變[7]。另一項研究表明SIRT1可抑制VEGF/Flk-1信號通路，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[8]。但目前尚無SIRT1與VEGFA在PE中共同作用的報道。本研究擬通過相關(guān)實(shí)驗檢測PE孕婦胎盤組織中SIRT1和VEGFA表達(dá)變化，從而探討SIRT1通過影響VEGFA的表達(dá)導(dǎo)致PE發(fā)生的有關(guān)機(jī)制，并探索其相關(guān)性，進(jìn)一步為PE的診斷與治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年7月至2021年3月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院住院分娩的剖宮產(chǎn)PE孕婦24例為PE組，并選取同期健康妊娠的剖宮產(chǎn)孕婦16例為對照組。收集所有研究對象的年齡、分娩孕周、收縮壓、舒張壓、胎盤重量、新生兒體重及身長等基本情況，并計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有研究對象均知情同意并簽字。

1.2 納排標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有PE孕婦均符合第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》中PE診斷標(biāo)準(zhǔn)；所有入組孕婦及其家屬選擇剖宮產(chǎn)分娩。排除標(biāo)準(zhǔn)：通過輔助生殖技術(shù)受孕者；孕前患有高血壓者；嚴(yán)重的腎病、慢性高血壓、自身免疫病、肝病、妊娠期糖尿病、胎盤早剝等其他產(chǎn)科并發(fā)癥；不良孕產(chǎn)史；多胎妊娠。

1.3 主要試劑

引物由生工生物工程(上海)公司合成；反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物；免疫組化抗體購自美國Abcam公司；Western blot抗體購自美國Proteintech公司；Trizol試劑、RIPA試劑及BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。

1.4 標(biāo)本采集

所有研究對象胎盤娩出后，10 min內(nèi)從胎盤母體面近臍帶附著區(qū)域切取約1 cm×1 cm×1 cm胎盤組織2塊，避開出血及鈣化灶等部位。采用預(yù)冷的無菌PBS溶液漂洗去除血污，并用無菌紗布吸干水分，選取一塊裝入2 mL凍存管中,-80℃保存?zhèn)溆?，另一塊經(jīng)4%多聚甲醛固定后包埋于石蠟中。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR法檢測相關(guān)基因mRNA表達(dá)

分離胎盤組織并用Trizol法提取組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將800 ng的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，以18s rRNA為內(nèi)參對照，檢測SIRT1和VEGFA的mRNA相對表達(dá)，基因序列如下頁表1所示。實(shí)驗結(jié)果按2-ΔΔCt方法計算并統(tǒng)計分析。

1.6 免疫印跡(Western Blot)檢測相關(guān)基因蛋白表達(dá)

取50 mg組織研磨，加入150 μL蛋白裂解液RIPA勻漿裂解，取上清液，測定蛋白濃度；取蛋白提取液20 μg 加入樣品孔中，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過夜、洗膜、二抗孵育1 h、洗膜，最后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑，用化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測蛋白表達(dá)水平。

表1 基因引物序列

表2 兩組孕婦基本臨床資料比較

1.7 免疫組化法檢測胎盤組織中SIRT1蛋白表達(dá)情況

取資料和方法1.4中石蠟包埋的胎盤組織，以4 μm的厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，嚴(yán)格按照Abcam免疫組化試劑盒說明書操作。采用二氨基聯(lián)苯氨顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，用蘇木素復(fù)染并將其在不同梯度乙醇中脫水，中性樹膠進(jìn)行封片，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，比較兩組間SIRT1蛋白表達(dá)情況。從每個切片中隨機(jī)選取10個高倍視野，計算視野中陽性染色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦基本臨床資料比較

與對照組孕婦相比，PE組孕婦在分娩孕周、收縮壓、舒張壓、24 h尿蛋白水平方面，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩組孕產(chǎn)婦年齡及BMI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2；PE組新生兒出生體重、胎盤重量、身長低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

2.2 兩組孕婦胎盤組織SIRT1和VEGFA的表達(dá)比較

PE組胎盤組織中SIRT1在mRNA及蛋白表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

對兩組胎盤樣本石蠟切片中SIRT1染色情況比較，結(jié)果顯示SIRT1大多數(shù)位于滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)，少量存在于細(xì)胞質(zhì)中。與對照組孕婦比較，PE組SIRT1蛋白陽性表達(dá)率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見下頁圖2。

PE組胎盤組織中VEGFA在mRNA及蛋白表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見下頁圖3。

2.3 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，PE孕婦胎盤組織中SIRT1和VEGFA在mRNA水平的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.358，P<0.05)，見下頁圖4。同時，對兩組孕產(chǎn)婦胎盤組織中SIRT1和VEGFA在mRNA水平的表達(dá)與孕婦及新生兒的一般資料進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)SIRT1與孕產(chǎn)婦的分娩孕周(r=-0.507，P<0.01)、胎盤重量(r=-0.433，P<0.01)、新生兒出生體重(r=-0.365，P<0.05)及身長(r=-0.448，P<0.01)呈負(fù)相關(guān)，而VEGFA與孕產(chǎn)婦收縮壓水平(r=-0.443，P<0.01)呈負(fù)相關(guān)，與新生兒出生體重(r=0.359，P<0.05)呈正相關(guān)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見下頁表4。

表3 兩組新生兒臨床資料比較

注：A為兩組孕婦胎盤組織中SIRT1的mRNA表達(dá)水平；B為兩組孕婦胎盤組織中SIRT1的蛋白表達(dá)水平。CON為對照組(*P<0.05)

注：兩組孕婦胎盤組織中SIRT1的表達(dá)水平。CON為對照組(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

注：A為兩組孕婦胎盤組織中VEGFA的mRNA表達(dá)水平；B為兩組孕婦胎盤組織中VEGFA的蛋白表達(dá)水平。CON為對照組(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

圖4 PE胎盤組織SIRT1和VEGFA mRNA相關(guān)性分析(*P<0.05)

表4 研究對象一般資料與孕婦胎盤組織SIRT1、VEGFA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

PE是導(dǎo)致母兒高死亡率以及造成母體多器官功能障礙的重要原因。PE患者在產(chǎn)后15年內(nèi)罹患心血管疾病的概率增加2～7倍[9]?！皟呻A段論”是目前關(guān)于PE病理機(jī)制的主流學(xué)說，PE發(fā)病與胎盤絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤不足及炎癥因子激活導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷與重鑄障礙關(guān)系密切。密集分支的胎盤血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育是胎盤形成的關(guān)鍵，胎盤絨毛表面的滋養(yǎng)細(xì)胞在氣體交換、營養(yǎng)、內(nèi)分泌和對胎兒的免疫支持等方面起著舉足輕重的作用。正常情況下，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵入，誘導(dǎo)子宮螺旋動脈重構(gòu)，使其管徑擴(kuò)張，胎盤血流灌注增加，以適應(yīng)妊娠期的高血流量需要。而異常的螺旋動脈重塑，胎盤灌注不足和缺氧損傷以及由此導(dǎo)致的可溶性fms樣酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosin kinase-1，sFlt-1)的循環(huán)水平升高，被認(rèn)為是與PE相關(guān)的主要病理生理過程之一[10]。

SIRT1可能通過影響滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡和胎盤血流灌注，調(diào)節(jié)母體氧化應(yīng)激水平，參與PE發(fā)生。本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測了PE孕婦胎盤組織中SIRT1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，SIRT1蛋白主要表達(dá)于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中，在絨毛間質(zhì)細(xì)胞中亦有少量表達(dá)。與正常妊娠孕婦相比，PE孕婦胎盤組織中SIRT1的mRNA及蛋白表達(dá)水平較高。Nakamura K等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在肝缺血期間，SIRT1的表達(dá)增加。缺氧狀態(tài)下，SIRT1可通過激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，調(diào)節(jié)自噬通量及炎癥小體活化，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[12]。而肝臟、胰腺和大腦中 SIRT1 的缺失會顯著增加活性氧 (ROS) 和炎癥反應(yīng)；SIRT1也可通過減少氧化應(yīng)激抑制 LPS 誘導(dǎo)的 NLRP3 炎癥小體激活。推測SIRT1高表達(dá)可能是機(jī)體預(yù)防組織損傷的自補(bǔ)償機(jī)制。但同時，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可能會影響妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及血管形成。Lee KM等[13]研究表明，siRNA對SIRT1的敲低顯著增強(qiáng)了滋養(yǎng)層細(xì)胞系Swan71的侵襲和遷移功能，并降低了MMP-2、MMP-9和EMT標(biāo)志物的表達(dá)。SIRT1也能通過阻滯Akt/p38-MAPK信號傳導(dǎo)反向調(diào)節(jié)自噬，降低HUVEC的增殖能力，使得其細(xì)胞毒性增加以及Fas表達(dá)增加。抑制 SIRT1 活性會降低 NDRG1 在滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)，而NDRG1表達(dá)增加可通過 PI3K/AKT 通路抑制人胎盤細(xì)胞中的血管生成，使滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷加重[14]。SIRT1表達(dá)異?？赡苁菍?dǎo)致PE患者滋養(yǎng)層侵襲不足及血管重鑄障礙的重要原因。胎盤缺氧、缺血狀態(tài)下，血管內(nèi)皮組織損傷，導(dǎo)致PE和胎兒生長發(fā)育遲緩[15]。

本研究中，PE孕婦胎盤組織中VEGFA表達(dá)水平顯著降低。VEGFA是對內(nèi)皮細(xì)胞有特異性的生長因子，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中,參與血管形成。sFlt-1是VEGFA的受體，能夠阻斷VEGFA的生物活性，研究發(fā)現(xiàn)，在PE胎盤絨毛組織中，VEGFA/sFlt-1比值下降70%[16]。sFlt-1升高抑制了胎盤血管生成，VEGFA的低表達(dá)可抑制胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、增殖，導(dǎo)致胎盤微血管形成減少，出現(xiàn)促/抗血管生成因子失衡。同時，sFlt-1可作為阻滯劑與母血中游離的VEGF結(jié)合，導(dǎo)致胎盤絨毛浸潤能力下降，新生血管生成速度降低，進(jìn)而導(dǎo)致母體血管內(nèi)皮功能損傷，誘發(fā)或加重PE樣癥狀。

本研究發(fā)現(xiàn)：孕婦胎盤中的SIRT1與VEGFA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。且SIRT1與孕產(chǎn)婦的分娩孕周、胎盤重量、新生兒出生體重及身長呈負(fù)相關(guān)，而VEGFA與孕產(chǎn)婦收縮壓水平呈負(fù)相關(guān)，與新生兒出生體重呈正相關(guān)。推測SIRT1可能通過抑制VEGFA表達(dá)影響滋養(yǎng)層血管生成，誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，參與PE的發(fā)生發(fā)展。已有研究顯示，SIRT1過表達(dá)強(qiáng)烈抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，而Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)可以通過HIF-1α上調(diào)VEGFA，SIRT1對血管生成的抑制作用受YAP/HIF1α/VEGFA表達(dá)軸拮抗[17]。大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生調(diào)控可能是通過SIRT1-HIF-1α-VEGFA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來完成的[18]。而SIRT1可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路下調(diào)VEGFA表達(dá)，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生[19]。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)，PE 孕婦胎盤組織中的SIRT1表達(dá)較高，VEGFA表達(dá)較低，二者具有顯著負(fù)相關(guān)性，SIRT1可能通過負(fù)調(diào)控VEGFA表達(dá)，參與PE的發(fā)病機(jī)制。