懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因克隆和功能分析

尹明華 陳佳雯 陳瑞 樊凡 辜婷婷 何思捷 陳榮華 蔡紅

摘要：通過懷玉山三葉青試管苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選到懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因的核心片段，利用RT-PCR 技術(shù)克隆該病毒增殖蛋白3基因，并進行序列分析、亞細胞定位、器官表達分析和功能分析。結(jié)果表明：懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因cDNA總長度為873 bp，G+C 含量為44.22%;懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3由290個氨基酸組成，分子量33 374.79 u，等電點9.72，為疏水性蛋白;二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋（57.24%）、β-片層（10.69%）、無規(guī)則卷曲（32.07%） 構(gòu)成;三級結(jié)構(gòu)為單體;預(yù)測懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3主要存在質(zhì)膜、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中;懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3與葡萄煙草病毒增殖蛋白3 （GenBank：XP_002275179.1、GenBank：XP_034684444.1）的同源性最高，同源性達到94.83%。通過煙草葉片亞細胞定位分析表明，煙草病毒增殖蛋白3定位于細胞質(zhì)（可能包括細胞膜）和細胞核膜中。實時定量PCR結(jié)果顯示，煙草病毒增殖蛋白3基因在懷玉山三葉青2個栽培種中的表達存在器官特異性，懷玉2號和懷玉1號均在葉中表達量最高;煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性煙草的三葉青花葉病毒表達量顯著高于煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陰性煙草;與煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陰性煙草相比較，煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性煙草的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、實際光化學(xué)量子效率（ΦPS Ⅱ）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）及電子傳遞效率（ETR）顯著下降，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）顯著上升。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3具有典型煙草病毒增殖蛋白3的結(jié)構(gòu)特征，氨基酸序列及核酸序列與同源物種相似度高，進化上高度保守，且可促進三葉青煙草花葉病毒的增殖，降低植株的光合作用效率。

關(guān)鍵詞：懷玉山三葉青;煙草病毒增殖蛋白3;基因克隆;功能分析;蛋白結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S567.901 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）06-0032-09

收稿日期：2021-04-27

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31960079）;江西省重點研發(fā)計劃一般項目（編號：20192BBGL70050、20202BBG73010）;江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（編號：GJJ201704）;上饒市重點研發(fā)計劃一般項目（編號：2020C002）;上饒市平臺載體建設(shè)項目（編號：2020J001、2019I017）。

作者簡介：尹明華（1973—），江西永新人，女，碩士，教授，主要從事植物生物技術(shù)研究工作。E-mail：yinminghua04@163.com。

三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）是我國特有珍稀瀕危藥用植物，別稱三葉青、金線吊葫蘆、蛇附子、石老鼠，為葡萄科（Vitaceae）崖爬藤屬（Tetrastigma）多年生蔓生藤本[1]。三葉青全草均可入藥，以地下塊根和果實的藥用效果最好[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，三葉青對于高熱、肺炎、肝炎、胃炎等諸多嚴重感染性疾病均有顯著療效[3]。另外，三葉青所含的三葉青黃酮、β-谷甾醇、多糖等能很好地抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，且無毒無副作用，是目前公認的“植物抗生素”[4]。三葉青一般采用扦插無性繁殖，極易感染和積累煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）[5]。煙草花葉病毒是一種單鏈RNA病毒，寄主范圍廣，能侵染茄科、葫蘆科、豆科、十字花科、藜科、莧科、番杏科和商陸科等 30 科 300 多種植物。TMV 侵染植物后葉片常表現(xiàn)為表面斑駁、泡斑、畸形、壞死等癥狀，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重危害[6]。煙草花葉病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制和運輸需要依靠一些宿主因子才能完成[7]。 近年來在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中一些宿主因子基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，并被證實支持病毒的復(fù)制，如煙草病毒增殖蛋白1（tobamovirus multiplication 1，TOM1）、煙草病毒增殖蛋白2 （TOM2）和煙草病毒增殖蛋白3 （TOM3）[8]。因此，克隆三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因并對其進行功能分析，對研究煙草病毒增殖蛋白3基因在三葉青中的表達和三葉青煙草花葉病毒的增殖具有重要意義。關(guān)于煙草病毒增殖蛋白3研究的報道較少。宋靜靜等構(gòu)建了馬鈴薯StTOM1和 StTOM3雙干擾植物雙元表達載體并對其進行了轉(zhuǎn)化驗證，StT1-StT3 馬鈴薯中StTOM1基因 mRNA的表達水平下調(diào)了 78%，StTOM3基因下調(diào)了 81%[9]。目前，對三葉青的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理臨床、種植栽培、組織培養(yǎng)等方面[10]，關(guān)于三葉青煙草病毒增殖蛋白3方面的研究尚未見報道。利用RT-PCR 技術(shù)克隆懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因，并采用生物信息學(xué)方法、煙草轉(zhuǎn)基因技術(shù)和實時定量 PCR進行序列、功能和組織表達分析，為揭示懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，為從分子水平調(diào)控懷玉山三葉青煙草花葉病毒增殖提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

懷玉山三葉青2個栽培種懷玉1號和懷玉2號試管苗。試驗于2020年8月至2021年3月在上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第1鏈合成 用Trizol 試劑提取懷玉2號試管苗的總 RNA，提取步驟按說明書進行，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的濃度和完整性。以提取獲得的 RNA為模版，按照 M-MLV cDNA 第1鏈合成試劑盒說明書合成 cDNA 第1鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用 Oligo（dT）18 Primer：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟按說明書進行。

1.2.2 煙草病毒增殖蛋白3基因的克隆 利用轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息（TRINITY_DN3523_c0_g1），運用 Primer Premier 5.0 設(shè)計引物（F：ATGGCGCCGACGGCAGAGGTAG;R：GCGAATAGGATGATATTGTGTGAT）。PCR反應(yīng)體系（總體積50 μL）包括17 μL ddH2O、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix（各10 mmol/L）、2 μL 模板DNA、2 μL引物1（10 μmol/L）、2 μL 引物2（10 μmol/L）、1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease（1 U/μL）。PCR擴增條件：95 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s，45～55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，39個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶與 pMD19-T 載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞Escherichia coli DH5α，經(jīng)鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.2.3 煙草病毒增殖蛋白3基因的生物信息學(xué)分析 使用 BioEdit軟件翻譯基因序列為氨基酸序列，用 ProtParam預(yù)測酶的理化性質(zhì)，用 ProtScale預(yù)測酶的疏/親水性。使用GOR I軟件在線預(yù)測酶的二級結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MOLD在線預(yù)測酶的三級結(jié)構(gòu)。采用 WoLFPsort在線預(yù)測基因的表達部位。通過軟件DNAMAN和 Bioedit進行氨基酸序列比對，利用MEGA5.0軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.2.4 載體構(gòu)建 用BamHⅠ酶切載體pRI101-GFP線性化，回收后和目的基因片段重組反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系包括4 μL 10×K/10×L Buffer、5 μL 載體質(zhì)粒、2 μL BamHⅠ和ddH2O（補足至40 μL）。酶切產(chǎn)物純化后與上述PCR產(chǎn)物進行重組反應(yīng)。重組連接反應(yīng)體系（總體積10 μL）包括4 μL 線性化載體、1 μL 插入片段、2 μL 5×CE Ⅱ Buffer、1 μL Exnase Ⅱ和ddH2O（補足至10 μL）。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細胞。挑取PCR陽性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒，同時擴增產(chǎn)物送測序。擴增和測序引物為插入目的基因兩側(cè)的載體序列，分別為 35S-F：5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3′;GFP-JR：5′-GGGTGAGCTTGCCGTAGGTG-3′。

1.2.5 煙草葉片亞細胞定位 將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，涂布卡那霉素抗性平板，挑取單克隆于YEB液體培養(yǎng)基，在28 ℃搖床內(nèi)小搖、大搖培養(yǎng)2 d，菌體4 000 r/min離心4 min，去上清后菌體用10 mmol/L MgCl2（含120 μmol/L乙酰丁香酮）懸浮液重懸，調(diào)整D600 nm值至0.6左右;用無針頭的1 mL注射器吸取農(nóng)桿菌菌液，從煙草葉片下表皮（背面）壓迫注射;將注射完成的煙草植株弱光培養(yǎng)2 d，即可觀察。接種2 d后取注射區(qū)域的煙草葉片，制作玻片，在激光共聚焦顯微鏡（FluoView FV1Oi，OLYMPUS公司）下觀察、拍照;同時以空載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌作為對照重復(fù)上述操作。葉綠體熒光信號說明：葉綠體熒光信號激發(fā)波長640 nm，發(fā)射波長675 nm;綠色熒光蛋白（GFP）信號說明：綠色熒光蛋白GFP激發(fā)光488 nm，發(fā)射光510 nm。

1.2.6 煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測 煙草葉片用農(nóng)桿菌侵染后均經(jīng)過4次篩選/繼代，誘導(dǎo)出抗性芽，再轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基中。采用PCR對其再生苗進行鑒定，得到煙草病毒增殖蛋白3基因的煙草轉(zhuǎn)基因株系。PCR擴增體系（共20 μL）包括7 μL ddH2O、10 μL 2×Taq Master Mix、1 μL 模板DNA、1 μL引物1（10 μmol/L）、1 μL引物2 （10 μmol/L）。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán);72 ℃ 5 min。

1.2.7 煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽苗的病毒接種和光合指標檢測 培養(yǎng)3個月后，取含煙草花葉病毒的三葉青試管苗葉片放在研缽中并加入適量磷酸緩沖液研磨成糊狀病樣汁液;然后在煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性株系和陰性株系移栽苗幼嫩的葉面上撒少許等量金剛砂，蘸取含煙草花葉病毒的煙草試管苗等量病樣汁液在撒了金剛砂的葉面上輕抹 3次（模擬蚜蟲的病毒田間傳播），之后用無菌水清洗葉面;然后放入智能人工氣候室內(nèi)澆灌MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng);2個月后采用林國衛(wèi)等的方法[5]對三葉青煙草花葉病毒在煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性株系和陰性株系上的表達量進行qRT-PCR檢測，同時采用Li-6400便攜式光合測定儀（LI-COR公司，美國）測定煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性株系和陰性株系移栽苗的光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差，并使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗差異顯著性（α=0.05）。

1.2.8 煙草病毒增殖蛋白3基因的組織表達分析??? 分別取懷玉1號和懷玉2號試管苗的根、莖、葉RNA 500 ng，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量 PCR（qRT-PCR，SYBR GreenⅠ）檢測內(nèi)參基因為GAPDH。設(shè)計引物（F：CCTATCCCAGTCACGGTCAT;R：ACAGGGAAGCGTTGTAGCA）。qRT-PCR 檢測采用 20 μL 反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s，51 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，40個循環(huán)。使用 2-ΔΔCT 法計算基因表達水平。試驗重復(fù)3次。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差，并使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗煙草病毒增殖蛋白3基因組織表達的差異顯著性（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因cDNA序列

通過PCR擴增技術(shù)（圖1），懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因cDNA總長度為873 bp，G+C 含量為44.22%（圖2）。

2.2 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3氨基酸序列

Protparam預(yù)測的懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3氨基酸序列見圖3。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3由290個氨基酸組成，分子量為33 374.79 u，等電點9.72，為疏水性蛋白。各氨基酸的數(shù)目和比例為Ala（A）（26，9.0%）、Arg（R）（17，5.9%）、Asn（N）（9，3.1%）、Asp（D）（6，21%）、Cys（C）（4，1.4%）、Gln（Q）（11，3.8%）、Glu（E）（9，3.1%）、Gly（G）（11，3.8%）、His（H）（6，2.1%）、Ile（I）（22，7.6%）、Leu（L）（38，131%）、Lys（K）（10，3.4%）、Met（M）（5，1.7%）、Phe（F）（24，8.3%）、Pro（P）（13，4.5%）、Ser（S）（12，4.1%）、Thr（T）（14，4.8%）、Trp（W）（8，28%）、Tyr（Y）（12，4.1%）、Val（V）（33，11.4%）。帶負電殘基總數(shù)（Asp+Glu）為15，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為27。序列的N端為M（Met），C端為R（Arg）。失穩(wěn)指數(shù)（Ⅱ）計算為40.09，該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3親疏水性

從圖4可知，高峰值（正值）的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而低谷值（負值）的區(qū)域是親水區(qū)域。結(jié)果表明，最大疏水值為3.0左右，在該多肽中說明該處的疏水性最強;親水峰最大值為-3.0左右，在該多肽中說明該處的親水性最強。整個蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的疏水性，說明該蛋白為疏水性蛋白質(zhì)。

2.4 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3二級結(jié)構(gòu)

GOR 預(yù)測顯示其二級結(jié)構(gòu)由α螺旋（Hh，5724%）、β-片層（Ee，1069%）、 無規(guī)則卷曲（Cc，32.07%）構(gòu)成（圖5）。從分布位點來看，C端和N端含無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋，且無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋則散布于整個蛋白質(zhì)中。

2.5 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3三級結(jié)構(gòu)

SWISS-MODEL預(yù)測顯示懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3的三級結(jié)構(gòu)為單體（圖6）。

2.6 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3亞細胞定位預(yù)測

采用 WoLFPsort在線軟件對懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因的表達部位進行預(yù)測（圖7），結(jié)果表明，定位于質(zhì)膜中的數(shù)量為8，液泡膜中為4，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中為1，表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因主要存在質(zhì)膜、液泡膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

2.7 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3系統(tǒng)進化分析

通過Blastp比對取同源性最高的全15個蛋白，從構(gòu)建的進化樹（圖8）可見，懷玉山三葉青與Herrania umbratica（哥倫比亞錦葵）、Durio zibethinus（榴蓮）、Carica papaya（番木瓜）、Tripterygium wilfordii （雷公藤）、Pistacia vera（開心果）、Punica granatum（石榴）、 Nelumbo nucifera（蓮）和Vitis vinifera（歐亞種葡萄）、Vitis riparia（河岸葡萄）在一個大分支下，說明在進化上親緣關(guān)系較近，尤其是與Vitis vinifera（歐亞種葡萄）、Vitis riparia（河岸葡萄）煙草病毒增殖蛋白3（GenBank：XP_002275179.1、GenBank：XP_034684444.1）在同一小分支下，說明兩者在進化上具有最高的親緣關(guān)系。

2.8 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3同源蛋白的序列比對信息

比對結(jié)果見圖9，其中※號區(qū)域是該蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域。

2.9 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因目的片段擴增與瞬時表達載體構(gòu)建

以提供的目的基因序列設(shè)計引物（去掉終止密碼子TAG/TAA/TGA）進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳。結(jié)果顯示，在目標位置擴增到單一條帶，大小正確。將條帶切膠回收，即為目的基因片段（圖10）。用BamHI酶切載體pRI101-GFP線性化，回收后和目的基因片段重組反應(yīng)。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細胞。挑取PCR陽性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行酶切檢測，同時擴增產(chǎn)物送測序。測序比對結(jié)果顯示，目的基因已插入載體，表達載體構(gòu)建準確（圖11）。

2.10 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3亞細胞定位分析

通過煙草葉片瞬時表達，將煙草病毒增殖蛋白3融合綠色熒光蛋白（GFP）的載體質(zhì)粒2301-TP2A-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，吸取農(nóng)桿菌液，壓迫注入煙草葉片下表皮（背面）進行煙草病毒增殖蛋白3亞細胞定位分析（圖12）。利用激光共聚焦顯微鏡觀察，融合GFP的煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)化煙草葉片只在細胞質(zhì)（可能包括細胞膜）和細胞核膜觀察到綠色熒光，表明煙草病毒增殖蛋白3定位于細胞質(zhì)（可能包括細胞膜）和細胞核膜，與 WoLFPsort在線軟件預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.11 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因煙草鑒定、GUS組織化學(xué)染色和光合特征

圖13為煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性煙草和陰性煙草PCR檢測，通過PCR檢測篩選出煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性煙草和陰性煙草。由圖14可見，懷玉山三葉青煙草花葉病毒侵染后，煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性煙草根莖葉的TMV表達量顯著高于轉(zhuǎn)基因陰性煙草。光合生理的測定結(jié)果表明，與懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陰性煙草相比較，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性煙草的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、實際光化學(xué)量子效率（ΦPSⅡ）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）及電子傳遞效率（ETR）顯著下降，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）顯著上升（表1）。

2.12 懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中煙草病毒增殖蛋白3基因的表達分析

以懷玉山三葉青的GAPDH為內(nèi)參，利用實時熒光定量PCR分析懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因在懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中的表達情況。結(jié)果顯示，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因在根、莖、葉中均有表達，但在不同組織器官的表達情況差異顯著（圖15），但均在葉中表達量最高。

3 結(jié)論與討論

煙草花葉病毒侵染宿主后，需要依靠宿主內(nèi)一些病毒增殖蛋白（如TOM1、TOM2和TOM3）才能完成其自身的復(fù)制[9]。研究表明，在擬南芥、煙草、番茄、辣椒等植物中TOM1和TOM3基因可以促進TMV、CMV、ToMV等病毒的復(fù)制，說明TOM1和TOM3基因在不同物種之間存在一定的保守性[11]。宋靜靜克隆了馬鈴薯StTOM3基因的cDNA和基因組DNA序列，獲得的cDNA長度為 1 254 bp，全長基因組DNA長度為6 245 bp[11]。StTOM3基因含有多個高疏水性區(qū)域，為7次跨膜蛋白。馬鈴薯StTOM3基因編碼297個氨基酸，與擬南芥StTOM3基因在核苷酸水平上的同源性為612%，在氨基酸水平上同源性達到72.9%，相似性達到83.8%[12]。番茄基因ToTOM3全長cDNA共有1 267個核苷酸，包含1個含888個核苷酸的編碼區(qū)、72個核苷酸的5′非編碼區(qū)和307個核苷酸的3′非編碼區(qū)，編碼1個含295個氨基酸、推測是一種7次跨膜蛋白的分子量為34.4 ku的蛋白質(zhì)[13]。本試驗結(jié)果表明，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因cDNA總長度為873 bp，G+C 含量為44.22%，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3由290個氨基酸組成，分子量為33 374.79 u，等電點為9.72，為疏水性蛋白。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3在進化上與Herrania umbratica（哥倫比亞錦葵）、Durio zibethinusl（榴蓮）、Carica papaya（番木瓜）、Tripterygium wilfordii （雷公藤）、Pistacia vera（開心果）、Punica granatum（石榴）和 Nelumbo nucifera（蓮）和Vitis vinifera（歐亞種葡萄）、Vitis riparia（河岸葡萄）的親緣關(guān)系較近，尤其是與Vitis vinifera（葡萄）煙草病毒增殖蛋白3（GenBank：XP_002275179.1、GenBank：XP_034684444.1）在進化上具有最高的親緣關(guān)系。說明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因具有保守性。這些保守區(qū)段的發(fā)現(xiàn)將為其他物種新的懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因的克隆提供序列依據(jù)。從堿基組成和G+C含量基本平衡來看，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因G+C的含量越高，基因穩(wěn)定性越高，三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，這可能為三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因穩(wěn)定遺傳與進化提供了保證。

本研究表明，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3在氨基酸序列水平上除了與 TOM3-like、TOM3 isoform X2和TOM3 isoform X1具有較高的同源性，還與Herrania umbratica（哥倫比亞錦葵）、Durio zibethinusl（榴蓮）等其他植物中一些未知功能的跨膜蛋白具有高度同源性，暗示許多植物中可能存在類似的功能蛋白（在此稱之為 TOM 家族）參與病毒復(fù)制過程中 RNA 復(fù)制復(fù)合體的裝配、特異選擇和招募 RNA 復(fù)制模板、激活 RNA的合成等[14-18]，或是與運動蛋白或胞間連絲相互作用，參與病毒的體內(nèi)運輸[19-22]。這些 TOM 膜蛋白很可能作為病毒復(fù)制酶的一種框架結(jié)構(gòu)，同時還可以作為病毒蛋白和其他寄主因子的錨定物參與病毒復(fù)制復(fù)合體的形成[23-25]。

研究表明，擬南芥TOM1和TOM3 基因均編碼跨膜蛋白，其同源性為 56%，主要與 TMV 復(fù)制蛋白中的螺旋酶相互作用，幫助復(fù)制酶復(fù)合體錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或液泡膜等高密度生物膜上[26]。本試驗通過軟件預(yù)測懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3主要存在質(zhì)膜、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中;而煙草葉片亞細胞定位分析表明，煙草病毒增殖蛋白3定位于細胞質(zhì)（可能包括細胞膜）和細胞核膜中。本試驗結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。Kumar等認為與液泡膜相關(guān)的宿主蛋白TOM1和TOM3是煙草病毒高效增殖所必需的[27]。有研究表明，轉(zhuǎn)反義ToTOM3或RNAi的番茄植株推遲發(fā)病時間并且癥狀顯著減輕，生物學(xué)測定結(jié)果表明轉(zhuǎn)反義ToTOM3或RNAi的轉(zhuǎn)基因番茄植株顯著抑制CMV和TMV在番茄體內(nèi)的積累，證實番茄ToTOM3基因是CMV和TMV的寄主因子基因[13]。

在本試驗中，懷玉山三葉青煙草花葉病毒侵染后，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性煙草根莖葉中的懷玉山三葉青TMV表達量顯著高于轉(zhuǎn)基因陰性煙草。表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3可以促進懷玉山三葉青煙草花葉病毒的增殖，也證明懷玉山三葉青ToTOM3基因是懷玉山三葉青煙草花葉病毒的寄主因子基因。

馬鈴薯ToTOM3基因在馬鈴薯的基因組中為單拷貝基因，且在馬鈴薯營養(yǎng)生長和生殖生長時期的各個器官內(nèi)都有表達[11]。相對定量RT-PCR試驗表明ToTOM3基因在番茄子葉期、5葉期、10葉期、結(jié)果期等4個生育期的莖、根、葉及結(jié)果期的花、果等組織中均有表達，而且表達量基本一致，說明ToTOM3屬于組成型表達基因[13]。本試驗結(jié)果與此不同，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因在根、莖、葉中均有表達，但在不同組織器官中的表達情況差異顯著，在葉中表達量最高。表明，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因主要的表達位置在葉片。植物病毒一旦侵染會導(dǎo)致植物種性退化，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣。究其原因是植物的無性繁殖極易感染，從而使植物的光合效率下降[28]。在本試驗中，與懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陰性煙草相比較，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉(zhuǎn)基因陽性煙草的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、最大光化學(xué)效率、實際光化學(xué)量子效率、光化學(xué)淬滅系數(shù)及電子傳遞效率顯著下降，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)顯著上升，表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3通過懷玉山三葉青煙草花葉病毒的增殖繼而影響植株的光合作用，這是植物產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣的根本原因。本研究首次從懷玉山三葉青基因組中克隆出煙草病毒增殖蛋白3基因，并對克隆的基因序列和其氨基酸序列進行了生物信息學(xué)、亞細胞定位以及功能和組織表達分析，為三葉青煙草花葉病毒增殖的研究補充了基礎(chǔ)資料。同時，由于煙草花葉病毒的復(fù)制和維持需要合適的寄主因子，通過調(diào)控寄主因子，阻斷煙草花葉病毒在懷玉山三葉青體內(nèi)的復(fù)制和運輸，就有可能達到防治煙草花葉病毒病和減輕病害癥狀的目的。這種策略對懷玉山三葉青煙草花葉病毒病的防治具有普遍意義，是最有希望的新的抗懷玉山三葉青煙草花葉病毒策略之一。

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