高效液相色譜法檢測白酒中四種有機(jī)酸的方法研究

張瑞景，王 浩，蔡鳳嬌，夏 燕，汪江波，徐 健*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；2.湖北琪譜檢測技術(shù)有限公司，湖北 武漢 430068）

白酒是以糧谷為主要原料，以大曲、小曲、麩曲酶制劑及酵母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾調(diào)而制成的飲料酒[1]，是世界上歷史悠久的六大蒸餾酒之一[2-3]。白酒中的主要成分是乙醇和水，約占總量的98%；微量成分約占總量的2%，包括酯類、酸類、醇類、醛類等成百上千種化合物，這些物質(zhì)決定了白酒的風(fēng)格與品質(zhì)[4]。有機(jī)酸類物質(zhì)約占微量成分的14%～16%，在酒體中起到減輕苦味、增長后味、使酒體豐滿、促進(jìn)回甜、增加醇和度等作用，是白酒的主要呈味物質(zhì)，也是酯類物質(zhì)生成的重要前體物質(zhì)[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，同一有機(jī)酸在各香型白酒中的含量存在差異，如乙酸在藥香型原酒中含量高達(dá)2.8 g/L、醬香型原酒中含量為1.42 g/L、濃香型原酒中含量僅為0.21 g/L[8]。此外，相同香型白酒的不同樣品中，有機(jī)酸的種類和濃度含量也差異較大。李先貴等[9]的研究結(jié)果表明，四種典型醬香型白酒中C2～C8的低碳脂肪酸的含量分別為1.7 g/L、1.4 g/L、2.2 g/L和1.8 g/L。張明等[10]對枝江柔雅白酒及其他六種濃香型白酒中的有機(jī)酸含量進(jìn)行檢測，研究表明，白酒中乙酸、乳酸、己酸和丁酸的含量約占總酸含量的90%[6]，是構(gòu)成白酒中總酸的主要的四種有機(jī)酸。因此，準(zhǔn)確測定白酒樣品中乙酸、乳酸、己酸、丁酸的含量，對實(shí)際生產(chǎn)具有重要的參考及指導(dǎo)作用。

目前，白酒中有機(jī)酸的檢測方法主要包括氣相色譜法[11-12]、液相色譜法[13-14]、離子色譜法[15-16]和質(zhì)譜法[17-18]等。乙酸、丁酸和己酸等揮發(fā)性的有機(jī)酸多采用氣相色譜法進(jìn)行測定[19]，但在檢測過程中往往存在峰拖尾的現(xiàn)象[20-21]；非揮發(fā)性的有機(jī)酸若使用氣相色譜法進(jìn)行測定還需進(jìn)行衍生化[17]，處理過程相對繁瑣。宋衛(wèi)得等[15]采用離子色譜法同時(shí)檢測酒樣中的乳酸、乙酸、丁酸等物質(zhì)，但需先調(diào)節(jié)樣品pH值至5.2～6.5的范圍內(nèi)，再將樣品高速離心后進(jìn)行稀釋，最后經(jīng)濾膜過濾，收集樣液進(jìn)行檢測，樣品制備過程相對復(fù)雜。乳酸、乙酸、丁酸等也可以用液相色譜法檢測[22-23]，王芳等[24]用液相色譜同時(shí)檢測白酒中的四大酸，但是存在基線漂移較大（超過60 mAU）、檢出限高（10 mg/L）的缺點(diǎn)。

本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法同時(shí)檢測白酒中乳酸、乙酸、丁酸和己酸四種主要有機(jī)酸的含量，對該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限、重復(fù)性及加標(biāo)回收率進(jìn)行了測定。同時(shí)，研究了不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（1%～70%）對四種有機(jī)酸定性和定量的影響，并提出了有效的改良策略。以期得到一種便捷、高效、準(zhǔn)確測定白酒中四種有機(jī)酸的方法，對實(shí)際生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸、丁酸、己酸和乳酸標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇（色譜級）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甲磺酸（色譜級）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；乙醇（色譜級）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

白酒樣品：均由湖北工業(yè)大學(xué)釀酒中試基地提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo U3000 HPLC、Acclaim OA色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：賽默飛世爾科技公司；AS 220.R1電子天平：波蘭RADWAG公司；Direct-Q 5 UV純水儀：美國Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

分別取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL和7.0 mL無水乙醇置于10 mL的容量瓶中，加入0.5 mL用純水配制的10 g/L四種有機(jī)酸母液，用純水定容，得到體積分?jǐn)?shù)1%～70%的乙醇-酸混合溶液。取0.2 mL酒樣用超純水定容至5 mL，搖勻后采用0.22 μm針頭式濾器過濾、備用。

1.3.2 HPLC分析條件

本試驗(yàn)所用HPLC配備Acclaim OA色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和紫外檢測器，柱溫為25 ℃，檢測波長為210nm，流動相流速為0.8mL/min。流動相包括A：100mmol/L硫酸鈉溶液；B：100%乙腈；C：2.5 mmol/L甲磺酸溶液，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確量取50 μL乳酸、乙酸、丁酸和己酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的容量瓶中，并置于電子天平上稱質(zhì)量，用10%乙醇溶液定容，得到四種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的母液。分別量取0.02 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL和0.8 mL母液置于10 mL的容量瓶中，用純水定容得到不同質(zhì)量濃度（8～430 mg/L）混標(biāo)，經(jīng)0.22 μm針頭式濾器過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 方法的精密度試驗(yàn)

參考GB/T 6379.3—2012/ISO 5725-3：1994《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第3部分：標(biāo)準(zhǔn)測量方法的中間度量》[25]的方法進(jìn)行，按1.3.2的實(shí)驗(yàn)方法，每個(gè)樣品重復(fù)測量6次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

向本底值約為100 mg/L的標(biāo)樣中分別加入約40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L和240 mg/L的標(biāo)樣，按1.3.2的方法進(jìn)行測量，每個(gè)樣品重復(fù)測量6次。計(jì)算標(biāo)樣加標(biāo)回收率。

取0.1 mL白酒樣品置于5 mL的容量瓶中，分別加入不同濃度的標(biāo)樣，用超純水定容，搖勻后經(jīng)0.22 μm針頭式濾器過濾后備用，按照1.3.2的方法進(jìn)行測量，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。

1.3.6 白酒樣品中總酸含量的測定

白酒樣品中總酸含量的測定參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[26]進(jìn)行。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度及由HPLC測得的對應(yīng)峰面積，通過Thermo U3000 HPLC自帶的Chromeleon 7軟件擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)，并用該軟件進(jìn)行平均值、RSD的計(jì)算。用Excel 2010進(jìn)行回收率的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種有機(jī)酸的定性

在前期試驗(yàn)中，通過對比乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、2.5 mmol/L甲磺酸-乙腈、100 mmol/L Na2SO4-2.5 mmol/L甲磺酸-乙腈等不同流動相組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用100 mmol/L Na2SO4-2.5 mmol/L甲磺酸-乙腈流動相體系時(shí)，乳酸、乙酸、丁酸和己酸都能較好的分離（分離度均＞1.5），如圖1所示，四種酸的峰形較為對稱、尖銳。此外，四種酸類物質(zhì)能夠在25 min內(nèi)全部出峰，檢測時(shí)間較短。

圖1 四種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of four organic acids mixed standard solution

2.2 線性關(guān)系及檢出限

采用1.3.2的方法對配制的不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，用Chromeleon7軟件對測得的峰面積（y）和質(zhì)量濃度（x）擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。四種有機(jī)酸的保留時(shí)間、線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

表2 四種有機(jī)酸HPLC分析的保留時(shí)間、線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Retention time,linear range,standard curve regression equation,correlation coefficient and limit of detection of four organic acids analyzed by HPLC

由表2可知，四種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999 7，能達(dá)到GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[27]的技術(shù)要求，說明該方法線性良好，可滿足定量檢測的要求。參考GB/T 5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分 總則》[28]以信噪比（S/N）=3確定檢出限，除丁酸外檢出限均在1 mg/L以下，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室的檢測需求。

2.3 方法的精密度試驗(yàn)

選取17～19 mg/L、120～160 mg/L及245～315 mg/L三個(gè)質(zhì)量濃度范圍的標(biāo)樣，用1.3.2的方法進(jìn)行6次平行測定，計(jì)算四種有機(jī)酸在不同質(zhì)量濃度下的測定結(jié)果的平均值及RSD，結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of precision tests (n=6)

由表3可知，當(dāng)乙酸、丁酸和己酸的質(zhì)量濃度較低（17～19 mg/L）時(shí)，RSD在0.53%～1.54%之間，在中、高質(zhì)量濃度（124～313 mg/L）時(shí)，RSD＜0.5%，在高質(zhì)量濃度時(shí)的重復(fù)性比低質(zhì)量濃度時(shí)好；乳酸在三種不同質(zhì)量濃度下RSD均＜0.3%。四種有機(jī)酸的精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜1.6%，說明該方法的精密度良好，可用于白酒樣品的檢測。

2.4 方法加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在本底值約為100 mg/L的標(biāo)樣中，依次進(jìn)行四個(gè)不同質(zhì)量濃度添加水平下的回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品平行測定3次，計(jì)算平均回收率和RSD，結(jié)果如表4所示。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 4 Results of adding standard recovery rate tests (n=3)

續(xù)表

由表4可知，乳酸的加標(biāo)回收率在97.24%～100.75%之間，乙酸的加標(biāo)回收率在98.51%～104.34%之間，丁酸的加標(biāo)回收率在98.71%～103.54%之間，己酸的加標(biāo)回收率在100.07%～104.40%之間，四種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率均能達(dá)到GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[27]的技術(shù)要求，RSD均＜0.5%，表明該方法的測定結(jié)果準(zhǔn)確度較好。

2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對四種酸出峰效果的影響

白酒中乙醇的含量較高，體積分?jǐn)?shù)在25%～68%之間[29-30]。乙醇由于比水、乙腈、甲醇等常用流動相的極性弱，因此在反相色譜系統(tǒng)中有著更強(qiáng)的洗脫力[31]。在選用水-乙腈作為流動相的反相色譜系統(tǒng)中，乙醇的存在可能會對樣品中四種有機(jī)酸的保留時(shí)間造成影響，進(jìn)而影響酒樣中四種有機(jī)酸的定性及定量。研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對乳酸、乙酸、丁酸和己酸保留時(shí)間、峰形的影響，其結(jié)果如圖2和表5所示。

表5 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對丁酸、己酸保留時(shí)間的影響Table 5 Effect of different alcohol volume fraction on the retention time of butyric acid and hexanoic acid

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對乳酸、乙酸保留時(shí)間及色譜峰的影響Fig.2 Effect of different alcohol volume fraction on the retention time and chromatographic peak of lactic acid and acetic acid

由圖2可知，不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對乳酸和乙酸的保留時(shí)間影響較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%以上時(shí)，兩種有機(jī)酸不能有效分離且所得峰形較差。乙醇體積分?jǐn)?shù)在5%和20%時(shí)，乳酸和乙酸可以分開，但是乙酸峰形較差，且兩種有機(jī)酸的保留時(shí)間與標(biāo)樣相比提前0.15 min以上。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＜3%時(shí)，乳酸和乙酸的峰形與標(biāo)樣相比變化較小，保留時(shí)間與標(biāo)樣相比差值在0.1 min以內(nèi)，兩種有機(jī)酸的定性和定量基本不受影響。

由表5可知，不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對丁酸、己酸保留時(shí)間的影響較小，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從1%提高至70%時(shí)，兩種酸的保留時(shí)間幾乎沒有變化（RSD＜0.1%），這表明該方法中己酸和丁酸的定性定量不受乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響。因此，對于只需測定己酸或丁酸的白酒樣品可不用稀釋，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后直接進(jìn)行檢測。在用此方法同時(shí)測定四種有機(jī)酸時(shí)，由于白酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)較高，尤其是高度酒乙醇體積分?jǐn)?shù)通常在40%以上[29]，需要對白酒樣品進(jìn)行稀釋處理，將乙醇含量控制在3%以下。

2.6 白酒樣品的測定

分別準(zhǔn)確量取0.2 mL的濃香型、醬香型和清香型白酒樣品置于5 mL容量瓶中，用超純水定容，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，按1.3.2的色譜條件進(jìn)行四種有機(jī)酸的檢測，結(jié)果見表6。

由表6可知，在三種酒樣中四種有機(jī)酸的含量占總酸的89%以上，是其主要的有機(jī)酸，且由于3種酒樣香型不同，四種有機(jī)酸在各酒樣中的含量差異較大。酒樣1為濃香型白酒，己酸是主體香味成分己酸乙酯的前體物質(zhì)之一，其含量與己酸乙酯含量呈正相關(guān)[32]，在此樣品中己酸含量達(dá)到0.9 g/L，在四種酸中含量最高；乳酸含量達(dá)到0.8 g/L，處于較高水平，說明該酒較好[5]；乙酸含量相對較低。酒樣2為醬香型白酒，該酒中乙酸的含量最高，達(dá)到1.2 g/L，占總酸含量的70%以上；其次為乳酸，含量為0.36 g/L。酒樣3為清香型白酒，乙酸是主體香味成分乙酸乙酯的前體物質(zhì)之一，含量達(dá)到0.9 g/L，占總酸含量的一半以上；乳酸含量為0.4 g/L，同樣是該酒樣主要的酸類物質(zhì)之一。三種酒樣的測定結(jié)果與其香型特點(diǎn)相符。上述結(jié)果表明，該方法能準(zhǔn)確檢測出各酒樣間同一有機(jī)酸含量的區(qū)別及同一酒樣中不同有機(jī)酸含量的差異。

表6 不同酒樣的測定結(jié)果Table 6 Determination results of different Baijiu samples by HPLC

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜法同時(shí)測定白酒中乳酸、乙酸、丁酸和己酸含量的方法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、精密度、加標(biāo)回收率均能達(dá)到GB/T 27404—2008的技術(shù)要求。通過研究不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對四種有機(jī)酸保留時(shí)間和峰形的影響，發(fā)現(xiàn)在實(shí)際檢測中將白酒樣品的乙醇體積分?jǐn)?shù)稀釋至3%以內(nèi)，可以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用該方法對三種不同白酒樣品中的四種有機(jī)酸進(jìn)行測定，可準(zhǔn)確檢測出各酒樣中乳酸、乙酸、丁酸和己酸的含量差異。本研究所提出的方法可用于不同白酒樣品中四種有機(jī)酸含量的檢測，能快速、準(zhǔn)確的獲得結(jié)果，對白酒的勾調(diào)具有重要的指導(dǎo)意義。