高效陰離子交換色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中酵母β-葡聚糖

羅 浩，吳俊發(fā)，吳芷欣，霍玟希，黃偉乾*，黃榮榮，何敏恒，

（1.廣州檢驗(yàn)檢測認(rèn)證集團(tuán)有限公司，廣東 廣州 511400；2.國家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)中心（廣東），廣東 廣州 511400）

酵母β-葡聚糖主要以β-（1,3）-糖苷鍵、β-（1,6）-糖苷鍵結(jié)合，是具有增強(qiáng)免疫活性、改善血脂、抗輻射、改善腸道功能等作用的活性多糖[1-3]。目前已作為新型食品配料用于嬰兒配方食品、嬰幼兒輔助食品及特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中，使用量為0.21～0.67 g/kg；香菇、小麥和燕麥等食品中的β-葡聚糖也常作為保健品的主要功效成份，酵母β-葡聚糖應(yīng)用廣泛[4-8，10]，研究嬰幼兒配方食品中酵母β-葡聚糖定量分析方法非常重要。

目前報(bào)道的酵母β-葡聚糖前處理[11]方式主要有多步酶-堿法、酸水解法、酶解法、硫酸沉淀法等，而檢測方法主要有分光光度法[12，13-14]、氣相色譜法[15]、液相色譜法[16-19]、離子色譜法等。嬰兒配方奶粉中的酵母β-葡聚糖，由于其水溶性差、添加量低，存在難定量的問題。離子色譜法[20-21]對功能性糖檢測較有優(yōu)勢，檢測限低，且離子色譜法檢測酵母β-葡聚糖的報(bào)導(dǎo)較少。本研究采用離子交換色譜法，針對酵母β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)采用酶水解法，通過優(yōu)化提取條件、色譜分離條件等，分離并酶解提取物，從而建立高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法[21-25]測定酵母β-葡聚糖含量的檢測方法，以期為嬰幼兒配方乳粉的安全保障提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒奶粉樣品：市售；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%）：德國Dr公司；冰乙酸、氫氧化鉀、氫氧化鈉、正磷酸、磷酸氫二鈉（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；無水乙酸鈉（分析純）、50%NaOH溶液（色譜純）、中性蛋白酶（酶活力≥240 000 U/g）、堿性蛋白酶（酶活力≥80 000 U/g）、脂肪酶（酶活力≥50 000 U/g）：美國Sigma公司；溶壁酶（酶活力≥10 U/mL）、β-（1,6）-葡聚糖酶（酶活力≥2 U/mg）、β-（1,3）-葡聚糖酶和葡萄糖苷酶混合酶（酶活力分別為≥100 U/mL和20 U/mL）：愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-6000離子色譜儀（配脈沖積分安培檢測器，配Au電極）：美國Thermo公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司；渦旋振蕩器：德國IKA公司；恒溫振蕩水?。簝?yōu)萊博公司；臺式高速離心機(jī)：美國Sigma公司；S-210型pH計(jì)、MS204T分析天平：瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 方法原理

嬰幼兒配方奶粉經(jīng)熱水溶解，先使用混合蛋白酶（等體積比中性蛋白酶和堿性蛋白酶）和脂肪酶將樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪酶解，經(jīng)高速離心，保留沉淀物，沉淀物再經(jīng)體積分?jǐn)?shù)85%乙醇溶液洗去沉淀物中的單雙糖，可得到樣品中的酵母β-葡聚糖。酵母β-葡聚糖經(jīng)葡聚糖酶酶解成葡萄糖，離子色譜檢測，經(jīng)外標(biāo)法定量，經(jīng)換算可得到酵母β-葡聚糖含量。

1.3.2 樣品處理

（1）β-葡聚糖的提取

稱取嬰幼兒配方奶粉樣品約5g（精確至0.001g）于50 mL離心管中，加入30 mL 70 ℃水充分溶解，加入500 μL堿性蛋白酶和中性蛋白酶混合液，以及500 μL脂肪酶，充分振蕩后于約50 ℃水浴中酶解孵育2 h后冷卻至室溫。靜置10 min后，置于10 000 r/min離心5 min，再利用滴管仔細(xì)吸除上層脂肪和中間酶解液，保留沉淀物，加入體積分?jǐn)?shù)85%乙醇溶液5 mL，混勻，超聲5 min，重復(fù)操作3次，可得到提取物。

（2）β-葡聚糖提取物的酶解

加入400 μL 2 mol/L冷的氫氧化鉀溶液至提取物中，冰浴旋渦15 min，冰浴期間多次短時(shí)間旋渦至全部沉淀分散且無可見結(jié)塊后，加入乙酸鈉緩沖溶液至2 mL，再加入500 μL溶壁酶，將其置于50 ℃水浴鍋中，酶解過夜（12 h以上），取出冷卻至室溫后定容至5 mL，得到酶解液。

移取100μL酶解液至10mL試管中，加入300μLβ-（1,6）-葡聚糖酶溶液，50 ℃酶解[26]60 min后，冷卻至室溫，再加入300 μL混合酶溶液，40 ℃酶解60 min后，冷卻至室溫，用純水定容至5.0 mL，再經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾測定。以不加試樣，其他步驟同樣品檢測的全過程一致的為空白。

（3）酶解條件優(yōu)化

分別考察蛋白質(zhì)酶解溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）、蛋白質(zhì)酶解時(shí)間（0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h）、溶壁酶添加量（200 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL、700 μL）對酶解率的影響。

1.3.3 酶解率的計(jì)算

酶解率是通過原樣品中葡聚糖量扣減經(jīng)酶解后產(chǎn)生葡萄糖折算成的葡聚糖的量與原樣中葡聚糖的比值計(jì)算得出。酶解率的計(jì)算公式如下：

式中：P1為原樣品中葡聚糖量，mg/100 g；P2為經(jīng)酶解后產(chǎn)生葡萄糖折算成的葡聚糖的量，mg/100 g。

1.3.4 儀器條件

色譜柱：Thermo PA10陰離子交換柱（250 mm×4 mm，帶預(yù)柱）；檢測器：脈沖積分安培檢測器，Au電極；淋洗液：A為0.15 mol/L NaOH溶液，B為0.15 mol/L NaOH+0.5 mol/L乙酸鈉混合溶液，C為超純水；淋洗梯度程序：0～20.0 min 30%A+70%C，20.1～25.0 min 100%B，25.1～35.0 min 30%A+70%C；流速：1.00 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5β-葡聚糖含量的測定

將系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述色譜條件上機(jī)測定，記錄色譜圖峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。將試樣溶液注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中查得試樣溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度。β-葡聚糖含量的計(jì)算公式如下：

式中：c為待測液的質(zhì)量濃度，mg/L；V為定容體積，mL；m為稱樣質(zhì)量，g；0.9：葡萄糖換算成酵母β-葡聚糖的系數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

離子色譜經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣分析，使用Thermo自帶的儀器控制軟件（Chromeleon 7.2）進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

常見的單、雙糖pKa在12～14時(shí)，屬于弱酸，因而在pH 12以上的淋洗液中基本上是以陰離子形式存在。目前常用的糖陰離子交換分離柱類型包括MA和PA兩類，其中MA型柱填料為大孔型樹脂，具有極高的柱容量，故適用于分析弱保留的糖醇類物質(zhì)；而PA型無孔型樹脂填料色譜柱中CarborPac PA 100和PA200更適合多糖分析，單糖分析效果較差。CarborPac PA 1和PA20分離時(shí)存在氧負(fù)峰的干擾，因此選擇CarborPac PA 10用于本試驗(yàn)。

2.2 淋洗液濃度的選擇

確定選用PA10進(jìn)行目標(biāo)物的分離，考慮選用適合的淋洗液分析目標(biāo)物，分離效果較佳，本試驗(yàn)考察了不同淋洗液濃度（30 mmol/L、45 mmol/L、60 mmol/L）對分離效果的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，三種淋洗液濃度條件下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品均能很好分離，分別在4.9 min、11.6 min、19.4 min左右出峰，當(dāng)淋洗液濃度在45 mmol/L時(shí)，樣品的酶解產(chǎn)物出峰時(shí)間較適中且無明顯干擾。目標(biāo)峰出峰后可使用強(qiáng)淋洗液（乙酸鈉-氫氧化鈉混合溶液）沖洗色譜柱，以排除樣品中雜質(zhì)對下一樣品的干擾。所以本實(shí)驗(yàn)選擇淋洗液濃度為45 mmol/L。

圖1 不同淋洗液濃度條件下樣品色圖譜Fig.1 Chromatogram of samples under different concentration of eluent

2.3 不同酶解條件對酶解率的影響

2.3.1 蛋白質(zhì)酶解溫度對酶解率的影響

通過pH-state法研究蛋白酶在不同溫度和時(shí)間的酶解度[12]。考察酶解過程中不同溫度對樣品中蛋白的酶解去除效果，結(jié)果見圖2。由圖2可知，酶解率隨著酶解溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，酶解效果最佳，繼續(xù)升溫對比發(fā)現(xiàn)，酶解效果反而成下降趨勢。因此，選擇最適蛋白質(zhì)酶解溫度為50 ℃。

圖2 蛋白質(zhì)酶解溫度對酶解率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis rate

2.3.2 蛋白質(zhì)酶解時(shí)間對酶解率的影響

固定酶解溫度為50 ℃，考察不同酶解時(shí)間對蛋白質(zhì)酶解率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)酶解時(shí)間對酶解率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis rate

由圖3可知，酶解率隨著酶解時(shí)間的延長先升高，酶解時(shí)間＞2.0 h之后，酶解效果基本無變化，故選擇酶解時(shí)間為2.0 h。

2.3.3 溶壁酶添加量對酶解率的影響

固定酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為2.0 h，考察溶壁酶（10 U/μL）添加量對酵母β-葡聚糖的酶解效果的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著溶壁酶添加量的增加，酶解率逐漸提高；當(dāng)添加量＞500 μL之后，酶解率基本穩(wěn)定。因此，選擇溶壁酶添加量為500 μL。

圖4 溶壁酶使用量對酶解率的影響Fig.4 Effect of lysozyme addition on enzymatic hydrolysis rate

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

分別對系列濃度葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以葡萄糖的色譜峰面積y對其質(zhì)量濃度x（mg/L）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，葡萄糖在0.10～50.0 mg/L范圍成線性良好（R2=0.999 5），標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=1.088 1x-0.010 74。

2.4.2 方法檢出限及定量限

以酶解產(chǎn)物葡萄糖的含量為參考，通過系列的換算，折算成酵母β-葡聚糖的含量。以葡萄糖的信噪比（S/N）3倍、10倍計(jì)算儀器檢出限和定量限，結(jié)合前處理樣品酶解過程的稀釋倍數(shù)（以50倍計(jì)）以及葡萄糖換算成酵母β-葡聚糖的系數(shù)（以0.9計(jì)），可得酵母β-葡聚糖的方法檢出限（limit of detection，LOD）和方法定量限（limit of quantitation，LOQ）。經(jīng)測試，LOD為3.0 mg/100 g，LOQ為10.0 mg/100 g，本方法靈敏，可滿足嬰幼兒配方奶粉中酵母β-葡聚糖的定量分析要求。

2.4.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

選取陰性嬰幼兒配方奶粉（本底值為：0 mg/100 g）添加3個(gè)濃度水平的酵母β-葡聚糖，按照本方法進(jìn)行前處理和離子色譜檢測，每個(gè)添加水平平行測定5次，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），測試結(jié)果見表1。由表1可知，酵母β-葡聚糖在10.0～50.0 mg/100 g加標(biāo)水平下，平均回收率在96.9%～102.1%之間，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standarddeviation，RSD）為1.04%～1.52%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，能夠滿足測定要求。

表1 方法加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of standard recovery tests of the method

2.4.4 精密度試驗(yàn)

選取一份加標(biāo)樣品，分別稱取5份樣品進(jìn)行處理，測定5個(gè)平行樣品中的酵母β-葡聚糖，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，日間精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD為2.43%（n=5），表明方法具有良好精密度，能滿足GB/T 27417—2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[27]的要求。

表2 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 2 Results of precision tests of the method (n=5)

2.4.5 實(shí)際樣品檢測

應(yīng)用建立的高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定嬰幼兒配方奶粉中酵母β-葡聚糖含量，選取3份市售不同品牌嬰幼兒配方奶粉樣品進(jìn)行平行測定5次，并與產(chǎn)品標(biāo)簽明示值進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。由表3可知，樣品平行測定5次結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.19%～1.60%（n=5），測試結(jié)果分別為產(chǎn)品標(biāo)簽明示值的108.6%～112.9%、103.6%～106.8%、104.7%～107.9%，均落在產(chǎn)品標(biāo)簽明示值±15%的范圍內(nèi)，判斷為可接受范圍。

表3 實(shí)際樣品測定結(jié)果Table 3 Determination results of actual samples

3 結(jié)論

本研究利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法，建立了適用于嬰幼兒配方奶粉中添加酵母β-葡聚糖的含量的檢測方法。結(jié)果表明，最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2.0 h、溶壁酶添加量500 μL。在10.0～50.0 mg/100 g加標(biāo)水平下，平均回收率在96.9%～102.1%之間；精密度試驗(yàn)結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.43%（n=5）,該方法精密度良好，酵母β-葡聚糖的方法檢出限為3.0 mg/100 g，定量限為10.0 mg/100 g，可用于嬰幼兒配方奶粉中添加的酵母β-葡聚糖檢測。