基于HPLC法同時測定牛心柿汁中5種有機(jī)酸含量

趙 欣，武晉海，牛曉峰

（1.太原學(xué)院 材料與化學(xué)工程系，山西 太原 030032；2.山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，山西 太原 041081；3.太原六味齋實(shí)業(yè)有限公司，山西 太原 030400）

牛心柿，是山西孝義柿子最主要品種，2008年國家農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)“孝義柿子”為農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志產(chǎn)品，是支持當(dāng)?shù)禺a(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要特色農(nóng)產(chǎn)品[1]。牛心柿屬于完全澀柿（pollination constant astringent，PCA），營養(yǎng)價(jià)值高，享有“果中圣品”的美譽(yù)，含有豐富的甘露醇、葡萄糖、果糖、五環(huán)三萜類化合物等成分[2-3]，不僅具有較高的食用價(jià)值，還有抗腫瘤、抗老化、預(yù)防心血管疾病等的重要生理和藥理功效[4-5]。目前，天然營養(yǎng)的果汁飲料發(fā)展極為迅速，而柿果多以柿餅、柿醋、柿酒加工為主，柿汁飲料還較為少見。

有機(jī)酸作為果實(shí)加工制品中風(fēng)味物質(zhì)和營養(yǎng)成分重要的構(gòu)成因素，具有幫助消化、促進(jìn)食欲等功能，有機(jī)酸的組成和含量，是決定加工制品質(zhì)量和品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[6-8]。柿果中有機(jī)酸約占果實(shí)干質(zhì)量的1.26%，主要包括蘋果酸、檸檬酸、奎尼酸等[9]，賦予了柿果特殊的口感，但加工制品柿汁中有機(jī)酸研究較少，準(zhǔn)確測定柿汁中有機(jī)酸種類和含量對把控產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義。有機(jī)酸測定方法較多，常見的方法主要包括酶法[10-11]、毛細(xì)管電泳法[12-14]、離子色譜法[15-17]、氣相色譜法[18-20]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[21-23]等，其中酶法單次測得的有機(jī)酸種類單一，大批樣品檢測耗時較長；毛細(xì)管電泳法可以快速、有效分離有機(jī)酸，但樣品制備能力差，靈敏度較低，電滲會因樣品組成而變化，對分離重現(xiàn)性有影響；氣相色譜法對不易揮發(fā)的有機(jī)酸需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，過程繁瑣，不適宜普遍應(yīng)用；HPLC法是目前分離有機(jī)酸普遍采用的測定方法，具有易于操作、分離效率高、準(zhǔn)確度高和精密度好等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于檢測領(lǐng)域。

果汁中有機(jī)酸成分及含量研究較多，但牛心柿汁中多種有機(jī)酸的定量分析鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以山西孝義產(chǎn)牛心柿為原料，制備牛心柿汁，建立高效液相色譜法同時測定牛心柿汁中5種有機(jī)酸含量，優(yōu)化HPLC色譜條件，并對HPLC法進(jìn)行方法學(xué)考察，以期為牛心柿汁的品質(zhì)監(jiān)控，及后續(xù)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柿果為山西孝義產(chǎn)牛心柿，-18 ℃保存?zhèn)溆茫惶O果酸、奎尼酸、乳酸、乙酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：美國Sigma公司；甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；磷酸、磷酸二氫鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果膠酶（30 000 U/g）、纖維素酶（10 000 U/g）：上海麥克林生化科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜儀（配有四元泵、真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、可變波長紫外檢測器和化學(xué)工作站）：美國安捷倫科技有限公司；KQ-500D型超聲波清洗儀：東莞市科橋超聲波儀器有限公司；TG16-WS型高速離心機(jī)：長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NW150V型超純水系統(tǒng)：上?？道追治鰞x器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；SB10-98循環(huán)水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；WZS-1型阿貝折射儀：山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 濃縮牛心柿汁的制備

1.3.2 樣品預(yù)處理

取適量牛心濃縮柿汁樣品，以10 000 r/min離心15 min，分離沉淀蛋白質(zhì)、果膠等，取上清液2 mL，超純水定容至10 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾，為待測樣品，上機(jī)測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制磷酸鹽緩沖溶液0.01 mol/L KH2PO4，磷酸調(diào)pH至2.7，分別稱取適量蘋果酸、奎尼酸、乳酸、乙酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品，緩沖溶液溶解定容至10 mL，充分搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為2.000 mg/mL、2.000 mg/mL、1.600 mg/mL、2.000 mg/mL、1.600 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4 ℃條件下避光保存?zhèn)溆?。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用磷酸鹽緩沖溶液將其分別稀釋2、5、10、20、50、100倍，得到不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3.4 HPLC色譜條件

色譜柱：AglientTC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A相甲醇與B相0.01 mol/L KH2PO4（磷酸調(diào)pH值至2.7）體積比為1∶99，超聲后用0.45 μm的水相濾膜過濾；流速：0.6 mL/min，等度洗脫；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測器：可變波長紫外檢測器；檢測波長：210 nm。

1.3.5 HPLC色譜條件優(yōu)化

通過改變磷酸鹽緩沖液濃度、流動相比例、流速、柱溫四個變量，對HPLC色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，其中磷酸鹽緩沖液濃度分別為0.01 mol/L、0.02 mol/L、0.03 mol/L（KH2PO4）；甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%；流速分別為0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min；柱溫分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃。

唐玉煙見青辰望著地面眼珠亂轉(zhuǎn)，面上還掛著笑，不知道對方在琢磨些什么。她皺了皺眉，停止了言語。青辰察覺了自己的失態(tài)，尷尬了兩聲，然后道：“你真厲害，一個女孩子，年齡那么小，就能做出這些事，真的很不容易。”

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Adobe Photoshop CS6軟件對圖像進(jìn)行處理，Microsoft Excel 2016軟件和SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，測定數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（X±S）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的確定

分別對蘋果酸、奎尼酸、乳酸、乙酸、檸檬酸5種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明，5種有機(jī)酸在波長210 nm附近均有較大吸收，故選擇210 nm為有機(jī)酸的檢測波長進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 流動相磷酸鹽緩沖液濃度的選擇

有機(jī)酸為弱酸，大部分以離子狀態(tài)存在于水相中呈解離平衡，提高H+濃度有助于使有機(jī)酸以分子狀態(tài)在色譜柱上增加保留時間[24]，因此在流動相中添加磷酸鹽緩沖液可延長保留時間，其中KH2PO4緩沖液作為弱酸電離抑制劑加入流動相中，有利于有機(jī)酸的分離檢測。分別考察0.01mol/L、0.02 mol/L、0.03 mol/L的KH2PO4溶液對分離效果的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，流動相中KH2PO4緩沖液濃度不同時，奎尼酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸各有機(jī)酸峰型較好，均能有效分離。改變KH2PO4緩沖液濃度對各有機(jī)酸分離效果影響不大，但較高濃度的鹽溶液會影響泵和色譜柱的壽命。因此，選擇0.01 mol/L的KH2PO4溶液作為流動相緩沖液。

圖1 不同濃度KH4PO4緩沖液作為流動相有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed organic acid standards with different concentrations of KH2PO4 buffer as mobile phase

2.1.3 流動相甲醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

HPLC的流動相對改善有機(jī)酸的分離效果有重要的輔助作用，選擇適宜的流動相對有機(jī)酸的分離和峰型起著重要作用，流動相中適量加入甲醇，可減弱有機(jī)酸疏水基與固定相之間的相互作用[25]，能夠縮短保留時間，有效改善峰型。分別對流動相中不同體積分?jǐn)?shù)甲醇的有機(jī)酸分離效果進(jìn)行對比，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，出峰時間縮短，流動相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為1%時，各有機(jī)酸分離效果最好；流動相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為2%時，奎尼酸與溶劑峰略有重疊，蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸的分離效果明顯，峰型好；流動相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為3%時，奎尼酸與溶劑峰重疊部分增加，其他有機(jī)酸有較好的分離；流動相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為4%時，奎尼酸與溶劑峰有明顯重疊，且檸檬酸峰型發(fā)生畸變拖尾現(xiàn)象。因此，確定流動相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為1%。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)甲醇作為流動相有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed organic acid standards with different volume fraction of methanol as mobile phase

2.1.4 流動相流速的選擇

分別考察流動相不同流速對有機(jī)酸分離效果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著流速的增加，各有機(jī)酸保留時間縮短，分析時間也相應(yīng)縮短，流速為0.6 mL/min時，各有機(jī)酸分離效果最好，峰型也較好；流速為0.8 mL/min時，各有機(jī)酸保留時間縮短，分析時間縮短，但奎尼酸與溶劑峰略有重疊；流速為1.0 mL/min時，奎尼酸峰型發(fā)生畸變，不能得到很好的分離。因此，選擇0.6 mL/min為流動相的流速。

圖3 不同流速條件下有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of mixed organic acid standards with different flow rates

2.1.5 流動相柱溫的選擇

升高柱溫，可以降低流動相黏度、提高傳質(zhì)效率、加快分析速度、提高分析效率，但柱溫太高不利于有機(jī)酸的分離，會影響色譜柱的使用壽命。分別考察不同柱溫對有機(jī)酸分離效果的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)柱溫為25 ℃時，各有機(jī)酸分離度及峰型較好，柱溫升高至30 ℃和35 ℃時，奎尼酸和溶劑峰發(fā)生重疊，分離效果降低。因此，選擇25 ℃為最佳流動相柱溫。

A：25 ℃；B：30 ℃；C：35 ℃；1.奎尼酸；2.蘋果酸；3.乳酸；4.乙酸；5.檸檬酸。

2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限和定量限

在確定HPLC色譜各優(yōu)化條件下，對不同質(zhì)量濃度的各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，以各有機(jī)酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），各組分的峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，根據(jù)信噪比確定有機(jī)酸組分的檢出限（limit of detection，LOD）信噪比（S/N=3）以及定量限（limit of quantitation，LOQs）信噪比（S/N=10），所得各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍見表1。由表1可知，各有機(jī)酸線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)R2范圍為0.999 0～0.999 7，檢出限為3.03～26.39 μg/mL，定量限為10.00～87.95 μg/mL。

表1 有機(jī)酸組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Standard curve regression equation,correlation coefficients,linear ranges,limit of detection and limit of quantitation of organic acids components

2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

向己知5種有機(jī)酸含量的柿汁樣品中分別加入高、中、低3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2方法處理，平行測定3次，計(jì)算相應(yīng)有機(jī)酸組分加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。由表2可知，5種有機(jī)酸的平均加標(biāo)回收率為90.13%～97.62%，回收率試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.03%～4.70%，均＜5%，說明該方法準(zhǔn)確性良好。

表2 有機(jī)酸組分的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of adding standard recovery tests of organic acids components

續(xù)表

2.4 精密度試驗(yàn)

精確稱取原柿汁樣品6份，按照1.3.2方法處理，測定各有機(jī)酸組分含量，計(jì)算精密度結(jié)果見表3。由表3可知，該方法精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.01%～3.04%，均＜5%，說明該方法精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision tests

2.5 樣品有機(jī)酸含量的測定

通過對HPLC色譜條件的優(yōu)化，對柿汁蘋果酸、奎尼酸、乳酸、乙酸、檸檬酸5種有機(jī)酸同時定量測定，進(jìn)行6組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，30°Bx的真空濃縮汁和常壓濃縮汁，與原汁對比，各有機(jī)酸含量均有不同程度的降低，有機(jī)酸含量變化范圍分別為奎尼酸0.152～0.209 mg/mL、蘋果酸0.129～0.151 mg/mL、乳酸0.030～0.068 mg/mL、乙酸0.239～0.533 mg/mL、檸檬酸0.297～0.326 mg/mL，由于濃縮過程中溫度升高，使得柿汁發(fā)生一系列化學(xué)變化，導(dǎo)致有機(jī)酸減少。其中真空濃縮汁中乳酸、乙酸的含量明顯低于原汁，且差異顯著（P＜0.05），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中，較長時間的加熱使得柿汁中沸點(diǎn)低的乳酸、乙酸較其他有機(jī)酸更易揮發(fā)，損失明顯；常壓濃縮汁中蘋果酸、奎尼酸、乳酸、乙酸、檸檬酸5種有機(jī)酸含量均明顯低于原汁，且差異顯著（P＜0.05），濃縮溫度升高至95 ℃時，雖然濃縮耗時較短，但由于濃縮溫度較高，柿汁中揮發(fā)性酸在高溫作用下迅速揮發(fā)，導(dǎo)致含量明顯降低；常壓濃縮汁中蘋果酸、奎尼酸、乳酸、乙酸含量低于真空濃縮汁，且差異顯著（P＜0.05），常壓濃縮溫度為95 ℃，真空濃縮溫度為55 ℃，由于真空濃縮是在較低溫度下蒸發(fā)，避免了常壓濃縮高溫導(dǎo)致的揮發(fā)性酸迅速揮發(fā)和損失，可見熱濃縮工藝在一定程度上會破壞柿汁的品質(zhì)，降低有機(jī)酸的含量，而真空濃縮優(yōu)于常壓濃縮。

表4 不同濃縮方式柿汁有機(jī)酸含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of organic acid contents in persimmon juice with different concentration methods

3 結(jié)論

本研究通過采用Aglient TC-C18色譜柱為固定相，建立了同時測定牛心柿汁中5種有機(jī)酸的HPLC方法，優(yōu)化后的色譜條件為：紫外檢測器波長210 nm，流動相為甲醇：KH2PO4（0.01 mol/L，pH值2.7）=1∶99（V/V），流速：0.6 mL/min，柱溫：25 ℃，所得各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.999 0～0.999 7，檢出限為3.03～26.39 μg/mL，定量限為10.00～87.95 μg/mL，加標(biāo)回收率為90.13%～97.62%，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD均＜5%，該方法具有準(zhǔn)確度高、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，利用優(yōu)化后的HPLC法，牛心柿汁中5種有機(jī)酸得到良好分離。

濃縮是果汁加工處理的主要方式，起到便于果汁貯藏和運(yùn)輸?shù)淖饔?，但濃縮過程對果汁有機(jī)酸的含量會產(chǎn)生一定影響，通過測定不同濃縮柿汁中5種有機(jī)酸含量，結(jié)果表明，真空濃縮汁和常壓濃縮汁中各有機(jī)酸含量較原汁均有不同程度的降低，含量變化范圍分別為奎尼酸0.152～0.209 mg/mL、蘋果酸0.129～0.151 mg/mL、乳酸0.030～0.068 mg/mL、乙酸0.239～0.533 mg/mL、檸檬酸0.297～0.326 mg/mL，真空濃縮優(yōu)于常壓濃縮處理，有機(jī)酸含量高且差異顯著（P＜0.05）。本研究建立的同時測定牛心柿汁中5種有機(jī)酸含量的方法，為進(jìn)一步研究不同加工方式柿汁有機(jī)酸含量的變化規(guī)律提供技術(shù)支持和參考。